Name: Asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei Hemipilia cucullata z dojrzałych nasion (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj optymalizację protokołów hodowli tkankowej dla zagrożonej orchidei leczniczej Hemipilia cucullata. Osiągnięto 72% kiełkowanie nasion i 44,3% regenerację eksplantatów liściowych, wspierając ochronę gatunku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu należy założyć środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne. Wszystkie procedury należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylność. Z etanolem i podchlorynem sodu należy obchodzić się ostrożnie, a odpady należy utylizować zgodnie z laboratoryjnymi przepisami bezpieczeństwa.
1. Sterylizacja kapsułek i ekstrakcja nasion
<ol>
	<li>Umieścić kapsułkę w zlewce. Dodaj 1-2 krople detergentu i dokładnie spłucz wodą z kranu, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe.</li>
	<li>Myj kapsułkę pod bieżącą wodą przez 5 minut. Wchłonąć wodę powierzchniową za pomocą sterylnego papieru chłonnego.</li>
	<li>Przenieść kapsułkę na sterylny stół warsztatowy w celu dalszej dezynfekcji.</li>
	<li>Zanurz kapsułkę w 75% (v/v) etanolu na 30 s.</li>
	<li>Wysterylizuj kapsułkę, zanurzając ją w 50 ml 20% (v/v) roztworu podchlorynu sodu (rozcieńczonego z dostępnego w handlu wybielacza zawierającego ~5% dostępnego chloru), z dodatkiem 2 kropli nierozcieńczonego domowego detergentu do mycia naczyń na 10-12 min.</li>
	<li>Wypłucz kapsułkę pięć razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości środka dezynfekującego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela usunąć około 1 mm zarówno z wierzchołka, jak i podstawy (końca szypułki) kapsułki.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie na górnym końcu kapsułki, aby odsłonić nasiona. Umieścić kapsułkę na sterylnej szalce Petriego w celu ekstrakcji nasion.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Przygotuj 1/2 MS płynnej pożywki: Użyj połowy stężenia makroskładników odżywczych standardowej pożywki MS, zachowaj wszystkie inne składniki, tak jak w pożywce MS, dodaj 20 g/l sacharozy i α-kwasu naftalenooctowego (NAA, 0,5 mg/L) i dostosuj pH do 5,8.</li>
	<li>Po ugotowaniu natychmiast przelej pożywkę do butelek hodowlanych o pojemności 500 ml (liczbę butelek można dostosować zgodnie z pożądaną skalą rozmnażania).</li>
	<li>Dozowaną pożywkę umieścić w autoklawie i sterylizować w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji wyjmij pożywkę z autoklawu i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
</ol>
3. Kiełkowanie nasion
<ol>
	<li>Użyj sterylnych kleszczy, aby równomiernie rozprowadzić około 500-600 nasion w każdej butelce pożywki (przygotowanej w kroku 2.3). Pozwól nasionom wchłonąć wodę i osiąść na dnie płynnego podłoża.</li>
	<li>Utrzymywać kultury w temperaturze 25 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i natężeniem światła 36 μmol·m-2·s-1.</li>
	<li>Obserwuj kiełkowanie nasion co tydzień, rejestruj zmiany morfologiczne i rób zdjęcia do dokumentacji.</li>
	<li>Po około 12 tygodniach, gdy większość nasion wykiełkuje, policz liczbę kiełkujących nasion i oblicz szybkość kiełkowania. Użyj sterylnej pętli do zaszczepiania, aby losowo zebrać jedną pętlę płynnego podłoża zawierającego nasiona. Przenieść pobrane nasiona na szalkę Petriego lub szkiełko podstawowe i obserwować pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Policz liczbę nasion, które utworzyły protokormy, jako wykiełkowane. Oblicz szybkość kiełkowania za pomocą następującego wzoru: Szybkość kiełkowania (%) = (liczba kiełkujących nasion/całkowita liczba nasion w próbce) × 100.</li>
</ol>
4. Subkultura i proliferacja protokormów
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę proliferacyjną, uzupełniając pożywkę B5 (3,21 g/l) wodą kokosową (100 ml/l), 6-benzyloaminopuryną (BA, 0,5 mg/l) i NAA (0,2 mg/l). Dodać 20 g/l sacharozy i 7,3 g/l agaru i dostosować pH do 5,8.</li>
	<li>Po ugotowaniu natychmiast rozlej pożywkę do butelek hodowlanych o pojemności 150 ml (liczbę butelek można dostosować zgodnie z pożądaną skalą rozmnażania).</li>
	<li>Dozowaną pożywkę umieścić w autoklawie i sterylizować w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Przed użyciem pozostaw podłoże do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przenieść aseptycznie 10-15 kiełkujących protokorm (o wielkości 0,3-1 cm) na butelkę na pożywkę hodowlaną przygotowaną w kroku 4.3.</li>
	<li>Po 5-tygodniowym okresie uprawy oceń stan proliferacji i zapisz liczbę nowo powstałych protokorm w butelce.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę rozmnożonych protokorm przez dodatkowe 4-6 tygodni, aby umożliwić rozwój w sadzonki z widocznym wierzchołkiem pędów i strukturami przypominającymi kizoidy przed przeniesieniem w celu wydłużenia pędów. UWAGA: Utrzymuj kultury w temperaturze 25 °C, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i natężeniem światła 36 μmol·m-2·s-1.</li>
</ol>
5. Wydłużenie pędów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do wydłużenia pędów, uzupełniając pożywkę B5 (3,21 g/L) BA (0,5 mg/L) i NAA (1 mg/L). Dodać 20 g/l sacharozy i 7,3 g/l agaru i dostosować pH do 5,8.</li>
	<li>Po ugotowaniu rozlej pożywkę do butelek hodowlanych o pojemności 150 ml (liczbę butelek można dostosować do pożądanej skali rozmnażania).</li>
	<li>Wybierz zdrowe sadzonki (o wielkości 1-2 cm, bez widocznego czernienia lub całkowitego żółknięcia) w celu wydłużenia pędów. Za pomocą wysterylizowanych i schłodzonych kleszczyków przenieść aseptycznie 8-12 sadzonek do każdej 150 ml butelki hodowlanej zawierającej świeżą pożywkę przygotowaną w kroku 5.1. Upewnij się, że sadzonki są równomiernie rozmieszczone w każdej butelce.</li>
