Name: Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego przy użyciu spektrometrii masowej LC-MS/MS. Ta technika umożliwia ilościowe oznaczenie do 50 modyfikacji posttranslacyjnych histonów z zaledwie 1000 komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy chirurgom i klinicystom z Europejskiego Instytutu Onkologii oraz Istituto Neurologico Carlo Besta za przeprowadzenie biopsji tkanek FF, OCT mrożonych oraz FFPE. Dziękujemy Robertie Noberini za naukową i metodologiczną dyskusję podczas przygotowywania rękopisu oraz za nasze finansowanie: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (numer grantu IG-2023-28767) oraz Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisana tutaj metoda zapewnia prosty i solidny sposób pracy umożliwiający efektywną izolację histonów z próbek klinicznych przechowywanych jako świeżo zamrożone, zamrożone OCT oraz biopsji FFPE do profilowania ich krajobrazów modyfikowanych za pomocą analizy MS. Następujący protokół przygotowania próbki poprzez separację SDS-PAGE oraz trawienie PRO-w żelu z trypsyną zapewnia skuteczne usuwanie detergentów, soli i innych zanieczyszczeń MS33 oraz zapewnia dokładną i solidną ilościową ilościową liczb...

W jądrze komórek eukariotycznych histony łączą się z DNA, tworząc nukleosomy, podstawowe jednostki strukturalne chromatyny. Każdy nukleosom składa się z około 146 bp DNA owiniętego wokół oktamera składającego się z dwóch kopii histonów rdzeniowych H2A i H2B, wraz z dwoma dimerami histonów H3 i H4. Ponadto obecny jest również histon łącznikowy H1, który ułatwia organizację chromatyny wyższego rzędu poprzez wiązanie zarówno nukleosomu, jak i rozciągnięcia DNA łączącego między nukleosomami1. Histone są ozdobione szeroką gamą modyfikacji posttranslacyjnych (PTM), które występują głównie na ich N-końcowych ogonach. Modyfikacje te obejmują metylację, różne typy acylacji (acetylacja, propionylacja, butyrylacja itp.), fosforylację, sumoylację, ubikwitylację, ADP-rybozylację oraz krotonylację, spośród którychnajbardziej wyróżniają się metylacja lizyny i argininy oraz acetylacja lizyny. Konkretne typy, lokalizacje i kombinacje modyfikacji histonów tworzą tzw. kod histonowy. Kod ten składa się z różnych modyfikacji posttranslacyjnych (PTM) na N-końcowych ogonach histonów, które są dodawane i usuwane przez specyficzne enzymy modyfikujące histony. Te modyfikacje są następnie rozpoznawane przez białka efektorowe, prowadząc do zmian w strukturze chromatyny, takich jak zagęszczenie czy dekondensacja, co ostatecznie wpływa na kilka procesów biologicznych, w tym naprawę uszkodzeń DNA, replikację, a szczególnie transkrypcję genów 3,4.
Metylacja DNA i histonowe PTM należą do najczęściej badanych cech epigenetycznych w raku3. Najnowsze dowody eksperymentalne wykazały zmiany w poziomach różnych histonowych PTM w kilku typach nowotworów. Warto zauważyć, że utrata H4K20me3 i H4K16ac została zgłoszona jako cechy charakterystyczne nowotworu, ponieważ ich poziom był obniżony praktycznie we wszystkich guzach w porównaniu do zdrowych tkanek4. Nasza grupa zidentyfikowała utratę H3K14ac jako potencjalną cechę rozpoznawczą raka, ilościowo określając jej zmniejszenie w kilku nowotworach w porównaniu do normalnych odpowiedników, stosując podejścia oparte na spektrometrii masowej (MS)5. Ponadto liczne badania podkreślają prognostyczną wartość PTM histonowych, pokazując, że zmiany w ich globalnych poziomach, głównie oceniane immunohistochemią w biopsjach pacjentów, korelują z postępem nowotworu, oceną histologiczną oraz odpowiedzią terapeutyczną 6,7,8. Dlatego analiza histonów PTM w próbkach nowotworów jest ważna dla identyfikacji nowych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych, a także potencjalnych celów tzw. epi-leków8.
