Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach
22 lipca 2025
Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.
Nasze laboratorium bada wzajemne oddziaływanie między porami jądrowymi a organizacją chromatyny. Badamy więc, jak pory jądrowe wpływają na organizację chromatyny, ale także odwrotnie, czy organizacja chromatyny wpływa na funkcję porów jądrowych, zwłaszcza w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Transport nukleocytoplazmatyczny jest bardzo szybkim procesem, dlatego jednym z wyzwań jest wykrycie zmian w dynamice transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach.
Nie ma zbyt wielu narzędzi do monitorowania transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach. Wdrażając częściowo zautomatyzowaną i ulepszoną technikę, mamy nadzieję ułatwić korzystanie z tych narzędzi. Nasz protokół opiera się na głębokim uczeniu.
Ogranicza to błędy i znacznie skraca czas potrzebny na analizę. To, co wcześniej zajmowało dzień, teraz zajmuje tylko godzinę lub dwie. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie FIJI w systemie komputerowym.
Wybierz fazę stabilną jako obraz pierwszy, fazę oświetlenia jako obraz drugi i fazę odzyskiwania jako obraz trzeci. Połącz trzy obrazy reprezentujące trzy fazy, aby uzyskać jeden obraz. Zapisz uzyskany, scalony obraz w celu segmentacji, przechodząc do Plik i wybierając opcję Zapisz jako TIFF.
Następnie podziel kanał mCherry, wybierając Obraz, Kolor i Podziel kanały. Następnie zapisz podzielony obraz, przechodząc do Plik, Zapisz jako i TIFF. Aby sprawdzić, czy podczas akwizycji nie ma wybielania, wybierz kolejno opcje Obraz, Stosy i Profil druku osi Z.
Następnie kliknij Dane, a następnie Kopiuj pierwszy zestaw danych i wklej go do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego w komórce profilu osi Z. Teraz narysuj okrągły obszar zainteresowania, przybliżając średni rozmiar jądra, klikając Analizuj, a następnie Narzędzia i klikając Menedżer ROI. Dodaj ROI i zapisz go, przechodząc do Więcej i klikając Zapisz.
Umieść zapisany zwrot z inwestycji w regionie wolnym od komórek podczas filmu poklatkowego. Upewnij się, że średnia wartość szarości" jest wybrana w obszarze Analizuj i ustaw pomiary. Następnie kliknij Więcej, Multi Measure.
Zaznacz Zmierz wszystkie 50 plasterków"i Jeden zwrot z inwestycji na plasterek"i kliknij OK, aby zarejestrować intensywność. Skopiuj i wklej wszystkie zmierzone wartości intensywności do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego w komórce tła ROI. Następnie zamknij obraz tylko z kanałem mCherry i wybierz zapisany obraz ze scalonymi kanałami.
Teraz otwórz wtyczkę TrackMate, klikając kolejno Wtyczki, Śledzenie i TrackMate. Upewnij się, że punkty czasowe mieszczą się w zakresie od zera do 49, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz detektor StarDist i kliknij przycisk Dalej.
Wybierz kanał drugi, SiR-DNA, do segmentacji jąder i poczekaj na zakończenie procesu. Pozostaw parametry domyślne w oknie progowania i kliknij przycisk Dalej. Utwórz filtry za pomocą Średnia intensywność, Kanał pierwszy, aby wykluczyć jądra o ekstremalnych wartościach sygnału.
Utwórz jeden filtr, aby wybrać wartości powyżej zdefiniowanego progu, a drugi, aby wybrać wartości poniżej progu. Podobnie dodaj dwa filtry obszarowe, aby usunąć zanieczyszczenia lub umierające komórki i kliknij Dalej. Wybierz Prosty tracker LAP i kliknij Dalej.
Następnie dostosuj parametry śledzenia. Ustaw maksymalną odległość łączenia "na 30 mikrometrów", maksymalną odległość zamykania przerwy "na 15 mikrometrów i maksymalną przerwę zamykania ramki" na trzy. Następnie kliknij przycisk Dalej.
Po obliczeniach kliknij Dalej, aby ustawić filtry na ścieżkach. Aby wybrać tylko te jądra, które były śledzone w całym przebiegu czasu, wybierz największą liczbę punktów na ścieżce i kliknij przycisk Dalej. Następnie zaznacz opcję Wyświetl nazwy miejsc"aby prześledzić każde jądro w dalszych analizach i dostosować inne funkcje wyświetlania zgodnie z preferencjami.
Na dole strony kliknij Ścieżki i wybierz Eksportuj do CSV", aby zapisać tabelę pomiarów. Zamknij tabelę i kontynuuj, klikając przycisk Dalej. Teraz kliknij Przechwyć nakładkę"jako akcję, a następnie naciśnij Wykonaj, a następnie OK, aby wygenerować obraz ze śledzonymi jądrami.
Zapisz obraz, klikając kolejno Plik, Zapisz jako i wybierając TIFF. Aby zaimportować plik CSV TrackMate do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego, kliknij kartę Dane. W obszarze Pobierz dane transformacji"grupa kliknij Z tekstu/CSV" i kliknij Importuj.
Skopiuj kolumnę Spot IDB, Track IDC, Frame I i mean intensity Channel 1M, a następnie wklej do kolumn od A do D dostarczonego arkusza kalkulacyjnego. Posortuj wyniki alfabetycznie najpierw według identyfikatora ścieżki, pojedynczego jądra, z komórki B5, a następnie według klatki, punktu czasowego, od komórki C5. Teraz otwórz GraphPad Prism, utwórz nowy arkusz i skopiuj i wklej kolumnę czasu z arkusza kalkulacyjnego. Następnie wklej wartości uzyskane jako względna intensywność jądrowa w tabeli GraphPad Prism.
