Asymbiotyczne kiełkowanie i regeneracja eksplantatyczna liści zagrożonej leczniczej orchidei Hemipilia cucullata z dojrzałych nasion

Moje badania koncentrują się na optymalizacji protokołów hodowli tkankowych dla zagrożonych storczyków w celu poprawy ochrony, rozmnażania na dużą skalę i zrównoważonego wykorzystania tych cennych roślin leczniczych. Głównym wyzwaniem jest osiągnięcie spójnego tempa kiełkowania i regeneracji wszystkich gatunków storczyków, ponieważ każdy z nich wymaga optymalizacji pożywek specyficznych dla danego gatunku i precyzyjnej kontroli warunków wzrostu. Opracowaliśmy skuteczne protokoły hodowli tkankowej dla wielu zagrożonych roślin, umożliwiając odbudowę gatunków i wspierając rekonstrukcję w naturalne siedliska.

Nie istnieje wydajny system powtarzalnych hodowli tkankowych dla Hemipilia cucullata, który zajmowałby się rozmnażaniem, odtwarzaniem i konserwacją. Storczyki lądowe często potrzebują specyficznych grzybów symbiotycznych, których izolacja i identyfikacja są złożone. Metoda symbiotyczna upraszcza rozmnażanie i omija te etapy.

Nasz praktyczny umożliwia wysokie kiełkowanie i szybką regenerację roślin ze stanów dojrzałych, eliminując zależność od grzybów i oferując szybsze, bardziej niezawodne podejście do rozmnażania Hemipilia cucullata. Na początek umieść kapsułkę w zlewce. Dodaj jedną lub dwie krople detergentu do zlewki w celu spłukania.

Myj kapsułkę pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Następnie za pomocą sterylnego bibułu chłonnego usuń pozostałą wodę powierzchniową z kapsułki. Teraz zanurz kapsułkę w 75% etanolu na 30 sekund.

Wysterylizuj kapsułkę, zanurzając ją w 50 mililitrach 20% roztworu podchlorynu sodu zawierającego około 5% dostępnego chloru. Następnie dodaj dwie krople nierozcieńczonego domowego detergentu do mycia naczyń do roztworu i inkubuj kapsułkę przez 10 do 12 minut. Przepłukać kapsułkę pięć razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości środka dezynfekującego.

Następnie za pomocą sterylnego skalpela usuń około jednego milimetra zarówno z wierzchołka, jak i końca szypułki kapsułki. Wykonaj małe nacięcie na górnym końcu kapsułki, aby odsłonić nasiona i zbierz je na sterylnej szalce Petriego. Za pomocą sterylnych kleszczy równomiernie rozprowadź około 500 do 600 nasion w każdej butelce hodowlanej zawierającej przygotowane podłoże.

Pozwól nasionom wchłonąć wodę i osiądź na dnie płynnego podłoża. Utrzymuj kultury w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności oraz natężeniem światła 36 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Obserwuj kiełkowanie nasion co tydzień.

Rejestruj wszelkie widoczne zmiany morfologiczne i fotografuj kultury w celu dokumentacji. Wybierz zdrowe sadzonki o wielkości od jednego do dwóch centymetrów bez widocznego czernienia lub całkowitego żółknięcia w celu wydłużenia pędów. Za pomocą wysterylizowanych i schłodzonych kleszczyków aseptycznie przenieś 8-12 sadzonek do każdej butelki zawierającej świeżo przygotowane podłoże do wydłużania pędów.

Równomiernie rozprowadź sadzonki w każdej butelce. Po pięciu tygodniach wydłużania pędów wybierz sadzonki z w pełni rozwiniętymi pędami i zdrowymi liśćmi do pobrania próbek z liści. Wytnij w pełni ekspandowane sterylne liście ze zdrowej sadzonki za pomocą sterylnego skalpela.

Usuń obszar wierzchołkowy i brzegi liści. Następnie pokrój każdy liść na segmenty o wymiarach około 0,5 na 0,5 centymetra za pomocą sterylnego skalpela w aseptycznych warunkach. Umieść 10 segmentów liścia na podłożu indukcyjnym PLB powierzchnią adaksjalną skierowaną do góry.

Upewnij się, że każdy segment mocno dotyka podłoża. Następnie hoduj je przez pięć tygodni. Na koniec oceń liczbę pomyślnie wywołanych PLB i oblicz współczynnik indukcji w procentach.

Zapisz średnią wysokość pąków w centymetrach i policz liczbę pąków utworzonych na eksplant. Kiełkowanie nasion w płynnym podłożu charakteryzowało się widocznie pojawieniem się zielonych zarodków z okrywy nasiennej po około 60 dniach, które następnie utworzyły kuliste protokormy w ciągu 80 do 85 dni. Najwyższą zdolność kiełkowania wynoszącą 72% osiągnięto w płynnym podłożu uzupełnionym 0,5 miligrama na litr NAA.

Pożywka B5 zawierająca 0,5 miligrama na litr benzyladeniny i 0,2 miligrama na litr NAA dała najwyższy wskaźnik proliferacji protokormów, wynoszący średnio 5,3 nowo utworzonych protokorm na eksplant. Protokormy hodowane na pożywce B5 ze zoptymalizowaną kombinacją regulatorów wzrostu wykazywały energiczny wzrost i zdrową zieloną pigmentację, przewyższając te uprawiane na pożywce MS w tych samych warunkach. Największą liczbę gałęzi na sadzonkę, średnio cztery, zaobserwowano przy jednym miligramie na litr każdej benzyladeniny i NAA, a tuż za nią uplasowała się sama NAA na poziomie 0,5 miligrama na litr.

Wydłużenie pędów zostało najbardziej wzmocnione dzięki połączeniu 0,5 miligrama na litr benzyladeniny i jednego miligrama na litr NAA, co dało średnią wysokość sadzonki wynoszącą 4,8 centymetra. Najwyższy współczynnik indukcji ciał podobnych do protokormu 44,3% osiągnięto przy użyciu trzech miligramów na litr benzyladeniny z 0,2 miligrama na litr NAA.