Bardzo powszechne metody analizy PTM histonów w liniach komórkowych i próbkach klinicznych opierają się na technikach opartych na przeciwciałach, takich jak immunoblotowanie, immunohistochemia oraz enzymatyczny immunosorbentny test (ELISA)9. Jednak metody oparte na przeciwciałach mają różne ograniczenia, w tym reaktywność krzyżową lub odwrotnie, maskowanie epitopem10. Reaktywność krzyżowa występuje, gdy przeciwciała wiążą się z niezamierzonymi celami o podobnych epitopach, prowadząc do potencjalnych fałszywie pozytywnych wyników, natomiast maskowanie epitopów oznacza przeoczenie wykrycia konkretnego epitopu (histonowego PTM lub wariantu, w tym przypadku) z powodu obecności innych modyfikacji na sąsiednich resztach. Ponadto ilość tkanki potrzebna do analizy modyfikacji histonów za pomocą przeciwciał jest często wysoka, ponieważ jednocześnie można wykryć tylko ograniczoną liczbę PTM, więc do analiz multipleksowanych11 trzeba przetworzyć kilka przekrojów tkanki. Spektrometria mas (MS) stała się metodą wyboru do profilowania histonowych PTM i ich wariantów, przezwyciężając ograniczenia podejść opartych na przeciwciałach 5,8. MS opiera się na wykrywaniu różnicy masy (Δm, masa delta) pomiędzy teoretycznymi a eksperymentalnie mierzonymi masami peptydów i białek. Jest bezstronny, kompleksowy i ilościowy, ponieważ pozwala na identyfikację i ilościową identyfikację PTM oraz wariantów bez konieczności wcześniejszej znajomości ich lokalizacji. To czyni SM szczególnie cennym do czułej i dokładnej analizy zmian histonowych PTM w nowotworach i innych schorzeniach patologicznych8.
Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół ekstrakcji histonów z próbek klinicznych, połączony z profilowaniem histonów PTM opartym na SM, dalej określanym jako workflow epi-proteomics. Biopsje pacjentów są głównie przechowywane jako świeżo mrożone (FF), próbki mrożone w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) oraz próbki z parafiną zakorzenioną w formalinie (FFPE)12. Podczas gdy świeże biopsje są zamrażane w ciekłym azocie lub wstępnie schłodzonym izopentanie bez dodania żadnego medium konserwującego13, biopsje zamrożone w OCT zawierają rozpuszczalne w wodzie medium krioprotekcyjne, głównie złożone z poliwinylalkoholu i glikolu polietylenowego, które ułatwia cięcie tkanek14. Próbki FFPE, z kolei utrwalone formaliną i osadzone w parafinie, stanowią najczęstszą metodę przechowywania próbek klinicznych, ponieważ mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez kilka lat, unikając kosztownej konserwacji przy niskich lub ultra-niskich temperaturach15. Ponieważ biopsje zatrzymniane są wolne od dodatków konserwujących, mogą być bezpośrednio przetwarzane do ekstrakcji histonów, natomiast biopsje zamrożone OCT i FFPE wymagają początkowych kroków usunięcia medium lub utrwalającego. Próbki FFPE wymagają również rozległego odłączania białek i pozyskiwania antygenów.