	<li>Po 5-tygodniowym okresie wydłużania pędów wybierz sadzonki z w pełni rozwiniętymi pędami i zdrowymi liśćmi do pobrania próbek z liści. UWAGA: Utrzymuj kultury w temperaturze 25 °C, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i natężeniem światła 36 μmol·m-2·s-1.</li>
</ol>
6. Indukcja PLB z eksplantatów liści
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę indukcyjną PLB, uzupełniając podłoże podstawowe MS (4,43 g/l) BA (3 mg/l) i NAA (0,2 mg/l). Dodać 20 g/l sacharozy i 7,3 g/l agaru i dostosować pH do 5,8.</li>
	<li>Po ugotowaniu rozlej pożywkę do butelek hodowlanych o pojemności 150 ml (liczbę butelek można dostosować do pożądanej skali rozmnażania).</li>
	<li>Wybierz zdrowe sadzonki po 5 tygodniach wydłużania pędów (krok 5.4). Wyciąć w pełni rozwinięte sterylne liście, usunąć obszar wierzchołkowy i marginesy, a następnie pokroić każdy liść na segmenty o długości około 0,5 cm × 0,5 cm za pomocą sterylnego skalpela w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Umieść 10 segmentów liścia na podłożu indukcyjnym PLB z powierzchnią adaksjalną skierowaną do góry, zapewniając pewny kontakt z powierzchnią medium.</li>
	<li>Po 5 tygodniach hodowli oceń liczbę pomyślnie wywołanych PLB i oblicz szybkość indukcji (%). Dodatkowo zapisz średnią wysokość pąków (cm) i liczbę pąków utworzonych na eksplant. UWAGA: Utrzymuj kultury w temperaturze 25 °C, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i natężeniem światła 36 μmol·m-2·s-1.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Flora+of+China%22">Flora of China</a>. , Science Press and Missouri Botanical Garden Press. Beijing, St. Louis, MO. (2009).</li>
<li>Tang, Y., Yukawa, T., Bateman, M., Jiang, H., Peng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+classification+of+the+East+Asia+Amitostigma+alliance+%28Orchidaceae%3A+Orchideae%29+based+on+six+DNA+markers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and classification of the East Asia Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers.</a> BMC Evol Biol. 15 (1), 1-32 (2015).</li>
<li>Minarchenko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threatened+medicinal+plants+of+Ukraine%3A+An+assessment+of+the+current+protection+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Dev%22%5BJournal%5D)">Threatened medicinal plants of Ukraine: An assessment of the current protection status.</a> J Plant Dev. 24, 117-131 (2017).</li>
<li>Pant, B., Raskoti, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPant%2C+B+%22Medicinal+Orchids+of+Nepal%22">Medicinal Orchids of Nepal</a>. , Himalayan Map House Pv Ltd. Kathmandu, Nepal. (2013).</li>
<li>Strack, D., Busch, E., Wray, V., Grotjahn, L., Klein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanid+3oxalylglucoside+in+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Cyanid 3oxalylglucoside in orchids.</a> Naturforsch C. 41 (7-8), 707-711 (1986).</li>
<li>Strack, D., Busch, E., Klein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanin+patterns+in+European+orchids+and+their+taxonomic+and+phylogenetic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Anthocyanin patterns in European orchids and their taxonomic and phylogenetic relevance.</a> Phytochemistry. 28 (8), 2127-2139 (1989).</li>
<li>Ilyina, N., Kozlovskaya, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+population+structure+and+abundance+of+the+rare+species+Neottianthe+cucullata+%28L+Schlechter+under+conditions+of+pyrogenic+load+in+the+territory+adjacent+to+the+Buzuluksky+Bor+National+Park+%28Samara+region%29%5BTitle%5D)+AND+%22Samara+J+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the population structure and abundance of the rare species Neottianthe cucullata (L Schlechter under conditions of pyrogenic load in the territory adjacent to the Buzuluksky Bor National Park (Samara region).</a> Samara J Sci. 13 (2), 35-41 (2024).</li>
<li>Khapugin, A., Chugunov, G., Silaeva, T., Kunaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neottianthe+cucullata+%28L+Schltr.+%28Orchidacea+Juss.%29%2C+an+endangered+orchid+in+central+Russia%5BTitle%5D)+AND+%22Wulfenia%22%5BJournal%5D)">Neottianthe cucullata (L Schltr. (Orchidacea Juss.), an endangered orchid in central Russia.</a> Wulfenia. 23, 189-202 (2016).</li>
<li>A method for the rapid propagation of Hemipilia cucullata. using its floral bracts as explants. China patent. , CN106993535A (2017).</li>
<li>Johnson, D., Edwards, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+orchid+pollinaria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">The structure and function of orchid pollinaria.</a> Plant Syst Evol. 222, 243-269 (2000).</li>
<li>Ilyina, V., Senator, S., Mitroshenkova, A., Kozlovskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peculiarities+of+the+Neottianthe+cucullata+population+structure+under+industrial+loads+%28Samara+Oblast%29%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conf+Proc%22%5BJournal%5D)">Peculiarities of the Neottianthe cucullata population structure under industrial loads (Samara Oblast).</a> AIP Conf Proc. 3184 (1), 8(2024).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+culture+of+three+closely+related+Dendrobium+species+reveals+a+growth+bottleneck+and+differences+in+mycorrhizal+specificity+at+early+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Diversity%22%5BJournal%5D)">Symbiotic culture of three closely related Dendrobium species reveals a growth bottleneck and differences in mycorrhizal specificity at early developmental stages.</a> Diversity. 14 (12), 1119(2022).</li>
