Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Nasze badania dotyczą mejozy roślin, mające na celu odkrycie mechanizmów molekularnych kierujących rozpoznawaniem, ustawieniem i parowaniem chromosomów homologicznych podczas progresji mejotycznej. Wyzwaniem jest wizualizacja ruchu chromosomów w profilach mejotycznych, co wymaga żywego obrazowania tkanek o wysokiej rozdzielczości i szybkości do śledzenia trajektorii. Na początek usuń ochronną folię z dystansu z jednej strony i umieść ją na środku szklanej prowadnicy.

Następnie usuń drugą folię ochronną. Włóż osiem mikrolitrów wody z kranu do środka dystansu. Za pomocą kleszczy zerwij kwiatostan z jednego z głównych łodyg.

Umieść kwiatostan na nowym szkiełku umieszczonym pod mikroskopem stereo wyposażonym w linijkę. Wybierz pąki kwiatowe o długości około 0,5 milimetra. Używając ostrych igieł, delikatnie rozchylaj pąki, rozdzielając działki i płatki, aby zatrzymać tylko pylniki.

Delikatnie przełóż pęczki do wody w wnęce dystansowej natychmiast po usunięciu działka i płatków, aby zapobiec odwodnieniu. Umieść kilka pęków pylników wewnątrz komory dystansowej. Aby przykryć zlewkę pokrywą, unikając jednocześnie pęcherzyków powietrza, dodaj osiem mikrolitrów wody na pokrywę.

Następnie ostrożnie odwróć pokrywę z kroplą wody skierowaną do wnęki dystansu. Upewnij się, że pęki są zanurzone w łącznej ilości 16 mikrolitrów wody oraz że pokrywa dobrze przylega do dystansu. Ustawiłem mikroskop poprzez wzbudzenie GFP na 488 nanometrów i detekcję za pomocą hybrydowego detektora o średnicy od 494 nanometrów do 547 nanometrów.

Następnie zlokalizuj pylnik za pomocą oświetlenia jasnego pola. Za pomocą kanału brightfield określ etap mejotyczny na podstawie kształtu komórek. Wizualizuj przeciwnik w oprogramowaniu i użyj sygnału RFP jako dodatkowego wskaźnika etapu mejotycznego komórek.

Aby wykonać ciągłe akwizycje, ustaw interwał czasu na zero w sekcji czasu. Następnie użyj modułu spot, aby automatycznie śledzić spoty. Wybierz zielony kanał źródłowy i ustaw średnicę XY na jeden mikrometr dla centromery oznaczonej GFPCENH3.

Następnie modyfikuj jakość detekcji na podstawie natężenia sygnału, korzystając z wykresu na dole okna sterowania. Użyj algorytmu automatycznego regresywnego śledzenia ruchu do śledzenia trajektorii centromerów i wizualizacji wszystkich trajektorii, aby łatwo odróżnić mejocyty od tkanek somatycznych. Następnie użyj modułu punktowego do śledzenia plam w czasie na wybranym jądrze.

Zdefiniuj obszar zainteresowania, wybierając segment opcji tylko jako obszar zainteresowania i wykonuj śledzenie punktowe w jego obrębie. Wybierz obszar zainteresowania, który prawidłowo obejmuje jądro we wszystkich trzech wymiarach i w czasie. W wykresie linii genealogii użyj przeglądarki 3D oprogramowania do wizualizacji wszystkich trajektorii.

Usuń trajektorie poza analizowanym meiocytem, wybierając je i naciskając delete na klawiaturze. W trybie edycji usuń lub dodaj obiekt, upewniając się, że obiekt jest dodany na właściwej płaszczyźnie. W trybie edycji ścieżek ręcznie połącz nowe obiekty na wykresie linii po dokładnej analizie komórki w 3D.

Oblicz natychmiastową prędkość na każdym kroku czasowym, aby monitorować zmiany prędkości ruchu w czasie. Oblicz kąt skrętu jako zmianę kierunku ruchu pomiędzy kolejnymi krokami czasowymi, aby odsłonić wzorce trajektorii. Przechowuj wynik wraz z natychmiastową prędkością.

Oblicz współczynnik zasięgu za pomocą cell trackera, aby zmierzyć, jak daleko przesuwa się obiekt śledzony względem swojej pozycji wyjściowej, co wskazuje na zachowanie eksploracyjne. Oblicz średnią prędkość dla każdego toru, aby podsumować charakterystyki ruchu w okresie obserwacji. Oblicz średni kąt skrętu na tor, aby przeanalizować ruch, kierunkowość i wzorce zachowań oraz zapisać wynik.

Następnie oblicz rozmiar centroidu w każdym kroku czasowym, aby zmierzyć przestrzenną dyspersję centromerów wokół ich średniej pozycji. Wykorzystaj zmiany rozmiaru centroidów w czasie do oceny globalnej spójności między torami centromerów i zapisuj wynik. Oblicz korelację prędkości krzyżowej, aby analizować zależności między dynamiką ruchu różnych śledzonych obiektów, ujawniając potencjalne skoordynowane zachowania.

Następnie oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe dla każdego toru, aby określić średnią kwadratową odległość pokonaną przez centromery w danym przedziale czasowym. Centromery mejotyczne wykazywały znacząco wyższą średnią prędkość 109,35 nanometrów na sekundę w porównaniu z centromerami somatycznymi. Centromery mejotyczne wykazywały szerszy zakres i wyższy wskaźnik normalizowanego zasięgu w porównaniu do centromerow somatycznych.

Rozkład kątów skrętu różnił się między centromerami mejotycznymi a somatycznymi. Średnie kwadratowe przemieszczenie centromerów mejotycznych rosło z czasem, podczas gdy centromery somatyczne pozostawały w dużej mierze statyczne. Protokół ten umożliwił pierwszą ilościową identyfikację ruchu chromosomu mejotycznego w Arabidopsis, ujawniając dramatyczną dynamikę centromerów w stadium zygotenowym i pachytenowem.

Protokół ten umożliwia badanie ruchów regionów genomowych podczas profazy mejotycznej i może być adaptowany do zastosowań u innych gatunków roślin. Prace te umożliwiają badanie interakcji ruchów chromosomów i rekombinacji, pogłębiając zrozumienie mechanizmów napędzających różnorodność genetyczną podczas tworzenia gamet roślinnych.