Protokół ten szczegółowo opisuje metody ekstrakcji histonów z świeżo zamrożonych, osadzonych w OCT i próbek klinicznych FFPE, zapewniając odpowiednią ilość i jakość do dalszej analizy SM poprzez uwzględnienie specyficznych wyzwań związanych z każdym typem zachowania próbki (krok 1). Histony oczyszczone z próbek klinicznych są rozdzielane za pomocą elektroforezy żelu białkowego w warunkach denaturujących (SDS-PAGE), następnie następuje etap deriwacyjny, a następnie enzymatycznie trawione w celu uzyskania peptydów o odpowiedniej długości (4-15 aminokwasów) do analizy spektrometrii masowej oddolnie16 (krok 2). Dokładniej mówiąc, histony są trawione metodą podobną do ArgC, gdzie trypsyna, która zwykle przecina się na końcu C niezmodyfikowanych lizyn (K) i arginin (R), jest indukowana do cięcia tylko na końcu arginin w C, z powodu wcześniejszej chemicznej acylacji niezmodyfikowanych i monometylowanych lizyn bezwodnikiem propionowym (PRO). Następnie trawione peptydy histonowe podobne do Arg-C są acylowane na ogonach N-końcowych przez dodanie izocyjanianu fenylowego (). Ta dalsza deriwatyzacja zwiększa hydrofobiczność peptydów i umożliwia lepsze rozdzielanie peptydów krótkich histonów za pomocą odwrotnej fazy wysokowydajnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC), poprawiając identyfikację i ilościową identyfikację izobarycznych peptydoform17,18 (krok 3). Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj metody podkreślają siłę profilowania histonów opartego na SM w badaniach epigenetycznych nowotworów.

<table><tbody><tr><td><mocne>chemikalia</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histolemon RS dla histologii</td><td>Carlo Erba</td><td>454912</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Carlo Erba</td><td>412341</td><td>1L</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu (AmBic)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>WDR</td><td>1.012.010.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy aprotyniny</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>A1153</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Merk</td><td>E1014</td><td>25 KU</td></tr><tr><td>Bisakrylamid 30% 37,5 M</td><td>AppliChem</td><td>APA36261000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bufor A 0,1 % kwasu mrówkowego w ddH2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10229884</td><td>500 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor B 0,1 % kwasu mrówkowego / 80% acetonitrylu w ddH2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15431423</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Żywica C18</td><td>Merck</td><td>66883-U</td><td>Średnica 47 mm</td></tr><tr><td>Coomassie Instant Blue</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT) &nbsp;</td><td>WDR</td><td>441496P</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414608</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Leupeptin&nbsp; Inhibitor proteazy</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L8511</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.107.320100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Bufor próbek LDS NuPAGE</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>4x</td></tr><tr><td>PBS - Fosforanem buforowana sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>MicroGem</td><td>TL1006</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Izocyjanian fenylu ()</td><td>Sigma Aldrich</td><td>185353</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy fenylommetylosulfonylowofluorku (PMSF)</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>P7626</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Bezwodnik propionowy (PRO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240311</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Rekombinowany histon H3.1 Człowiek</td><td>New England Biolabs</td><td>M2503</td><td>1 & mikro; g/&micro; L</td></tr><tr><td>Trypsyna o stopniu sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>100 ug</td></tr><tr><td>Inhibitor deacetlazy histonowej deacetlazy z maślani sodu (NaBut)</td><td>Merck</td><td>B5887</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trietyloammonowy wodorowęglan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>1x10mL</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Detergent Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X100RS</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Kits/ Sprzęt/Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td>PCR-96-FS-C</td><td>Niepirogeniczny, wolny od Rnazy/Dnazy</td></tr><tr><td>Saldo</td><td>Kern</td><td>19024</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Laboratorium Biofuge Hareus</td><td>Pico, 23396</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie sonakacyjne Bioruptor</td><td>Diagenoda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Digital Sonifier 250</td><td>Emerson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitnik komórkowy 100 & mikro; m</td><td>Sokół</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000509</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce (np. nbsp; Dounce, Wheaton...)