<li>Leng, C., Hou, M., Xing, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+and+challenges+of+mycorrhizal+symbiosis+in+orchid+medicinal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Herb+Med%22%5BJournal%5D)">Perspective and challenges of mycorrhizal symbiosis in orchid medicinal plants.</a> Chin Herb Med. 16, 172-179 (2024).</li>
<li>Zoubi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+and+innovations+in+orchid+germination%3A+A+review+of+symbiotic+and+asymbiotic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Complexities and innovations in orchid germination: A review of symbiotic and asymbiotic techniques.</a> J Plant Sci. 12 (4), 90-94 (2024).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+and+asymbiotic+germination+of+Dendrobium+officinale+%28Orchidaceae%29+respond+differently+to+exogenous+gibberellins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Symbiotic and asymbiotic germination of Dendrobium officinale (Orchidaceae) respond differently to exogenous gibberellins.</a> Int J Mol Sci. 21 (17), 6104(2020).</li>
<li>JinYing, C., Xuefeng, W., Baocai, L., Yuqing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germination+system+in+asymbiotic+culture+of+Bletilla+striata+%28Thunb+Reichb%29%5BTitle%5D)+AND+%22f.+Fujian+J+Agric+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient germination system in asymbiotic culture of Bletilla striata (Thunb Reichb).</a> f. Fujian J Agric Sci. 33 (2), 131-135 (2018).</li>
<li>Mei, H., JiJun, K., ZhenYong, X., LiMing, Z., Hong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+seedlings+of+nonsymbiotic+germination+of+Paphiopedilum+wenshanense%5BTitle%5D)+AND+%22J+West+China+For+Sci%22%5BJournal%5D)">Study on seedlings of nonsymbiotic germination of Paphiopedilum wenshanense.</a> J West China For Sci. 49 (3), 56-59 (2020).</li>
<li>Teixeirada Silva, A., Cardoso, J. C., Dobránszki, J., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrobium+micropropagation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dendrobium micropropagation: A review.</a> Plant Cell Rep. 34, 671-704 (2015).</li>
<li>Zeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+biology+and+vitro+seed+germination+of+Cypripedium%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Seed biology and vitro seed germination of Cypripedium.</a> Crit Rev Biotechnol. 34 (4), 358-371 (2014).</li>
<li>Cozzolino, S., Widmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+diversity%3A+An+evolutionary+consequence+of+deception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Orchid diversity: An evolutionary consequence of deception.</a> Trends Ecol Evol. 20 (9), 487-494 (2005).</li>
<li>Miura, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoactivation+of+mycorrhizal+symbiosis+signaling+through+gibberellin+deactivation+in+orchid+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoactivation of mycorrhizal symbiosis signaling through gibberellin deactivation in orchid seed germination.</a> Plant Physiol. 194 (1), 546-563 (2023).</li>
<li>Bustam, B., Dixon, K., Bunn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vitro+propagation+of+temperate+Australian+terrestrial+orchids%3A+Revisiting+asymbiotic+compared+with+symbiotic+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Bot+J+Linn+Soc%22%5BJournal%5D)">vitro propagation of temperate Australian terrestrial orchids: Revisiting asymbiotic compared with symbiotic germination.</a> Bot J Linn Soc. 176 (4), 556-566 (2014).</li>
<li>Gogoi, K., Kumaria, S., Tandon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+situ+conservation+of+Cymbidium+eburneum+Lindl.%3A+a+threatened+and+vulnerable+orchid%2C+by+asymbiotic+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Ex situ conservation of Cymbidium eburneum Lindl.: a threatened and vulnerable orchid, by asymbiotic seed germination.</a> 3 Biotech. 2, 337-343 (2012).</li>
<li>Robinson, E. J., Kakati, J. P., Sebastinraj, S., Suriya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+vitro+seed+germination+of+Cymbidium+aloifolium+L+Sw.%2C+a+potential+medicinal+orchid+from+Eastern+ghats+of+Tamil+Nadu+India%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">I vitro seed germination of Cymbidium aloifolium L Sw., a potential medicinal orchid from Eastern ghats of Tamil Nadu India.</a> J Plant Biotechnol. 44, 343-348 (2017).</li>
<li>Hossain, M., Sharma, M., Teixeirada Silva, J. A., Pathak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+germination+and+tissue+culture+of+Cymbidium+giganteum+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22Lindl.+Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall.</a> Lindl. Sci Hortic. 123 (4), 479-487 (2010).</li>
<li>Ibrahim, L., Jenkinson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+artificial+culture+media+on+germination%2C+growth%2C+virulence+and+surface+properties+of+the+entomopathogenic+hyphomycete+Metarhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycol+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae.</a> Mycol Res. 106 (6), 705-715 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kapsułki orchidei zazwyczaj zawierają liczne nasiona, często przekraczające dziesięć tysięcy, ale ich naturalne kiełkowanie jest niezwykle ograniczone ze względu na brak bielma i ich dużą zależność od symbiotycznych związków grzybów i specyficznych sygnałów środowiskowych20. Asymbiotyczne protokoły kiełkowania zostały zatem szeroko przyjęte, aby ominąć te ograniczenia i umożliwić wydajne rozmnażanie sadzonek w kontrolowanych warunkach. Na przykład Chen i wsp.15 odnotowali w...