Aby wygenerować wykres względnej intensywności jądrowej, przejdź do sekcji Wykres i wybierz XY jako rodzinę wykresów. Następnie wybierz Punkty i linia łącząca ze słupkami błędów"jako typ wykresu. W ustawieniach wydruku wybierz opcję Średnia i błąd" oraz SEM, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie, aby uzyskać szybkość eksportu, kliknij na Nowa tabela danych i wprowadź czasy w ułamkach dziesiętnych tylko dla faz stabilnych i oświetlenia.
Wklej do tabeli wartości uzyskane jako względna intensywność jądrowa dla tych faz. W sekcji Wyniki kliknij Analiza XY, a następnie Wykładnicza. Następnie wybierz opcję Regresja nieliniowa i kliknij przycisk OK. Wybierz Plateau, a następnie jeden zanik fazy"jako model pod parametrami.
Następnie wybierz stałą równą 2,25 jako X0, stałą równą jeden jako Y0 i stałą równą zero dla plateau. Wskaż, że K powinno być większe od zera i naciśnij OK. Utwórz nową tabelę i wklej i przetransponuj uzyskane wartości K. W sekcji Wykres wybierz opcję Kolumna jako rodzinę wykresów, a następnie wybierz wykres skrzypcowy jako typ wykresu.
Wybierz Pokaż wszystkie punkty" jako wykres i kliknij OK. Eksport jądrowy za pomocą leksyki sondy optogenetycznej został zwizualizowany w obrazowaniu żywych komórek. W warunkach kontrolnych z komórkami traktowanymi metanolem, intensywność jądrowej mCherry gwałtownie spadła po podświetleniu światłem niebieskim, po czym nastąpiła stopniowa regeneracja w fazie po oświetleniu. Leczenie inhibitorem eksportu, leptomycyną B, spowodowało zmianę w eksporcie jądrowym, ponieważ sygnał sondy pozostał niezmiennie jądrowy we wszystkich punktach czasowych.
Analiza ilościowa względnej intensywności jądra wykazała z biegiem czasu powolny spadek, aż do osiągnięcia plateau pod koniec fazy oświetlenia. Pośrednie stężenia leptomycyny B powinny wykazywać łagodny eksport jądrowy. Wskaźniki eksportu obliczone na podstawie danych dotyczących intensywności potwierdziły znacznie wyższy wskaźnik eksportu w komórkach poddanych działaniu metanolu, znacznie niższy wskaźnik w przypadku 0,5 nanomolowej leptomycyny B i prawie brak eksportu w przypadku jednej nanomolowej leptomycyny B.
Przegląd
Ten protokół opisuje wydajne ustawienie i wykonanie zautomatyzowanych analiz danych z obrazowania komórek żywych, koncentrując się na procesie transportu nukleocytoplazmatycznego. Zastosowanie narzędzi optogenetycznych w tej metodologii zapewnia wgląd w mechanizmy transportu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Obrazowание komórek żywych
- Transport nukleocytoplazmatyczny
Tło
- Znaczenie badania transportu nukleocytoplazmatycznego
- Zastosowanie narzędzi optogenetycznych w badaniach komórkowych
- Wyzwania w analizie obrazowania komórek żywych
Stosowane metody
- Techniki zautomatyzowanej analizy
- Systemy obrazowania komórek żywych
- Manipulacja optogenetyczna
Główne wyniki
- Poprawiona efektywność analizy dynamiki transportu komórkowego
- Wykazana użyteczność narzędzi optogenetycznych w śledzeniu procesów
- Istotne odkrycia dotyczące mechanizmów transportu komórkowego
Wnioski
- To badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy transportu nukleocytoplazmatycznego.
- Odkrycia mają zastosowanie do zrozumienia mechanizmów komórkowych w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport (NCT) dynamics is critical for understanding cellular homeostasis and disease mechanisms relevant to neurodegeneration. The integration of LEXY and LINuS optogenetic probes with automated image analysis enables high-throughput, reproducible measurement of NCT in live cells, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This workflow enhances portfolio decision-making by providing scalable, standardized data on transport mechanisms implicated in disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nucleocytoplasmic transport as a disease-relevant pathway.
- Supports functional target validation by quantifying transport kinetics in live cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through reversible, optogenetic control of nuclear import and export.
- Provides predictive confidence for triaging targets linked to neurodegenerative disorders.
Screening & Assay Development
- Establishes stable cell lines for reproducible, scalable NCT assays.
- Automated image analysis increases throughput and reduces user-dependent variability.
- Quantitative readouts enable robust comparison of compound or genetic perturbations.
- Accessible analysis pipeline supports assay standardization across teams.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling live-cell measurement of transport defects.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in neurodegeneration research.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement decisions.
- Facilitates biomarker development by linking transport dynamics to cellular phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-content, quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport in live cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for NCT-related targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides automated, scalable measurements of nuclear-cytoplasmic signal ratios.
- Translational Research: Connects cellular transport phenotypes to disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, accessible workflow adaptable to diverse cell systems and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NCT studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of live-cell assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models in neurodegeneration pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and optogenetic probe handling.
- Needs access to fluorescence microscopy and FIJI-based image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters.
- Adaptable to various cell lines and experimental conditions with protocol modifications.
- Throughput may be limited by imaging speed and cell line generation timelines.