</td><td>Dounce, Wheaton</td><td></td><td>1 mL młynka do tkanek</td></tr><tr><td>EASY-nLC 1200 Chromatografia cieczowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna EASY-Spray HPLC C18</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES902</td><td>2 & mikro; m, 100&nbsp; &Aring;, 75 & mikro; m x 25 cm</td></tr><tr><td>Skrypt EpiProfile2.0</td><td>https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fiji</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>https://www.mathworks.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyszukiwarka MaxQuant</td><td>https://maxquant.net/maxquant/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestel A (luźny)</td><td>Dounce, Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestel B (ciasno)</td><td>Dounce, Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System LC-MS/MS Q Exactive Plus Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koło obrotowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496548</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Kiato</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15207266</td><td></td></tr><tr><td>Mata uszczelniająca</td><td>Corning</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td>Kompatybilność z automatyzacją</td></tr><tr><td>Wirówka wirowa z wychyleniem</td><td>Beckman coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Termomikser kompaktowy</td><td>Eppendorf</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>PBI</td><td>Vibromix</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Xcalibur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Extraction of Histones from Clinical Specimens for Epigenetic Profiling by Mass Spectrometry

Obszerne dowody eksperymentalne potwierdzają rolę mechanizmów epigenetycznych w początku, progresji i nawrotach nowotworów. Wśród nich warianty histonowe i ich modyfikacje posttranslacyjne (PTM) regulują organizację i dynamikę chromatyny oraz dostępność genomu, wpływając tym samym na kluczowe procesy DNA, takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa uszkodzeń DNA za pomocą tzw. kodu histonowego. Zaburzenia układu histonów PTM są często obserwowane w nowotworach, a niektóre markery służą jako biomarkery diagnostyczne i prognostyczne. Dlatego nowe metody umożliwiające obiektywne i kompleksowe profilowanie histonowego PTM w próbkach klinicznych są niezwykle cenne dla charakteryzowania epigenetycznych krajobrazów guzów. Przedstawiamy tutaj protokół efektywnej ekstrakcji histonów z próbek klinicznych, w tym biopsje zamrożone na zachwiacie szybko, optymalnej temperatury cięcia (OCT) oraz biopsje z parafiną (FFPE) z formacją parafiny (FFPE). To podejście daje białka histonowe o odpowiedniej ilości i jakości do późniejszej analizy oddolnej za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas tandemową (LC-MS/MS). Ten sposób działania umożliwia solidne wykrywanie i ilościowe wykrywanie i ilościowe kluczowe modyfikacje histonów, szczególnie acetylacji i metylacji lizyny, w próbkach pierwotnych nowotworów, zapewniając dodatkową warstwę molekularną do charakteryzacji nowotworu.

Przeprowadziliśmy ekstrakcję histonów z świeżo zamrożonych i OCT próbek raka piersi oraz z próbek opon FFPE, stosując powyższy protokół. Jak pokazano na rysunku 1A, dla mrożonych próbek usuwaliśmy OCT, gdy był obecny, i homogenizowaliśmy próbki w buforze izolacyjnym jąder zawierającym łagodny detergent (0,1% Triton step 1.1), co umożliwiło izolację jąder. Następnie wyekstrahowaliśmy histony z dodatkiem 0,1% SDS; zamiast tego, w przypadku próbek FFPE, odparafinizowaliśmy, rehydratowaliśmy i o...

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Extensive experimental evidence supports the role of epigenetic mechanisms in cancer onset, progression, and recurrence. Among these, histone variants and ...

Zakres naszych badań polega na analizie zmian epigenetycznych w próbkach nowotworów, odkrywaniu nowych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych oraz identyfikacji potencjalnego celu leczenia. Dużym wyzwaniem przy próbkach klinicznych jest ograniczony materiał oraz artefakty wywołane fiksacją. Jednak dzięki naszemu zoptymalizowanemu workflow i rozsianemu rozsianemu na DI możemy ilościowo określić do 50 PTM histonów z zaledwie 1000 komórek.Pokazujemy, że spektrometria mas może ilościowo określać zmiany histonowych PTM w próbce klinicznej, dostarczając wglądu w mechanizmy epigenetyczne oraz umożliwiając odkrywanie markerów biomarkerów i identyfikację celów leków dla precyzyjnych terapii epigenetycznych. Nasz protokół odpowiada na potrzebę solidnego, ilościowego i czułego profilowania histonowego PTM w różnych typach próbek klinicznych. Spektrometria mas jest idealna do analizy PTM histonów, oferując obiektywne wykrywanie, profilowanie jednoczesne oraz współwystępowanie na tym samym peptydzie, co pozwala pokonać ograniczenia metod opartych na przeciwciałach.Na początek rozmroz świeżo zamrożoną tkankę na lodzie, a skalpelem lub ostrzem wytnij kawałek o masie około 20 do 30 miligramów, odpowiadający około dwóm milimetrom sześciennym tkanki. Przenieś próbkę przeciętej tkanki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Nożyczkami pokrój tkankę na małe kawałki.Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego buforu izolacyjnego jąder z dodatkiem określonych inhibitorów proteazy i ponownie pokrój tkankę. Przelej próbkę do homogenizatora w dół. Najpierw używając luźnego tłuczka, a potem ciasnego, ujednolicaj tkankę tak, że nie pozostaną widoczne dla gołego oka żadne fragmenty.Przefiltruj ujednoliconą próbkę przez 100-mikrometrowy filtr komórek, aby wyeliminować zanieczyszczenia tkanki. Pipeta przefiltrowana próbka energicznie w górę i w dół, używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozpuścić błonę plazmatyczną. Przełóż próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Włóż rurkę do wirówki stołowej i obróć w 2 300 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozpylić jądra. Po odrzuceniu supernatantu należy ponownie zawiesić granulat jądrowy w 50 do 100 mikrolitrach buforu izolacyjnego jąder, uzupełnionym 0,1% SDS, aby rozpuścić błonę jądrową. Następnie dodaj 250 jednostek nukleazy benzonazy do próbki zawieszonej w celu trawienia kwasów nukleinowych.Dobrze wymieszaj i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uzyskać optymalną temperaturę cięcia mrożonych próbek, myj tkanki wodą etanolową i PBS przed rozdrobnieniem i ekstrakcją histonową. Do próbki FFPE dodaj jeden mililitr środka rozpuszczającego parafinę, pobranej w probce o pojemności 1,5 mililitra i z maksymalną prędkością przez 30 sekund, aż parafina całkowicie się rozpuści.Wiruj próbkę w 16 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucaj supernatant za pomocą pipety z małym końcówką, która omija granulat. Następnie dodaj jeden mililitr 95% etanolu do pelletu i wiru z maksymalną prędkością przez 30 sekund. Wiruj próbkę w 16 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant.Po ponownym nawodnieniu próbki dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do pelletu. Ujednolicz tkankę w buforze ekstrakcyjnym, forniszczując cyfrowym sygnalifikatorem z mikrokońcówką o średnicy trzech milimetrów. Po homogenizacji inkubuj próbkę w termomieszarce i krótko otwórz pokrywkę probówki, aby odparował formaldehyd.Po odwirowaniu próbki przelej supernatant do nowej oznaczonej probówki. Wyciąć pasma żelowe odpowiadające masie cząsteczkowej białek histonowych rdzenia mieszczącej się między 10 a 18 kilodaltonami za pomocą skalpela. Po przecięciu gumek żelowych używaj tego samego skalpela, aby przenieść wycięte kawałki żelu do rurki o pojemności 1,5 mililitra.Aby zabarwić żel, dodaj roztwór 50% acetonitrylu w wodzie podwójnie destylowanej i inkubuj tubkę w termomieszaku z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwodnij żelowe kawałki, dodając 100% acetonitryl. Mieszaj termomieszarkę z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po wyrzuceniu supernatantu susz kawałki żelu przez pięć minut w temperaturze pokojowej w wirówce próżniowej. Następnie do każdej rurki dodaj 15 mikrolitrów roztworu proponikawodniku 7,7 molowego oraz 26 mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu amonu i inkubuj. Następnie inkubuj próbkę w 80 mikrolitrach jednego trzonowego wodorowęglanu amonu.Następnie przemywanie kawałków żelu trzy razy podwójnie destylowaną wodą i wyrzucanie płynu po każdej inkubacji. Następnie dodaj 50% acetonu nitrylu do żelowych kawałków i inkubuj z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100% acetonitrylu, żeby całkowicie odwodnić kawałki żelu.Inkubuj w termomieszarce z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu płynu susz kawałki żelu przez pięć minut w wysokiej temperaturze pokojowej w wirówce próżniowej. Do każdej probówki zawierającej kawałki żelu dodaj cztery mikrolitry roztworu trypsyny i 20 mikrolitrów buforu trawienniczego.Inkubuj probówki na lodzie przez 10 minut, aby umożliwić wchłanianie trypsyny do żelu. Gdy trypsyna zostanie w pełni wchłonięta, dodaj 80 mikrolitrów buforu trawiennego, aby całkowicie pokryć kawałki żelu, i inkubuj probówki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomieszaku. Aby wyodrębnić strawione peptydy, należy dodać 100 mikrolitrów 100% acetonitrylu do każdej probówki i inkubować z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w termomieszaczu.Teraz ostrożnie zbierz supernatant i przelej go do nowej rurki o pojemności 1,5 militra. Po powtórzeniu ekstrakcji aceto nitro z pozostałym żelem, zgromadź supernatanty. Skup zgromadzone peptydy w wirówce próżniowej aż objętość wynosi od jednego do pięciu mikrolitrów.Następnie dodaj dwa mikrolitry jednego molowego trietyloamoniowego wodorowęglanu oraz trzy mikrolitry roztworu izocyjanianu fenylo. Inkubuj próbkę z prędkością 350 obrotów na minutę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomieszaczu. Aby powstrzymać derywitazację, dodaj osiem mikrolitrów kwasu trichlorooctowego o stężeniu 1% do każdej probówki.Na koniec rozcieńcz każdą próbkę, dodając 100 mikrolitrów buforu A i ładując rozcieńczone próbki na końcówki stopnia C18 w celu elucii. Ekstrakcję histonów przeprowadzono pomyślnie z świeżo zamrożonych, zamrożonych próbek OCT oraz FFPE, stosując różne procesy przetwarzania specyficzne dla każdego typu tkanki. Pomimo niższego wzbogacenia i obecności białek tła, histony H3, H2A, H2B i H4 zostały pomyślnie wyekstrahowane z próbek FFPE, co pokazują pasma w FFPE1 i FFPE2 Lane'a, odpowiadające około jednemu mikrogramowi standardu H3.1.Nanochromatografia cieczy oraz analiza MS histonów pochodzących z FFPE wykazały skuteczne rozdzielenie peptydów histonowych w gradiencie trwającym 55 minut, z wyraźnymi szczytami czasu retencji widocznymi w chromatogramie całkowitego jonu. Ekstraktowane chromatogramy jonowe potwierdziły wykrywanie i ilościowe określenie niezmodyfikowanych i metylowanych form H3 K 4 z oddzielnymi profilami elutycznymi dla każdej wartości M na Z. Umożliwiając obliczanie procentowej względnej obfitości dla każdej modyfikacji.Analiza porównawcza modyfikacji histonów między próbkami normalnymi a nowotworowymi wykazała istotny wzrost niektórych typów oraz spadek innych typów w tkankach nowotworowych.

extraction-histones-from-clinical-specimens-for-epigenetic-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Poznaj metodę ekstrakcji histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego przy użyciu spektrometrii masowej LC-MS/MS. Ta technika umożliwia ilościowe oznaczenie do 50 modyfikacji posttranslacyjnych histonów z zaledwie 1000 komórek.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów