Name: Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Odkryj metodę obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościową analizę dynamiki chromosomów w komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te korzystały ze wsparcia technologicznych platform technologicznych Obserwatorium Roślin Instytutu Jeana-Pierre'a Bourgina, PO-Plants oraz PO-Cyto. Badania te zostały sfinansowane przez ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042: M.G., P.A., L.C., S.L. oraz DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). Instytut Jean-Pierre Bourgin korzysta ze wsparcia Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

Protokół ten wykorzystuje transgeniczne rośliny A. thaliana wyrażające transgeny GFP-CENH3 i NUP54-RFP 9,10. Marker CENH3 pozwala śledzić ruchy centromerów. Marker NUP54 oznacza pory jądrowe, co pomaga w rozróżnieniu jądra. Można stosować inne markery, ale muszą one być odporne na fotobielenie, ponieważ próbka jest nieprzerwanie oświetlana. Aby upewnić się, że marker nie ulega fotobieleniu, przeprowadź eksperyment w tych samych warunkach laserowych i parametrach akwizycji oraz sprawdź, czy sygnał pozostaje stabilny przez cały czas akwizycji. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wzrost i hodowla roślin

<ol>
	<li>Wysiewaj nasiona bezpośrednio do doniczek w szklarni.</li>
	<li>Umieść doniczki w szklarni w następujących warunkach: 16 godzin dziennie/8 godzin w nocy, 20 °C, 70% wilgotności.</li>
	<li>Pozwól roślinom rozwijać się w szklarni przez około 4 tygodnie. Rośliny muszą osiągnąć etap, w którym mają 5/6 łodyg kwiatowych (patrz Rysunek 1A).</li>
</ol>

2. Rozcinanie pylników i przygotowanie preparatów

<ol>
	<li>Przygotuj szkiełko, umieść dystans (klej dwustronny z perforacją o średnicy 9 mm, głębokość 0,12 mm) na jego środku, uważając na usunięcie folii ochronnych po obu stronach. Ta dystans będzie trzymać próbkę i tworzy przestrzeń między szkiełkiem a osłoną.</li>
	<li>Włóż 8 μL wody z kranu do środka dystansu.</li>
	<li>Używając kleszczy, zerwij kwiatostan z jednego z głównych łodyg (patrz Rysunek 1B) (nie używaj małych kwiatostanów z wyłaniających się łodyg).</li>
	<li>Umieść kwiatostan na nowym szkiełku pod stereomikroskopem wyposażonym w linijkę. Wybierz pąki kwiatowe o długości około 0,5 mm (rysunek 1C).</li>
	<li>Używając ostrych igieł, delikatnie rozchylaj pąki, rozrywając działki i płatki, aby zatrzymać tylko pylniki. Uważaj, by nie uszkodzić pylników ani pozwolić im wyschnąć.</li>
	<li>Delikatnie przenieś pęki pylnika do wody w wnęce dystansowej. Aby uniknąć odwodnienia, rób to natychmiast po usunięciu działka i płatków.</li>
	<li>Umieść kilka pęków pylników wewnątrz komory dystansowej.</li>
	<li>Przykryj zjeżdżalnię pokrywką, unikając pęcherzyków powietrza. Aby to zrobić, dodaj 8 μL wody na pokrywę i ostrożnie obróć pokrywę, kapką wody na komorę dystansową. Upewnij się, że pęczki pylników są zanurzone w łącznej ilości 16 μL wody, a pokrywa jest dobrze przyklejona do dystansu (patrz Rysunek 1D; Rysunek 2).</li>
</ol>

3. Obserwacja poklatkowa mikroskopią konfokalną – przygotowanie do obrazowania

UWAGA: Sposób ustawienia parametrów obrazowania zależy od zastosowanego systemu konfokalnego. Aby poznać więcej parametrów obrazowania, zobacz sekcję Dyskusja . Zdjęcia wykonywano za pomocą CLSM oraz obiektywu 20x do zanurzenia w wodzie. Zastosowanie obiektywu zanurzającego w wodzie zapewnia lepsze dopasowanie współczynnika załamania, ponieważ próbka biologiczna jest montowana w wodzie.

<ol>
	<li>Ustawić mikroskop, wzbudzając GFP na 488 nm i wykrywając je detektorem hybrydowym w zakresie od 494 nm do 547 nm. UWAGA: Wzmocnienie przesunięcia detektora hybrydowego zostało ustawione na 100. RFP jest wzbudzane na 561 nm i wykrywane za pomocą hybrydowego detektora między 584 a 629 nm. Wzmocnienie przesunięcia detektora hybrydowego ustawiono na 130. Prędkość skanowania wynosi 400 Hz, a skanowanie jest dwukierunkowe. Stosuje się średnią liniową równą 2. Oba kanały zostały nabyte jednocześnie, aby zminimalizować czas nabycia. Moc lasera została ustawiona na 15% dla lasera 488 nm i 30% dla lasera 561 nm.</li>
	<li>Zlokalizuj pylnik za pomocą oświetlenia jasnego pola.</li>
	<li>Za pomocą kanału brightfield określ etap mejotyczny na podstawie kształtu komórek. UWAGA: Do obserwowania obrotów wymagane są etapy zygotenu lub pachytenu. Zmiana ogniska wzdłuż osi Z umożliwia oszacowanie trójwymiarowego kształtu komórki. W stadium leptotenowym mejocyta mają wyraźnie kwadratowy kształt, a jądro znajduje się w centrum jądra, co ułatwia ich identyfikację. W stadiach zygotenu i pachytenu mejocyty zaczynają przyjmować kształt trapezowy, a jądro migruje w kierunku otoczki jądrowej. W stadium diplotenowym mejocyty wykazują w pełni zaokrągloną morfologię10.</li>
	<li>Wyobraź sobie pytanie na oprogramowaniu. Sygnał RFP jest również dobrym wskaźnikiem etapu mejotycznego komórek. UWAGA: Mejocyty na etapie zygoten/pachyten wykazują znakowanie NUP54 w kształcie półksiężyca, odpowiadającym skupiskom porów jądrowych na ograniczonym terenie NE na tych etapach (rysunek 3A). W razie potrzeby obróć pylnik tak, aby był położony poziomo (patrz Rysunek 3).</li>
	<li>Zdefiniuj rozmiar obrazu 400 px na 150 px, z cyfrowym zoomem 4, wycentrując pół na obrazie.</li>
	<li>Określ grubość próbki, którą ma się obrazować, aby uzyskać jak najwięcej nienaruszonych mejocykli. Jednak ważne jest, aby ograniczyć liczbę z-wycinków, aby zminimalizować czas pozyskiwania. Dla grubości 15 μm powstaje 16 z-krojów. Stosy Z zostały pozyskane o rozmiarze kroku 1,04 μm.</li>
	<li>Aby wykonać ciągłe akwizycje, ustaw interwał czasu na zero w sekcji czasowej . Przy użyciu mikroskopu i opisanych powyżej parametrów czas pozyskania 16 plasterków wynosi około 6–8 s. Minimalny czas zdobywania to 2 minuty, ale może sięgać nawet 20 minut.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję.</li>
</ol>

4. Analiza obrazów – śledzenie ruchu centromerów

UWAGA: Rekonstrukcja ruchów centromerów wymaga oprogramowania do analizy obrazu, które potrafi śledzić ruch 3D. Oprogramowanie przypisze obiekt do sygnału fluorescencyjnego na podstawie zdefiniowanych parametrów przy każdym momencie akwizycji. Następnie narzędzie śledzące automatycznie analizuje ruchome obiekty i tworzy wykres linii genealogii.

