Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Zakres naszych badań polega na analizie zmian epigenetycznych w próbkach nowotworów, odkrywaniu nowych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych oraz identyfikacji potencjalnego celu leczenia. Dużym wyzwaniem przy próbkach klinicznych jest ograniczony materiał oraz artefakty wywołane fiksacją. Jednak dzięki naszemu zoptymalizowanemu workflow i rozsianemu rozsianemu na DI możemy ilościowo określić do 50 PTM histonów z zaledwie 1000 komórek.

Pokazujemy, że spektrometria mas może ilościowo określać zmiany histonowych PTM w próbce klinicznej, dostarczając wglądu w mechanizmy epigenetyczne oraz umożliwiając odkrywanie markerów biomarkerów i identyfikację celów leków dla precyzyjnych terapii epigenetycznych. Nasz protokół odpowiada na potrzebę solidnego, ilościowego i czułego profilowania histonowego PTM w różnych typach próbek klinicznych. Spektrometria mas jest idealna do analizy PTM histonów, oferując obiektywne wykrywanie, profilowanie jednoczesne oraz współwystępowanie na tym samym peptydzie, co pozwala pokonać ograniczenia metod opartych na przeciwciałach.

Na początek rozmroz świeżo zamrożoną tkankę na lodzie, a skalpelem lub ostrzem wytnij kawałek o masie około 20 do 30 miligramów, odpowiadający około dwóm milimetrom sześciennym tkanki. Przenieś próbkę przeciętej tkanki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Nożyczkami pokrój tkankę na małe kawałki.

Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego buforu izolacyjnego jąder z dodatkiem określonych inhibitorów proteazy i ponownie pokrój tkankę. Przelej próbkę do homogenizatora w dół. Najpierw używając luźnego tłuczka, a potem ciasnego, ujednolicaj tkankę tak, że nie pozostaną widoczne dla gołego oka żadne fragmenty.

Przefiltruj ujednoliconą próbkę przez 100-mikrometrowy filtr komórek, aby wyeliminować zanieczyszczenia tkanki. Pipeta przefiltrowana próbka energicznie w górę i w dół, używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozpuścić błonę plazmatyczną. Przełóż próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Włóż rurkę do wirówki stołowej i obróć w 2 300 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozpylić jądra. Po odrzuceniu supernatantu należy ponownie zawiesić granulat jądrowy w 50 do 100 mikrolitrach buforu izolacyjnego jąder, uzupełnionym 0,1% SDS, aby rozpuścić błonę jądrową. Następnie dodaj 250 jednostek nukleazy benzonazy do próbki zawieszonej w celu trawienia kwasów nukleinowych.

Dobrze wymieszaj i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uzyskać optymalną temperaturę cięcia mrożonych próbek, myj tkanki wodą etanolową i PBS przed rozdrobnieniem i ekstrakcją histonową. Do próbki FFPE dodaj jeden mililitr środka rozpuszczającego parafinę, pobranej w probce o pojemności 1,5 mililitra i z maksymalną prędkością przez 30 sekund, aż parafina całkowicie się rozpuści.

Wiruj próbkę w 16 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucaj supernatant za pomocą pipety z małym końcówką, która omija granulat. Następnie dodaj jeden mililitr 95% etanolu do pelletu i wiru z maksymalną prędkością przez 30 sekund. Wiruj próbkę w 16 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant.

Po ponownym nawodnieniu próbki dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do pelletu. Ujednolicz tkankę w buforze ekstrakcyjnym, forniszczując cyfrowym sygnalifikatorem z mikrokońcówką o średnicy trzech milimetrów. Po homogenizacji inkubuj próbkę w termomieszarce i krótko otwórz pokrywkę probówki, aby odparował formaldehyd.