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, powszechnie znana jako cucullate neottianthe orchid, jest dziką lądową orchideą pochodzącą z umiarkowanej Eurazji i jest szeroko rozpowszechniona od Polski po Japonię1. Początkowo sklasyfikowany w rodzaju Neottianthe, gatunek ten został niedawno przeniesiony do rodzaju Hemipilia, sekcja Neottianthe, na podstawie dowodów molekularnych2. Roślina wyrasta z podziemnych bulw i osiąga do 30 cm wysokości, wytwarzając różowawe lub fioletowo-czerwone kwiaty ułożone w jednostronny kłos. Ze względu na elegancki kształt i atrakcyjne ubarwienie kwiatów posiada znaczną wartość ozdobną. Dodatkowo, cała roślina jest uznawana za zioło lecznicze w wielu krajach, gdzie jest szeroko stosowana do różnych celów terapeutycznych, w tym do leczenia chorób serca, poprawy krążenia krwi, łagodzenia siniaków i wspomagania gojenia się złamań 3,4. Ostatnie badania fitochemiczne zidentyfikowały kilka antocyjanów w tym gatunku, takich jak cyjanidyna, 3-oksaliloglukozyd, chryzantema i cyjanina, które mają właściwości przeciwutleniające i wazoprotekcyjne oraz mogą przyczyniać się do ich działania leczniczego 5,6.
Obecnie dzikie populacje H. cucullata stoją w obliczu zagrożeń związanych z utratą siedlisk i zakłóceniami środowiskowymi, co prowadzi do poważnego spadku populacji, a na niektórych obszarach zbliża gatunek do wyginięcia 3,7,8. Ochrona tego gatunku jest jednak szczególnie trudna ze względu na trudności w jego naturalnym rozmnażaniu. W naturze H. cucullata rozmnaża się zarówno klonalnie, jak i płciowo, ale oba tryby są nieefektywne. Naturalne rozmnażanie klonalne jest powolne i rzadkie, podczas gdy rozmnażanie płciowe jest ograniczone przez słabe wyniki zapylania i niską żywotność nasion 9,10. Co więcej, badania terenowe ujawniły wyraźnie niezrównoważoną strukturę wiekową, z niedoborem młodocianych osobników i ograniczoną naturalną rekrutacją, zwłaszcza w warunkach stresu antropogenicznego lub pirogennego 7,8,11. Nasiona H. cucullata, podobnie jak wiele storczyków, są drobne, pozbawione bielma i wymagają określonych partnerów grzybowych do kiełkowania, co dodatkowo komplikuje naturalną regenerację. W rezultacie, pomimo szerokiego zasięgu geograficznego, liczebność populacji i struktura wiekowa dzikich populacji maleją, a lokalne ryzyko wyginięcia wzrasta7. Dlatego ustanowienie skutecznej metody sztucznego szybkiego rozmnażania ma zasadnicze znaczenie zarówno dla zachowania zasobów plazmy rozrodczej, jak i dla zrównoważonego wykorzystania tego gatunku storczyków.
Wśród dostępnych technik rozmnażania, kiełkowanie symbiotyczne – polegające na połączeniu z grzybami mikoryzowymi storczyków – może ściśle symulować naturalne procesy, ale często jest trudne do standaryzacji ze względu na zależność od specyficznych dla gatunku partnerów grzybowych 12,13,14. Natomiast kiełkowanie asymbiotyczne stanowi prostszą i bardziej powtarzalną alternatywę, która jest szeroko stosowana w systemach hodowli tkankowych storczyków15. Chociaż protokoły asymbiotycznego kiełkowania i szybkiego rozmnażania zostały opracowane dla kilku storczyków leczniczych, takich jak Bletilla, Dendrobium i Cypripedium 16,17,18,19, nadal wymagana jest specyficzna dla gatunku optymalizacja pożywek hodowlanych i warunków hodowli tkankowej dla H. cucullata.
W tym badaniu wykorzystaliśmy dojrzałe nasiona H. cucullata uzyskane w wyniku ręcznego zapylenia krzyżowego dzikich osobników (ryc. 1A) na górze Tianmu we wschodnich Chinach (30°20′ N, 119°22′ E) w celu ustalenia i optymalizacji skutecznego protokołu kiełkowania nasion asymbiotycznych, rozwoju siewek i wydłużania pędów. Dodatkowo opracowaliśmy system regeneracji z eksplantatów liści poprzez indukcję PLB, przyczyniając się w ten sposób do ochrony i uprawy tej zagrożonej leczniczej orchidei.

<table><tbody><tr><td>1/2 MS soli zasadowych z witaminami</td><td>Chłodnica</td><td>Pył zawieszony PM1061</td><td></td></tr><tr><td>6-benzyloaminopuryna</td><td>Szanghaj Macklin Technologia Biochemiczna Co., Ltd.</td><td>1214-39-7</td><td></td></tr><tr><td>Moc agaru</td><td>Beijing Chembase Technology Co., Sp. z o.o.</td><td>1400</td><td></td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Sprzęt do oczyszczania Suzhou Co., Ltd.</td><td>SW-CJ-2G</td><td></td></tr><tr><td>Woda kokosowa</td><td>DOBRY ROLNIK</td><td></td><td>https://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs</td></tr><tr><td>Detergent</td><td>Nauka i technologia Liby</td><td>6920174756784</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5 Średni</td><td>Laboratoria FitoTechnologiczne</td><td>Zobacz materiał G398</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka</td><td>Morebetter Biotechnology Co., Sp. z o.o.</td><td>MBT-BL-240</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Sól bazalna Skoog</td><td>Laboratoria FitoTechnologiczne</td><td>Zobacz materiał M519</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3123000268</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>30834109</td><td></td></tr><tr><td>SPSS</td><td>Międzynarodowa korporacja maszyn biznesowych</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do badania istotności statystycznej</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sinopharm chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210802</td><td></td></tr><tr><td>Thidiazuron powiedział:</td><td>Szanghaj Macklin Technologia Biochemiczna Co., Ltd.</td><td>51707-55-2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas alfa;-naftalenooctowy</td><td>Szanghaj Macklin Technologia Biochemiczna Co., Ltd.</td><td>86-87-3</td><td></td></tr></tbody></table>

asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei hemipilia cucullata z dojrzałych nasion

Asymbiotic Germination and Leaf Explant-Based Regeneration of the Endangered Medicinal Orchid Hemipilia cucullata from Mature Seeds

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) to storczyk lądowy powszechnie ceniony ze względu na swoje właściwości lecznicze i atrakcyjność ozdobną, jednak jego dzikie populacje są zagrożone z powodu degradacji siedlisk, niskiej żywotności nasion i ograniczonego sukcesu zapylania. Aby wesprzeć jego ochronę i zrównoważone wykorzystanie, w ramach tego badania opracowano zoptymalizowany protokół asymbiotycznego kiełkowania dojrzałych nasion, rozwoju protokormu, wydłużania pędów i indukcji ciał podobnych do protokormu (PLB) ze sterylnych eksplantatów liści. Nasiona wyhodowane w płynnym pożywce 1/2 MS uzupełnionej 0,5 mg/l NAA wykazały zdolność kiełkowania 72 ± 6%, znacznie wyższą niż pożywka kontrolna (46%) i stała (31%), przy czym kiełkowanie rozpoczęło się około 21 dni wcześniej w kulturze płynnej. Protokormy hodowano na pożywce B5 zawierającej 0,5 mg/l BA, 0,2 mg/l NAA i 100 ml/l wody kokosowej, co prowadziło do efektywnej proliferacji. Po 5-6 tygodniach sadzonki przeniesiono na pożywkę wydłużającą pędy (B5 uzupełnioną 0,5 mg/L BA i 1 mg/L NAA), gdzie wykazywały silne wydłużenie pędów i zdrowe tworzenie liści. W przypadku indukcji PLB najwyższy wskaźnik indukcji (44,3 ± 5,1%) osiągnięto na pożywce MS zawierającej BA (3 mg/L) i NAA (0,2 mg/L). Ten kompleksowy i powtarzalny protokół może stanowić skuteczną platformę dla rozmnażania na dużą skalę i ochrony ex situ H. cucullata, oferując cenne wsparcie dla wysiłków na rzecz odbudowy tej zagrożonej wyginięciem orchidei.

Kroki protokołu przedstawione w tym badaniu reprezentują zoptymalizowaną metodologię opracowaną w wyniku serii eksperymentów porównawczych mających na celu poprawę kiełkowania nasion asymbiotycznych, proliferacji protokorm, wydłużania pędów i indukcji PLB u H. cucullata. Na przykład, w doborze PGR w celu promowania kiełkowania nasion, NAA wspomaga rozwój zarodków i pobieranie wody, podczas gdy BA wspomaga różnicowanie pąków i podział komórek. Wykazano, że ich synergiczne działanie poprawia zdolność kiełkowania i...

W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizujący kiełkowanie nasion asymbiotycznych, rozwój siewek i wydłużanie pędów u Hemipilia cucullata. Protokół umożliwia również indukcję ciał podobnych do protokorm ze sterylnych eksplantatów liści, ułatwiając skuteczne rozmnażanie in vitro w celu ochrony i zrównoważonego wykorzystania tej zagrożonej leczniczej orchidei.

Asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei Hemipilia cucullata z dojrzałych nasion

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) is a terrestrial orchid widely valued for its medicinal properties and ornamental appeal, yet its wild populations are ...

Moje badania koncentrują się na optymalizacji protokołów hodowli tkankowych dla zagrożonych storczyków w celu poprawy ochrony, rozmnażania na dużą skalę i zrównoważonego wykorzystania tych cennych roślin leczniczych. Głównym wyzwaniem jest osiągnięcie spójnego tempa kiełkowania i regeneracji wszystkich gatunków storczyków, ponieważ każdy z nich wymaga optymalizacji pożywek specyficznych dla danego gatunku i precyzyjnej kontroli warunków wzrostu. Opracowaliśmy skuteczne protokoły hodowli tkankowej dla wielu zagrożonych roślin, umożliwiając odbudowę gatunków i wspierając rekonstrukcję w naturalne siedliska.Nie istnieje wydajny system powtarzalnych hodowli tkankowych dla Hemipilia cucullata, który zajmowałby się rozmnażaniem, odtwarzaniem i konserwacją. Storczyki lądowe często potrzebują specyficznych grzybów symbiotycznych, których izolacja i identyfikacja są złożone. Metoda symbiotyczna upraszcza rozmnażanie i omija te etapy.Nasz praktyczny umożliwia wysokie kiełkowanie i szybką regenerację roślin ze stanów dojrzałych, eliminując zależność od grzybów i oferując szybsze, bardziej niezawodne podejście do rozmnażania Hemipilia cucullata. Na początek umieść kapsułkę w zlewce. Dodaj jedną lub dwie krople detergentu do zlewki w celu spłukania.Myj kapsułkę pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Następnie za pomocą sterylnego bibułu chłonnego usuń pozostałą wodę powierzchniową z kapsułki. Teraz zanurz kapsułkę w 75% etanolu na 30 sekund.Wysterylizuj kapsułkę, zanurzając ją w 50 mililitrach 20% roztworu podchlorynu sodu zawierającego około 5% dostępnego chloru. Następnie dodaj dwie krople nierozcieńczonego domowego detergentu do mycia naczyń do roztworu i inkubuj kapsułkę przez 10 do 12 minut. Przepłukać kapsułkę pięć razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości środka dezynfekującego.Następnie za pomocą sterylnego skalpela usuń około jednego milimetra zarówno z wierzchołka, jak i końca szypułki kapsułki. Wykonaj małe nacięcie na górnym końcu kapsułki, aby odsłonić nasiona i zbierz je na sterylnej szalce Petriego. Za pomocą sterylnych kleszczy równomiernie rozprowadź około 500 do 600 nasion w każdej butelce hodowlanej zawierającej przygotowane podłoże.Pozwól nasionom wchłonąć wodę i osiądź na dnie płynnego podłoża. Utrzymuj kultury w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności oraz natężeniem światła 36 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Obserwuj kiełkowanie nasion co tydzień.Rejestruj wszelkie widoczne zmiany morfologiczne i fotografuj kultury w celu dokumentacji. Wybierz zdrowe sadzonki o wielkości od jednego do dwóch centymetrów bez widocznego czernienia lub całkowitego żółknięcia w celu wydłużenia pędów. Za pomocą wysterylizowanych i schłodzonych kleszczyków aseptycznie przenieś 8-12 sadzonek do każdej butelki zawierającej świeżo przygotowane podłoże do wydłużania pędów.Równomiernie rozprowadź sadzonki w każdej butelce. Po pięciu tygodniach wydłużania pędów wybierz sadzonki z w pełni rozwiniętymi pędami i zdrowymi liśćmi do pobrania próbek z liści. Wytnij w pełni ekspandowane sterylne liście ze zdrowej sadzonki za pomocą sterylnego skalpela.Usuń obszar wierzchołkowy i brzegi liści. Następnie pokrój każdy liść na segmenty o wymiarach około 0,5 na 0,5 centymetra za pomocą sterylnego skalpela w aseptycznych warunkach. Umieść 10 segmentów liścia na podłożu indukcyjnym PLB powierzchnią adaksjalną skierowaną do góry.Upewnij się, że każdy segment mocno dotyka podłoża. Następnie hoduj je przez pięć tygodni. Na koniec oceń liczbę pomyślnie wywołanych PLB i oblicz współczynnik indukcji w procentach.Zapisz średnią wysokość pąków w centymetrach i policz liczbę pąków utworzonych na eksplant. Kiełkowanie nasion w płynnym podłożu charakteryzowało się widocznie pojawieniem się zielonych zarodków z okrywy nasiennej po około 60 dniach, które następnie utworzyły kuliste protokormy w ciągu 80 do 85 dni. Najwyższą zdolność kiełkowania wynoszącą 72% osiągnięto w płynnym podłożu uzupełnionym 0,5 miligrama na litr NAA.Pożywka B5 zawierająca 0,5 miligrama na litr benzyladeniny i 0,2 miligrama na litr NAA dała najwyższy wskaźnik proliferacji protokormów, wynoszący średnio 5,3 nowo utworzonych protokorm na eksplant. Protokormy hodowane na pożywce B5 ze zoptymalizowaną kombinacją regulatorów wzrostu wykazywały energiczny wzrost i zdrową zieloną pigmentację, przewyższając te uprawiane na pożywce MS w tych samych warunkach. Największą liczbę gałęzi na sadzonkę, średnio cztery, zaobserwowano przy jednym miligramie na litr każdej benzyladeniny i NAA, a tuż za nią uplasowała się sama NAA na poziomie 0,5 miligrama na litr.Wydłużenie pędów zostało najbardziej wzmocnione dzięki połączeniu 0,5 miligrama na litr benzyladeniny i jednego miligrama na litr NAA, co dało średnią wysokość sadzonki wynoszącą 4,8 centymetra. Najwyższy współczynnik indukcji ciał podobnych do protokormu 44,3% osiągnięto przy użyciu trzech miligramów na litr benzyladeniny z 0,2 miligrama na litr NAA.

asymbiotic-germination-leaf-explant-based-regeneration-endangered

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano skuteczną metodę przeszczepiania tkanek o określonym i powtarzalnym rozmiarze pomiędzy planariami. Uwzględniono również opis tego, w jaki sposób technikę unieruchamiania stosowaną podczas transplantacji można zaadaptować, przy użyciu osłon ołowianych, do częściowego napromieniowania żywych zwierząt.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis).  Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku.  Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Pędy przybyszowe mogą być indukowane na międzywęzłowych segmentach ipecac bez leczenia fitohormonami. Aby ocenić dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych, zmierzyliśmy endogenną auksynę i cytokininę w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Artykuł opisuje protokół ratowania zarodków do regeneracji niedojrzałych zarodków pochodzących z międzygatunkowej hybrydyzacji Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Protokół może być łatwo zduplikowany i będzie ważnym zasobem dla programów hodowli squasha.

Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

Poznaj optymalizację protokołów hodowli tkankowej dla zagrożonej orchidei leczniczej Hemipilia cucullata. Osiągnięto 72% kiełkowanie nasion i 44,3% regenerację eksplantatów liściowych, wspierając ochronę gatunku.

Asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei Hemipilia cucullata z dojrzałych nasion (Wideo) | JoVE Journal

Asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei Hemipilia cucullata z dojrzałych nasion

Przeglądaj więcej filmów