<ol>
	<li>Wstępne przetwarzanie obrazu<ol>
		<li>Aby ułatwić analizę ruchów, wykonaj przetwarzanie obrazów po akwizycji. Na przykład adaptacyjny proces ekstrakcji informacji (algorytm dekonwolucji) może być użyty do ujawniania drobnych struktur i szczegółów oraz poprawy jakości obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Globalne śledzenie centromerów<ol>
		<li>Śledz wszystkie centromery obrazu: Użyj modułu punktowego do automatycznego śledzenia plam (w czasie).</li>
		<li>Wybierz kanał źródłowy, zielony w tym przypadku. Wskaż średnicę XY, 1 μm, dla centromeru oznaczonego GFP-CENH3. Detekcja obiektów identyfikuje wszystkie obiekty na obrazie (Rysunek 3B).</li>
		<li>Modyfikacja jakości detekcji w zależności od natężenia sygnału, korzystając z wykresu na dole okna sterowania.</li>
		<li>Do wyznaczania trajektorii należy użyć algorytmu autoregresywnego śledzenia ruchu (Rysunek 3C). Wizualizacja wszystkich trajektorii ułatwia identyfikację mejocytatów z tkanek somatycznych (Wideo 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie centromerów w pojedynczym mejocycie UWAGA: Korzystając z oprogramowania do wizualizacji 3D, sprawdź jądra i trajektorie oraz analizuj tylko jądra, które są nienaruszone i nie zostały przycięte w żadnym momencie podczas pozyskiwania. Analiza przyciętego mejocyta prowadzi do błędnych danych.<ol>
		<li>Automatyczne śledzenie centromerów UWAGA: Podczas analizy pojedynczego jądra proces rozpoczyna się od początku.<ol>
			<li>Użyj modułu spot do śledzenia plam (w czasie) na wybranym jądrze, definiując odpowiadający mu Region Zainteresowania (ROI) za pomocą segmentu opcji tylko Region Zainteresowania i śledząc plamy (w czasie).</li>
			<li>Wybierz ROI, który prawidłowo obejmuje jądro we wszystkich trzech wymiarach i w czasie. (Rysunek 4A).</li>
			<li>Do wykrywania centromerów i śledzenia używaj tych samych parametrów co dla całego przeciwnika (Rysunek 4B) i śledzenia (Rysunek 4C).</li>
			<li>Na wykresie linii rodowej (rysunek 4F) wskazane są wszystkie trajektorie. Trajektorie poza analizowanym mejoocytem można usunąć (rysunek 4C). Zaznacz ścieżki i usuń je za pomocą Delete na klawiaturze. Można je łatwo zidentyfikować za pomocą przeglądarki 3D w oprogramowaniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ręczna korekta śledzenia centromerów UWAGA: W większości przypadków trajektorie trzeba korygować ręcznie, ponieważ oprogramowanie śledzące nie jest w stanie rozróżnić centromerów zbyt blisko siebie.<ol>
			<li>Użyj trybu edycji , aby usunąć lub dodać obiekt. Upewnij się, że obiekt jest dodany na właściwej płaszczyźnie.</li>
			<li>Ręcznie połącz nowe obiekty w trybie Edit Tracks, korzystając z wykresu linii geneażowej, po dokładnej i szczegółowej analizie komórki w 3D. Rysunek 4E,G pokazuje skorygowane trajektorie na obrazie meiocytu i na wykresie liniowym, odpowiednio. Film 2 pokazuje trajektorie jednego mejocyta po korekcji.</li>
			<li>Eksport danych<ol>
				<li>Eksportuj dane śledzenia do formatu programu kalkulacyjnego, aby ułatwić dalsze przetwarzanie i analizę danych. Pliki te zawierają tabele pomiarowe powstałe w wyniku śledzenia wykonanego za pomocą oprogramowania.</li>
				<li>Upewnij się, że plik wyeksportowanego arkusza kalkulacyjnego zawiera następujące zmienne: Czas, który rejestruje punkt czasu każdego pomiaru; identyfikacja toru, która jednoznacznie identyfikuje każdy tor; Przemieszczenie delta X, Y, Z, które reprezentuje zmianę pozycji w trzech wymiarach w każdym punkcie czasowym; oraz Pozycja X, Y, Z, która przechowuje bezwzględną pozycję każdego obiektu w przestrzeni.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

5. Analiza danych

UWAGA: Ta część opisuje workflow analizy danych z użyciem skryptów R11 wykonywanych w RStudio12. Można je pobrać z repozytorium Data INRAE pod adresem: 10.57745/V1NNFI. Wszystkie wartości są generowane za pomocą ggplot213 do wizualizacji obliczonych metryk. Skrypty wykonują kolejno następujące kroki: meiomove-sub-config. Skrypt R jest najpierw wykonywany, aby zainicjować środowisko R, załadować wymagane biblioteki i zdefiniować zmienne globalne. Link do scenariusza to: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