Po odwirowaniu próbki przelej supernatant do nowej oznaczonej probówki. Wyciąć pasma żelowe odpowiadające masie cząsteczkowej białek histonowych rdzenia mieszczącej się między 10 a 18 kilodaltonami za pomocą skalpela. Po przecięciu gumek żelowych używaj tego samego skalpela, aby przenieść wycięte kawałki żelu do rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Aby zabarwić żel, dodaj roztwór 50% acetonitrylu w wodzie podwójnie destylowanej i inkubuj tubkę w termomieszaku z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwodnij żelowe kawałki, dodając 100% acetonitryl. Mieszaj termomieszarkę z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po wyrzuceniu supernatantu susz kawałki żelu przez pięć minut w temperaturze pokojowej w wirówce próżniowej. Następnie do każdej rurki dodaj 15 mikrolitrów roztworu proponikawodniku 7,7 molowego oraz 26 mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu amonu i inkubuj. Następnie inkubuj próbkę w 80 mikrolitrach jednego trzonowego wodorowęglanu amonu.

Następnie przemywanie kawałków żelu trzy razy podwójnie destylowaną wodą i wyrzucanie płynu po każdej inkubacji. Następnie dodaj 50% acetonu nitrylu do żelowych kawałków i inkubuj z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100% acetonitrylu, żeby całkowicie odwodnić kawałki żelu.

Inkubuj w termomieszarce z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu płynu susz kawałki żelu przez pięć minut w wysokiej temperaturze pokojowej w wirówce próżniowej. Do każdej probówki zawierającej kawałki żelu dodaj cztery mikrolitry roztworu trypsyny i 20 mikrolitrów buforu trawienniczego.

Inkubuj probówki na lodzie przez 10 minut, aby umożliwić wchłanianie trypsyny do żelu. Gdy trypsyna zostanie w pełni wchłonięta, dodaj 80 mikrolitrów buforu trawiennego, aby całkowicie pokryć kawałki żelu, i inkubuj probówki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomieszaku. Aby wyodrębnić strawione peptydy, należy dodać 100 mikrolitrów 100% acetonitrylu do każdej probówki i inkubować z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w termomieszaczu.

Teraz ostrożnie zbierz supernatant i przelej go do nowej rurki o pojemności 1,5 militra. Po powtórzeniu ekstrakcji aceto nitro z pozostałym żelem, zgromadź supernatanty. Skup zgromadzone peptydy w wirówce próżniowej aż objętość wynosi od jednego do pięciu mikrolitrów.

Następnie dodaj dwa mikrolitry jednego molowego trietyloamoniowego wodorowęglanu oraz trzy mikrolitry roztworu izocyjanianu fenylo. Inkubuj próbkę z prędkością 350 obrotów na minutę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomieszaczu. Aby powstrzymać derywitazację, dodaj osiem mikrolitrów kwasu trichlorooctowego o stężeniu 1% do każdej probówki.

Na koniec rozcieńcz każdą próbkę, dodając 100 mikrolitrów buforu A i ładując rozcieńczone próbki na końcówki stopnia C18 w celu elucii. Ekstrakcję histonów przeprowadzono pomyślnie z świeżo zamrożonych, zamrożonych próbek OCT oraz FFPE, stosując różne procesy przetwarzania specyficzne dla każdego typu tkanki. Pomimo niższego wzbogacenia i obecności białek tła, histony H3, H2A, H2B i H4 zostały pomyślnie wyekstrahowane z próbek FFPE, co pokazują pasma w FFPE1 i FFPE2 Lane'a, odpowiadające około jednemu mikrogramowi standardu H3.1.

Nanochromatografia cieczy oraz analiza MS histonów pochodzących z FFPE wykazały skuteczne rozdzielenie peptydów histonowych w gradiencie trwającym 55 minut, z wyraźnymi szczytami czasu retencji widocznymi w chromatogramie całkowitego jonu. Ekstraktowane chromatogramy jonowe potwierdziły wykrywanie i ilościowe określenie niezmodyfikowanych i metylowanych form H3 K 4 z oddzielnymi profilami elutycznymi dla każdej wartości M na Z. Umożliwiając obliczanie procentowej względnej obfitości dla każdej modyfikacji.

Analiza porównawcza modyfikacji histonów między próbkami normalnymi a nowotworowymi wykazała istotny wzrost niektórych typów oraz spadek innych typów w tkankach nowotworowych.