<ol>
	<li>Odczyt i wybór danych UWAGA: Skrypt do użycia jest zapisany jako: meiomove-sub-loader.R."<ol>
		<li>Zbierz wszystkie pojedyncze pliki Excel zawierające dane śledzenia i połącz je w jeden skonsolidowany plik.</li>
		<li>Zapisz połączony plik w formacie TSV (wartości rozdzielone tabulatorami), aby zapewnić kompatybilność z dalszymi etapami przetwarzania danych.</li>
		<li>Oblicz pozycje x, y, z, kumulując wartości przemieszczeń w czasie, zapewniając dokładną rekonstrukcję trajektorii przestrzennej każdego śledzonego obiektu. Zrobiono to, aby zrekompensować błąd w oprogramowaniu, który eksportował błędne pozycje XYZ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie danych UWAGA: Skrypt do użycia jest przechowywany jako: meiomove-sub-clean.R."<ol>
		<li>Usuń krótkie ścieżki, zdefiniowane jako te o minimalnym czasie trwania 50 sekund. Te ścieżki nie zawierają wystarczającej liczby danych do sensownej analizy, ponieważ mogą wprowadzać szumy lub nieścisłości.</li>
		<li>Zidentyfikuj i usuń ślady, w których pozycja (X, Y, Z) pozostaje stała w czasie, ponieważ wskazują one na artefakty lub statyczne struktury nieistotne dla analizy.</li>
		<li>Filtruj brakujące wartości przemieszczeń (wpisy NA), aby zapewnić integralność danych i uniknąć błędów obliczeniowych w kolejnych etapach.</li>
		<li>Wykrywanie i usuwanie śladów, w których wartości przemieszczeń uzyskane przez oprogramowanie do analizy obrazu różnią się znacząco od tych przeliczonych, co zapewnia spójność i niezawodność danych śledzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korekcja dryfu komórek mejotycznych UWAGA: Skrypt do użycia jest również przechowywany jako: meiomove-sub-clean.R."<ol>
		<li>Uwzględnić możliwy dryf podczas akwizycji, rozróżniając centromery mejotyczne i somatyczne. Ten krok zapewnia, że obserwowane ruchy odpowiadają procesom biologicznym, a nie artefaktom eksperymentalnym.</li>
		<li>Stosuj korektę dryfu, regulując położenie komórek mejotycznych względem komórek somatycznych, które służą jako stabilne odniesienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie wyników UWAGA: Skrypt do użycia jest przechowywany jako: meiomove-sub-metrics.R."<ol>
		<li>Oblicz chwilową prędkość w każdym kroku czasowym, aby śledzić zmiany prędkości ruchu w czasie.</li>
		<li>Oblicz kąt skrętu, który reprezentuje zmianę kierunku ruchu pomiędzy kolejnymi krokami czasowymi, dając wgląd w wzorce trajektorii. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Output 1).</li>
		<li>Oblicz wskaźnik zasięgu za pomocą celltrackR14, który ilościowo określa, jak daleko przesuwa się śledzony obiekt względem swojej pozycji wyjściowej, dając wskazówkę o zachowaniu eksploracyjnym. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Output 2).</li>
		<li>Oblicz średnią prędkość dla każdego toru, aby podsumować charakterystyki ruchu na całym okresie obserwacji. Oblicz średni kąt skrętu na torze, aby przeanalizować ogólną kierunkowość ruchu i wzorce zachowań. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Output 3).</li>
		<li>Określ pozycję centroidu w każdym kroku czasowym dla każdego toru komórki. Centroid to średnia pozycji centromerów w danym mejocie.</li>
		<li>Oblicz rozmiar centroidu w każdym kroku czasowym, co stanowi miarę przestrzennego rozproszenia centromerów wokół ich średniej pozycji. Zmiany rozmiaru centroidu w czasie dostarczają informacji o globalnej spójności na torach centromerów. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Output 4).</li>
		<li>Oblicz korelację krzyżową prędkości, aby analizować zależności między dynamiką ruchu różnych śledzonych obiektów, ujawniając potencjalne skoordynowane zachowania. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Output 5).</li>
		<li>Oblicz średnie kwadratowe przemieszczenie (MSD) dla każdego toru, kluczową metrykę określającą średnią kwadratową odległość pokonaną przez centromery w określonych przedziałach czasowych (opóźnieniach), aby scharakteryzować typ ruchu. UWAGA: Analizując ewolucję MSD wraz ze wzrostem opóźnienia czasowego, można wywnioskować, czy ruch jest głównie dyfuzyjny, czy ograniczony, co pozwala uzyskać wgląd w podstawowe zachowanie dynamiczne. Wynik jest przechowywany jako: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Output 6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosomes%3A+Integrating+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosomes: Integrating structure and function.</a> Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+Dances+between+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis: Dances between homologs.</a> Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).</li>
<li>Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+chromosomes+interact+with+the+cytoskeleton+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis.</a> Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).</li>
<li>Harline, K., Roeder, A. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+pipeline+for+live+imaging+whole+Arabidopsis+leaves+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution.</a> Plant Methods. 19 (1), 10(2023).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> J Vis Exp. (122), e55156(2017).</li>
<li>Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Arabidopsis+shoot+primordia+via+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).</li>
<li>Prusicki, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+meiosis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana.</a> eLife. 8, e42834(2019).</li>
<li>Valuchova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+germline+differentiation+within+Arabidopsis+flowers+by+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy.</a> ELife. 9, e52546(2020).</li>
<li>Ravi, M., Chan, S. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploid+plants+produced+by+centromere-mediated+genome+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination.</a> Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).</li>
<li>Cromer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+meiotic+prophase+chromosome+movements+in+Arabidopsis+thaliana+are+linked+to+essential+reorganization+at+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope.</a> Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).</li>
<li>R: A language and environment for statistical computing. , at
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2021).</li>
<li>RStudio: Integrated development environment for R. , at
 <a target="_blank" href="http://www.posit.co/">http://www.posit.co/</a> (2025).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ggplot2%22%5BJournal%5D)">Data Analysis.</a> ggplot2. , 189-201 (2016).</li>
<li>Wortel, I. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CelltrackR%3A+An+R+package+for+fast+and+flexible+analysis+of+immune+cell+migration+data%5BTitle%5D)+AND+%22Immunoinformatics%22%5BJournal%5D)">CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data.</a> Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).</li>
<li>Lee, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+rapid+telomere+prophase+movements+in+mouse+meiotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes.</a> Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).</li>
<li>Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homologue+juxtaposition+during+meiotic+chromosome+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing.</a> Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere+positioning+and+dynamics+in+living+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants.</a> Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).</li>
<li>Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+testing+random+spatial+models+on+nuclear+object+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Chromatin+Dynamics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for testing random spatial models on nuclear object distributions.</a> Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Obecny protokół umożliwia obrazowanie in vivo oraz analizę ruchu centromerów podczas profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana. Protokół ten może być realizowany zarówno za pomocą pionowego, jak i odwróconego mikroskopu konfokalnego, co umożliwia jego dostęp do większości laboratoriów wyposażonych w technologię konfokalną. Chociaż systemy konfokalne różnią się szybkością skanowania, czułością, detektorami oraz zdolnością do rozdzielania długości fal, możliwe jest dostosowanie parametrów akwizycji, aby ...

Mejoza to fundamentalny proces biologiczny, który zapewnia wierne przekazywanie materiału genetycznego z pokolenia na pokolenie. Proces mejozy dzieli się na dwie kolejne rundy podziału komórkowego: mejozę I i mejozę II. Mejoza I poprzedzona jest długą profazą, podczas której homologiczne chromosomy rozpoznają się i parują. Podczas tej wydłużonej profazy zachodzą liczne procesy biologiczne. Poza parowaniem chromosomów homologicznych, chromosomy te przechodzą także proces zwany synapsą. Synapsa polega na tworzeniu kompleksu białkowego znanego jako kompleks synaptomalny, który łączy homologiczne chromosomy wzdłuż ich długości. Kompleks synaptonemalny sprzyja homologicznej rekombinacji, po czym następuje wymiana materiału genetycznego między chromosomami homologicznymi oraz powstawanie krzyżów. Ustanawiają one fizyczne powiązanie między chromosomami homologicznymi, ułatwiając ich prawidłowe ustawienie i zrównoważoną segregację 1,2.
Podczas rozpoznawania chromosomów homologicznie wiadomo, że szybkie ruchy chromosomów profazowych (RPM) odgrywają kluczową rolę. Badania przeprowadzone na kilku modelowych gatunkach wykazały, że podczas leptotena chromosomy przyczepiają się do otoczki jądrowej (NE). Są one połączone z cytoplazmatycznym cytoszkieletem przez NE, za pośrednictwem kompleksu białkowegoLINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) 3. Siły generowane w cytoplazmie są przekazywane na chromosomy przez kompleks LINC, umożliwiając ruch chromosomów.
Badanie obrotów jest niezbędne do zrozumienia podstawowych mechanizmów mejozy, szczególnie tych związanych z rozpoznawaniem chromosomów homologicznych. Jednak badanie tych ruchów wymaga specyficznych eksperymentów obrazowania na żywo. Większość badań obrazowych na żywo u A. thaliana koncentruje się na tkankach somatycznych i narządach wegetatywnych. Badania te zostały przeprowadzone, aby ustalić, jak komórki dają początek narządom4. Takie badania przeprowadzono na merystemach5i korzeniach6. Ostatnio kilka zespołów opracowało techniki obserwacji rozwoju kwiatów, w tym mejozy, w czasie rzeczywistym u A. thaliana przez kilka dni 7,8. Jednak protokoły te mogą być również wymagające i trudne do skonfigurowania dla dużej liczby próbek.
W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół obrazowania i analizy dynamiki chromosomów na żywych podczas mejozy u A. thaliana. Dzięki zastosowaniu mikroskopii konfokalnej, prostej techniki przygotowania próbek, w połączeniu z fluorescencyjnym znakowaniem chromosomów, ruch chromosomów został uchwycony z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową w krótkim czasie. Protokół określa przygotowanie tkanek roślinnych do obrazowania, optymalizację parametrów obrazowania w celu minimalizacji fototoksyczności i maksymalizacji jakości obrazu, a także przetwarzanie obrazów i analizę danych. Metoda ta umożliwia precyzyjne ilościowe określenie dynamiki centromerów podczas mejozy, co jest kluczowe dla zrozumienia zachowań chromosomów leżących u podstaw skutecznego powstawania gamet. Ta wiedza ma bezpośrednie znaczenie dla rolnictwa, szczególnie w kontekście ulepszania programów hodowli roślin poprzez ułatwianie badań procesów parowania i rekombinacji chromosomów wpływających na płodność i różnorodność genetyczną.

<table><tbody><tr><td>Teren lęgowy</td><td>TREF (Jiffy)</td><td>101820/02227861</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 AOBS (Akustooptyczny rozdzielacz wiązki)</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie konfokalne</td><td>Leica</td><td>Oprogramowanie LAS X 3.5.0.18371</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>107052</td><td>22x22 nr 1,5H</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Ideal-Tek</td><td>4.SA.0</td><td>Pęsety o wysokiej precyzji</td></tr><tr><td>GFP:CENH3</td><td></td><td>Ravi i in. 2010</td><td>Nasiona Arabidopsis thaliana używane tutaj</td></tr><tr><td>ggplot2</td><td></td><td>&nbsp; ggplot2: Eleganckie grafiki do analizy danych&nbsp; Referencja13</td><td>https://ggplot2.tidyverse.org</td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Hammacher</td><td>Uchwyt na pętlę, długość 170 mm</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Instrumenty oksfordzkie</td><td>Imaris 9.7.2</td><td>Analiza obrazu - moduł "Spot"</td></tr><tr><td>Soczewka</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2 20&kroty;/0,75 IMM</td><td></td></tr><tr><td>Lightning</td><td>Leica</td><td>Adaptacyjna dekonwolucja</td><td>Automatyczne inteligentne wyodrębnianie informacji z danych konfokalnych</td></tr><tr><td>Światła</td><td>VEGELED</td><td>Apollo LL252-Gen2</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>Watkins& Doncaster</td><td>Sworznie E3 .0124" (.31mm) x 25mm</td><td></td></tr><tr><td>NUP54: RFP</td><td></td><td>Cromer i in. 2024</td><td>Nasiona Arabidopsis thaliana używane tutaj</td></tr><tr><td>Naczynia</td><td>TEKU (POPPELMANN)</td><td>VDF 7x7x6,5 cm</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>Zespół RCore</td><td>R: Język i środowisko dla statystyk i statystyk; &nbsp; Informatyka. R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria.&nbsp; Referencja11</td><td>https://www.R-project.org/&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Zespół Posit</td><td>&nbsp; RStudio: Zintegrowane środowisko programistyczne dla R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Referencja12</td><td>http://www.posit.co/</td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>SZKŁO Z DZIANINY</td><td>100003</td><td>26x76x1,0mm</td></tr><tr><td>Dystansy</td><td>Wędkarz termo-wędrowny</td><td>Dystans zabezpieczający, 8 otworów, średnica 9 mm, głębokość 0,12 mm</td><td>Każdy dystans wytnij osobno</td></tr><tr><td>Stereomikroskopy</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u arabidopsis thaliana

Live Imaging Characterization of Centromere Movements During Male Meiotic Prophase in Arabidopsis thaliana

Mejoza to podział komórkowy, niezbędny do rozmnażania płciowego. Podczas profazy mejotycznej homologiczne chromosomy pochodzenia matczynego i ojcowskiego rozpoznają się nawzajem i łączą, co jest ułatwiane przez ich szybkie ruchy w jądrze. Ruchy profazy mejotycznej opierają się na przyczepieniu chromosomów do otoczki jądrowej oraz od sił cytoplazmatycznych przekazywanych na chromosomy przez otoczkę jądrową. U roślin ograniczona dostępność i kruchość męskich mejocytów wewnątrz pylników sprawiają, że metody obrazowania na żywo i analiza ruchu chromosomów są technicznie trudne. Rzeczywiście, te ruchy są bardzo szybkie, a ich analiza wymaga znalezienia optymalnych warunków przyswojenia. Tutaj efektywna metoda rejestrowania szybkich ruchów chromosomów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana jest opisana w filmach poklatkowych, śledząc ruchy fluorescencyjnych centromerów. Opiera się na dalszej sekcji i akwizycji obrazów za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), zarówno w 3D, jak i w czasie. Pozyskiwanie mejotycznych stosów z co 7 s pozwala na wystarczającą rozdzielczość do rekonstrukcji i analizy trajektorii oznaczonych centromerów. Wyodrębnione dane są następnie przetwarzane, co umożliwia ilościową analizę tych ruchów chromosomowych. Opracowanie modeli na podstawie tych danych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmu szybkiego ruchu chromosomów, w tym charakteru i intensywności sił napędzających ten proces.

Opracowano szybki protokół do wizualizacji ruchów chromosomów podczas profazy mejozy u Arabidopsis thaliana, umożliwiając wielokrotne pozyskanie w czasie poklatkowym, a tym samym analizę dużego zbioru danych. Mejocyty wyrażające marker GFP, umożliwiający wizualizację centromerów, oraz marker RFP, umożliwiający wizualizację jądra, są obrazowane przez czas trwania 4 minut zgodnie z opisanym protokołem.
Parametry pozyskiwa...

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Meiosis is a cellular division, essential for sexual reproduction. During meiotic prophase, homologous chromosomes of maternal and paternal origin ...

Nasze badania dotyczą mejozy roślin, mające na celu odkrycie mechanizmów molekularnych kierujących rozpoznawaniem, ustawieniem i parowaniem chromosomów homologicznych podczas progresji mejotycznej. Wyzwaniem jest wizualizacja ruchu chromosomów w profilach mejotycznych, co wymaga żywego obrazowania tkanek o wysokiej rozdzielczości i szybkości do śledzenia trajektorii. Na początek usuń ochronną folię z dystansu z jednej strony i umieść ją na środku szklanej prowadnicy.Następnie usuń drugą folię ochronną. Włóż osiem mikrolitrów wody z kranu do środka dystansu. Za pomocą kleszczy zerwij kwiatostan z jednego z głównych łodyg.Umieść kwiatostan na nowym szkiełku umieszczonym pod mikroskopem stereo wyposażonym w linijkę. Wybierz pąki kwiatowe o długości około 0,5 milimetra. Używając ostrych igieł, delikatnie rozchylaj pąki, rozdzielając działki i płatki, aby zatrzymać tylko pylniki.Delikatnie przełóż pęczki do wody w wnęce dystansowej natychmiast po usunięciu działka i płatków, aby zapobiec odwodnieniu. Umieść kilka pęków pylników wewnątrz komory dystansowej. Aby przykryć zlewkę pokrywą, unikając jednocześnie pęcherzyków powietrza, dodaj osiem mikrolitrów wody na pokrywę.Następnie ostrożnie odwróć pokrywę z kroplą wody skierowaną do wnęki dystansu. Upewnij się, że pęki są zanurzone w łącznej ilości 16 mikrolitrów wody oraz że pokrywa dobrze przylega do dystansu. Ustawiłem mikroskop poprzez wzbudzenie GFP na 488 nanometrów i detekcję za pomocą hybrydowego detektora o średnicy od 494 nanometrów do 547 nanometrów.Następnie zlokalizuj pylnik za pomocą oświetlenia jasnego pola. Za pomocą kanału brightfield określ etap mejotyczny na podstawie kształtu komórek. Wizualizuj przeciwnik w oprogramowaniu i użyj sygnału RFP jako dodatkowego wskaźnika etapu mejotycznego komórek.Aby wykonać ciągłe akwizycje, ustaw interwał czasu na zero w sekcji czasu. Następnie użyj modułu spot, aby automatycznie śledzić spoty. Wybierz zielony kanał źródłowy i ustaw średnicę XY na jeden mikrometr dla centromery oznaczonej GFPCENH3.Następnie modyfikuj jakość detekcji na podstawie natężenia sygnału, korzystając z wykresu na dole okna sterowania. Użyj algorytmu automatycznego regresywnego śledzenia ruchu do śledzenia trajektorii centromerów i wizualizacji wszystkich trajektorii, aby łatwo odróżnić mejocyty od tkanek somatycznych. Następnie użyj modułu punktowego do śledzenia plam w czasie na wybranym jądrze.Zdefiniuj obszar zainteresowania, wybierając segment opcji tylko jako obszar zainteresowania i wykonuj śledzenie punktowe w jego obrębie. Wybierz obszar zainteresowania, który prawidłowo obejmuje jądro we wszystkich trzech wymiarach i w czasie. W wykresie linii genealogii użyj przeglądarki 3D oprogramowania do wizualizacji wszystkich trajektorii.Usuń trajektorie poza analizowanym meiocytem, wybierając je i naciskając delete na klawiaturze. W trybie edycji usuń lub dodaj obiekt, upewniając się, że obiekt jest dodany na właściwej płaszczyźnie. W trybie edycji ścieżek ręcznie połącz nowe obiekty na wykresie linii po dokładnej analizie komórki w 3D.Oblicz natychmiastową prędkość na każdym kroku czasowym, aby monitorować zmiany prędkości ruchu w czasie. Oblicz kąt skrętu jako zmianę kierunku ruchu pomiędzy kolejnymi krokami czasowymi, aby odsłonić wzorce trajektorii. Przechowuj wynik wraz z natychmiastową prędkością.Oblicz współczynnik zasięgu za pomocą cell trackera, aby zmierzyć, jak daleko przesuwa się obiekt śledzony względem swojej pozycji wyjściowej, co wskazuje na zachowanie eksploracyjne. Oblicz średnią prędkość dla każdego toru, aby podsumować charakterystyki ruchu w okresie obserwacji. Oblicz średni kąt skrętu na tor, aby przeanalizować ruch, kierunkowość i wzorce zachowań oraz zapisać wynik.Następnie oblicz rozmiar centroidu w każdym kroku czasowym, aby zmierzyć przestrzenną dyspersję centromerów wokół ich średniej pozycji. Wykorzystaj zmiany rozmiaru centroidów w czasie do oceny globalnej spójności między torami centromerów i zapisuj wynik. Oblicz korelację prędkości krzyżowej, aby analizować zależności między dynamiką ruchu różnych śledzonych obiektów, ujawniając potencjalne skoordynowane zachowania.Następnie oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe dla każdego toru, aby określić średnią kwadratową odległość pokonaną przez centromery w danym przedziale czasowym. Centromery mejotyczne wykazywały znacząco wyższą średnią prędkość 109,35 nanometrów na sekundę w porównaniu z centromerami somatycznymi. Centromery mejotyczne wykazywały szerszy zakres i wyższy wskaźnik normalizowanego zasięgu w porównaniu do centromerow somatycznych.Rozkład kątów skrętu różnił się między centromerami mejotycznymi a somatycznymi. Średnie kwadratowe przemieszczenie centromerów mejotycznych rosło z czasem, podczas gdy centromery somatyczne pozostawały w dużej mierze statyczne. Protokół ten umożliwił pierwszą ilościową identyfikację ruchu chromosomu mejotycznego w Arabidopsis, ujawniając dramatyczną dynamikę centromerów w stadium zygotenowym i pachytenowem.Protokół ten umożliwia badanie ruchów regionów genomowych podczas profazy mejotycznej i może być adaptowany do zastosowań u innych gatunków roślin. Prace te umożliwiają badanie interakcji ruchów chromosomów i rekombinacji, pogłębiając zrozumienie mechanizmów napędzających różnorodność genetyczną podczas tworzenia gamet roślinnych.

live-imaging-characterization-centromere-movements-during-male

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Odkryj metodę obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościową analizę dynamiki chromosomów w komórkach roślinnych.

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów