Name: Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach przy użyciu narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy ośrodku obrazowania MRI, należącemu do krajowej infrastruktury France-BioImaging (https://ror.org/01y7vt929), wspieranemu przez francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN), a w szczególności Marie-Pierre Blanchard, Julio Mateos-Langerak i Baptiste Monterroso za ich pomoc w ustawieniach mikroskopu i analizach FIDŻI. Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Boumendil za ich rady i owocne dyskusje, a w szczególności Parisie Nobari za pomoc w rozpoczęciu projektu. Dziękujemy Joeyowi Dufourdowi za korektę manuskryptu.
Prace w grupie CB są wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National du Cancer (Francuski Narodowy Instytut Raka) / Canceropole Grand Sud-Ouest (Grant Emergence 2023 E07), Agence Nationale pour la recherche (ANR-23-TERC-0015-01 i ANR-21-CE12-0039), Institut National du Cancer (Grant INCa PLBIO23-207-2023-180) oraz Uniwersytet w Montpellier (program I-SITE, Francja 2030, projekt NAChO, projekt ChOICe).

<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).</li>
<li>Beyer, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+light-regulated+reversible+nuclear+localization+of+proteins+in+mammalian+cells+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).</li>
<li>Niopek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-inducible+nuclear+localization+signals+for+precise+spatiotemporal+control+of+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells.</a> Nat Commun. 5, 4404(2014).</li>
<li>Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+export%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein export.</a> Nat Commun. 7, 10624(2016).</li>
<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt%2C+U+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention+-+MICCAI+2018%22">Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018</a>. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).</li>
<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nat Commun. 6, 8497(2015).</li>
<li>Kudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomycin+B+inactivates+CRM1%2Fexportin+1+by+covalent+modification+at+a+cysteine+residue+in+the+central+conserved+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).</li>
<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
<li>Kögler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jak wspomniano w protokole, stworzenie stabilnych linii komórkowych znacznie poprawia jakość analiz. Po pierwsze, posiadanie 100% komórek wykazujących ekspresję sond zwiększa liczbę śledzonych i analizowanych jąder, co wzmacnia solidność analiz. Po drugie, zmniejsza śmierć komórek wywołaną nadekspresją sond i toksycznością zastosowanych odczynników do transfekcji. I wreszcie, zmniejsza silną niejednorodność sygnałów fluorescencyjnych między komórkami. Ten parametr jest istotny, ponieważ nasycony sygnał nie pozwoli na prawidłowe wykrycie zmiany intensywności po naświetleniu. Ten sam wniosek dotyczy słabych sygnałów, które mogą wybielić lub nie pozwolić na ilościowe określenie różnic. Dlatego zalecamy najpierw przetestowanie sond przez transfekcję, aby upewnić się, że działają prawidłowo, ustawienie parametrów akwizycji, a następnie szybkie utworzenie stabilnych linii komórkowych. Stworzyliśmy wektory lentiwirusowe zarówno dla sond LEXY, jak i LINuS, które są dostępne do udostępnienia na żądanie, a także stabilne linie NIH/3T3 LEXY lub LINuS utworzone za pomocą tych lentiwirusów.
Jeśli sondy są transfekowane lub jeśli komórki są rzadkie, sugerowane parametry prawdopodobnie zmniejszą liczbę wykrywanych ścieżek, a analizy będą mniej wiarygodne. W takim przypadku użytkownicy mogą być bardziej pobłażliwi w stosunku do miejsc pominiętych w śledzeniu, zmniejszając filtr Liczba miejsc w utworach (sugerujemy pozostawienie co najmniej 45 z 50 miejsc). Uwaga: jeśli ten filtr zostanie zmniejszony, dostarczony plik Excel (tabela uzupełniająca S1) powinien zostać ręcznie dostosowany: w rzeczywistości wartości wklejone z zaimportowanego pliku CSV nie będą uwzględniać luk. Użytkownik musi znaleźć brakujące miejsca z numerem TrackID i skorelować je z numerem jądra, co zwykle zajmuje kilka rund kopiowania i wklejania.
Krytycznym parametrem gwarantującym powodzenie eksperymentu jest utrzymywanie komórek w ciemności. Ponieważ sondy reagują na niebieskie światło, użytkownicy muszą zapewnić transport komórek w ciemności przez co najmniej 30 minut przed akwizycją. Wystarczy małe zamknięte pudełko lub użycie aluminium do przykrycia naczynia. Podobnie, należy być bardzo ostrożnym, aby używać światła mCherry tylko do wyszukiwania komórek pod mikroskopem, ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje komórki. Jeśli ewentualne oświetlenie nastąpi pod mikroskopem, poszukaj innego odległego pola do akwizycji. Wykreślenie profilu osi Z w kroku 3.6 pomoże dowiedzieć się, czy na komórki wpłynęło oświetlenie, czy krzywa maleje, a nie jest płaskowyżem.
Sekwencja obrazowania składa się z trzech faz. Po pierwsze, faza stabilna, mająca na celu ocenę potencjalnego bielenia, ale także upewnienie się, że lokalizacja LEXY jest stała bez aktywacji (1). Po drugie, faza aktywacji, składająca się z rund pulsacyjnego oświetlenia światłem niebieskim, w celu wywołania translokacji LEXY z jądra do cytozolu (2). Wreszcie opcjonalna faza odzyskiwania, w której sygnał stopniowo wraca do swojego początkowego położenia w jądrze (3).
Sekwencja opisana dla akwizycji może być specyficzna dla typu komórki19,20. W pierwszym eksperymencie użytkownik powinien przetestować i zmodyfikować moc lasera i czasy, aby zobaczyć, jak system stopniowo przemieszcza się między jądrem a cytozolem. Co ważne, zbyt silna moc lasera, jako zbyt krótka przerwa, może uniemożliwić zobaczenie postępującej translokacji, ale zamiast tego brutalnego spadku/wzbogacenia (w zależności od użytej sondy) intensywności mCherry po oświetleniu.
Jeśli optymalizacja sekwencji nie rozwiąże problemu, prawdopodobnie NES i/lub NLS nie są odpowiednie dla używanego typu komórki. Użytkownicy mogą zapoznać się z artykułem8 metody LINuS, aby zaprojektować i zmodyfikować sondy. Użytkownicy mogą również zapoznać się z tym artykułem, aby uzyskać informacje na temat obrazowania LINuS za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
Segmentacja jąder jest krytycznym etapem analizy. Do obrazowania żywych komórek sond należy użyć solidnego i niezawodnego markera jądrowego. Ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje translokację sondy, a sondy są monitorowane za pomocą białka fluorescencyjnego mCherry, marker ten musi być widoczny w widmie dalekiej czerwieni lub blisko. W naszym przypadku używamy SiR-DNA, które barwi komórki podczas 1 do ~24 h inkubacji, ale użycie SPY-DNA 650 jest również opcją (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania referencji).
Wreszcie, jeśli segmentacja za pomocą StarDist w połączeniu z filtrowanym śledzeniem TrackMate udowodni swoją skuteczność, ważne jest, aby pamiętać, że użytkownik powinien zawsze wizualnie sprawdzić wyniki segmentacji i kwantyfikacji. Dzieląca się lub umierająca komórka może być uwzględniona w ocenie ilościowej, podczas gdy nie powinna. Aby zmniejszyć ryzyko analizy takich zdarzeń, dostarczony arkusz Excela przypisuje kod kolorystyczny względnej intensywności jądrowej (niebieski = niskie wartości, czerwony = wysokie wartości). Sprawdzając kolory przed wykreśleniem wartości w GraphPad Prism, użytkownik powinien być w stanie zauważyć wszelkie nietypowe wartości. Na przykład, względne intensywności jądrowe LEXY powinny wahać się od wysokich (czerwony, duże ilości sondy w jądrach) w fazie stabilnej do niskiej (niebieski, zmniejszona ilość sondy w jądrach) pod koniec fazy oświetlenia, zanim powrócą do wysokich wartości (czerwony), w fazie regeneracji (jak pokazano w tabeli uzupełniającej S2).
Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z poprzednio proponowanymi metodami 5,6. Półautomatyczny potok ułatwia analizę transportu nukleocytoplazmatycznego LEXY i LINuS i zapewnia większą dokładność niż wcześniej proponowana ręczna kwantyfikacja 5,6. Korzystanie z naszego protokołu umożliwi początkującym w tej dziedzinie wykonywanie wydajnych analiz, ale także zapewni nowe narzędzie dla doświadczonych użytkowników, którzy będą potrzebować tylko jednego otwartego interfejsu do wykonywania półautomatycznych analiz transportu nukleocytoplazmatycznego.
Metoda ta może być wykorzystana do dalszych zastosowań niż badanie globalnego tempa transportu nukleocytoplazmatycznego w liniach komórkowych NIH3T3. Rzeczywiście, dzięki kilku krokom optymalizacji można go dostosować do badania szybkości transportu sondy w różnych typach komórek lub żywych zwierzętach8. Co więcej, poprzez fuzję białka będącego przedmiotem zainteresowania LEXY lub LINuS, możliwe jest również zbadanie jego szybkości transportu lub dalszych skutków jego indukowanej światłem translokacji do jądra lub z niego. Na przykład możliwe jest sekwestrowanie białka w cytoplazmie za pomocą LEXY lub wymuszenie jego lokalizacji w jądrze za pomocą LINuS 5,6,21,22,23. Wreszcie, opisane analizy można również rozszerzyć na więcej zastosowań niż LEXY i LINuS, aby śledzić dowolny sygnał, który przemieszcza się między przedziałami subkomórkowymi, które można podzielić.

Znaczenie transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT) w regulacji kluczowych szlaków komórkowych i utrzymaniu homeostazy komórkowej było przedmiotem intensywnych badań w ostatnich latach1. W konsekwencji opracowano szereg narzędzi do badania dynamiki NCT2,3,4. Wśród tych narzędzi sondy optogenetyczne LINuS5 oraz LEXY6, opisane odpowiednio w 2014 i 2016 roku, stanowią potężną metodę monitorowania NCT w żywych komórkach. Narzędzia te, zaprojektowane do śledzenia indukowalnego eksportu (LEXY) lub importu (LINuS) fluorescencyjnego reportera, są odwracalne i aktywowane pod wpływem światła niebieskiego.
Krótko mówiąc, te dwie małe sondy wykorzystują właściwości domeny LOV2 białka fototropiny-1 rośliny Avena sativa7. W absence niebieskiego światła helisa Jα z domeny LOV2 jest fotoklatkowana i osadzona w rdzeniu białka. Ponieważ helisa Jα może reagować na bodziec świetlny, naświetlanie światłem niebieskim indukuje zmianę konformacyjną i następcze odłączenie helisy Jα od domeny LOV2. Autorzy LEXY i LINuS wykorzystali tę światłoczułość do połączenia sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) lub sygnału eksportu jądrowego (NES) z helisą Jα, odpowiednio dla LINuS i LEXY (Rysunek 1). Powstałym narzędziem jest sonda, która po naświetleniu światłem niebieskim translokuje do jądra (LINuS) lub cytozolu (LEXY).
Aby śledzić sondy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, do konstruktów dodano również reporter fluorescencyjny mCherry. Na koniec do układu dodano słaby sygnał NES (dla LINuS) lub NLS (dla LEXY), aby upewnić się, że sondy nie znajdowały się w swojej końcowej lokalizacji przed naświetleniem niebieskim światłem, co zapobiegłoby obserwacji translokacji LEXY lub LINuS między jądrem a cytosolem.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Przedstawienie sond LEXY i LINuS. Obie sondy składają się z białka mCherry połączonego z światłoczułą domeną LOV2. Różnica między tymi dwoma narzędziami polega na sekwencji sygnałowej ukrytej przez helisę Jα: NES w przypadku LEXY oraz NLS w przypadku LINuS. Obie sondy posiadają również słaby sygnał sekwencyjny w celu kontroli ich początkowej lokalizacji: słaby NLS dla LEXY i słaby NES dla LINuS. Aktywacja systemów poprzez naświetlanie światłem niebieskim indukuje zatem ich eksport w przypadku LEXY lub import w przypadku LINuS, co pozwala użytkownikom na monitorowanie eksportu lub importu jądrowego. Skróty: LEXY = system indukowanego światłem eksportu jądrowego; LINuS = indukowany światłem sygnał lokalizacji jądrowej; NLS = sygnał lokalizacji jądrowej; NES = sygnał eksportu jądrowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Lokalizacja fluorescencji mCherry informuje o przemieszczaniu się sond LEXY i LINuS pomiędzy jądrami a cytozolem, co pozwala na ich śledzenie w obrazowaniu żywych komórek, umożliwiając użytkownikom monitorowanie NCT. Poza zastosowaniem w charakterze prostych sond, LEXY i LINuS mogą być również modyfikowane w celu kontrolowania lokalizacji i badania białek docelowych in vitro5,6,8,9 lub in vivo10,11.
Metoda ilościowa zaproponowana w publikacjach LEXY i LINuS wykazuje względną intensywność sond w jądrach komórkowych. Sugerowana analiza jest wykonywana ręcznie i opiera się na pomiarze obszaru zainteresowania (ROI) w jądrze oraz w cytozolu. Chociaż metoda ta daje dobre odwzorowanie sygnału sondy w czasie, jest ona bardzo czasochłonna i żmudna, szczególnie w przypadku powtarzania eksperymentów i warunków. Co istotne, metoda ta cechuje się również niską dokładnością, ponieważ reprezentowany jest jedynie niewielki fragment wyznaczonego przedziału komórkowego.
W niniejszej pracy proponujemy nowy protokół ilościowego oznaczania sygnału fluorescencyjnego dla LEXY i LINuS. Wdrożyliśmy techniki zautomatyzowane, które ułatwiają analizy i zapewniają większą dokładność. Uprości to proces dla nowych użytkowników tych narzędzi i pomoże zwiększyć przepustowość. Nasz protokół ilościowy wykorzystuje tylko jeden interfejs – wtyczkę TrackMate12 programu FIJI o otwartym kodzie źródłowym. W celu zwiększenia niezawodności pomiarów zastosowaliśmy kompatybilny z obrazowaniem na żywo dalekoczerwony marker DNA do segmentacji całych jąder komórkowych za pomocą StarDist13, wyszkolonej splotowej sieci neuronowej, w połączeniu ze śledzeniem i pomiarem sygnału fluorescencyjnego sondy za pomocą TrackMate12.
Uzyskane dane można następnie łatwo wyeksportować do dołączonego, gotowego do użycia arkusza kalkulacyjnego (Tabela uzupełniająca S1), aby obliczyć względną intensywność jądrową każdego zidentyfikowanego jądra. Protokół ten wyjaśnia również, jak zestawić uzyskane wartości na wykresie poprzez dopasowanie otrzymanej krzywej przebiegu czasowego do modelu monoeksponencjalnego, zgodnie z metodą Yoo i Mitchison14, a także jak obliczyć szybkość transportu dla różnych testowanych warunków. Dzięki temu protokołowi oraz dostarczonemu arkuszowi analitycznemu użytkownicy będą mogli łatwo kwantyfikować dane z obrazowania żywych komórek, nawet przy ograniczonych umiejętnościach bioinformatycznych.

<table><tbody><tr><td>Kolagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>LEICA (Dziennik LEICA</td><td>Dodatek SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (DMEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Programu excel</td><td>Firmy Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sieć Usługowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F1141 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FIDŻI</td><td>FIDŻI</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Fluorodiaki</td><td>Holender</td><td>FD3510-100</td><td>Alternatywa: Komora Attofluorowa (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>Pryzmat GraphPad 10.4.1</td><td>Oprogramowanie GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid LEXY</td><td>Addgene powiedział:</td><td>72655</td><td>pDN122 powiedział:</td></tr><tr><td>Plazmid LINuS</td><td>Addgene powiedział:</td><td>61347</td><td>pDN77 powiedział:</td></tr><tr><td>Ołówek-Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA (Gwiezdne DNA)</td><td>Spirochrom</td><td>Zobacz materiał SC007</td><td>Alternatywa: SPY-DNA650 (Spirochrom #SC501)</td></tr><tr><td>Wtyczka Stardist 2D</td><td>StarDist (Rozkład gwiazdy)</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>Wtyczka TrackMate</td><td>Kolega z toru</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie narzędzi optogenetycznych lexy i linus oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

Transport nukleocytoplazmatyczny (NCT) jest niezbędny do utrzymania homeostazy komórkowej, a jego zakłócenie jest związane z różnymi chorobami, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i stwardnieniem zanikowym bocznym. Podkreśla to potrzebę opracowania narzędzi do monitorowania i ilościowego określania NCT. Wśród tych narzędzi znajdują się szybkie i odwracalne sondy optogenetyczne LEXY (Light-inducible nuclear export system) i LINuS (Light-inducible nuclear localization signal), które umożliwiają pomiar dynamiki NCT w żywych komórkach.
Oryginalne publikacje opisują manualną segmentację i kwantyfikację sygnału sondy fluorescencyjnej w jądrze i cytozolu po transfekcji konstruktów LEXY i LINuS w obrazowaniu żywych komórek. Jednak zarówno transfekcja, jak i ręczna segmentacja ograniczają liczbę komórek, które można analizować i są narażone na nieprecyzyjność z powodu potencjalnych błędów zależnych od użytkownika. Podczas gdy duża szybkość i odwracalność zapewniana przez optogenetykę powinna w zasadzie pozwolić na wysoką czułość w wykrywaniu zmian w dynamice NCT, zależy to od parametrów akwizycji i analizy wystarczającej liczby komórek.
W związku z tym ustaliliśmy wektory lentiwirusowe wykazujące ekspresję LEXY i LINuS w celu stworzenia stabilnych linii komórkowych, przetestowaliśmy markery obrazowania na żywo i warunki kontrolne oraz wdrożyliśmy półautomatyczny potok analizy obrazu, który pozwala na analizę setek komórek. Ta metoda analizy wykorzystuje ogólnodostępne oprogramowanie FIJI, jest dostępna dla początkujących bioinformatyków i nie wymaga zaawansowanej konfiguracji komputera. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół konfiguracji LEXY jako przykład tych narzędzi optogenetycznych do monitorowania eksportu jądrowego, od przygotowania próbek po akwizycję obrazowania żywych komórek i automatyczną analizę, pokazując jednocześnie, jak dostosować protokół do innych warunków, kontroli lub modeli w dowolnym laboratorium. Wszystkie plazmidy i linie komórkowe wykorzystane w tym protokole zostaną udostępnione społeczności naukowej, co jeszcze bardziej zwiększy dostępność metody.

Powyższy protokół powinien umożliwić użytkownikom wizualizację lokalizacji i translokacji sondy podczas obrazowania żywych komórek. Przykład oczekiwanych obrazów uzyskanych w celu wizualizacji eksportu jądrowego z użyciem LEXY przedstawiono na Rysunku 4. Po kilku cyklach naświetlania światłem niebieskim powinien być obserwowany szybki spadek sygnału z jądra oraz jego wzbogacenie w cytosolu. Po przerwaniu cykli naświetlania może być widoczna stopniowa regeneracja sygnału sondy. W celu kontroli systemu zastosowano Leptomycynę B, inhibitor eksportu, która potwierdza, że zmiany w eksporcie można wizualizować za pomocą przeprowadzonych analiz, ponieważ zapobiega ona eksportowi LEXY po naświetlaniu światłem niebieskim (Rysunek 4).
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Wizualizacja sygnału LEXY w czasie. Obrazy reprezentatywnych punktów czasowych fazy stabilnej, naświetlania i regeneracji, uzyskane za pomocą obrazowania żywych komórek. Warunki z metanolem reprezentują grupę kontrolną. Po pulsacyjnym naświetlaniu światłem niebieskim, sygnał fluorescencyjny mCherry (zaznaczony na czerwono), będący reporterem lokalizacji LEXY, ulega translokacji z jądra do cytozolu. Po zaprzestaniu naświetlania sygnał powraca do jądra. Leczenie inhibitorem eksportu Leptomycyną B w stężeniu 1 nM lub 0,5 nM wykazuje brak lub zmniejszenie eksportu LEXY w przypadku zablokowania tego procesu. Pasek skali = 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W odniesieniu do analiz, podczas gdy wartości krzywej względnej intensywności jądrowej w fazie stabilnej powinny wynosić około 1, po aktywacji światłem niebieskim powinny one wykazywać powolny spadek aż do osiągnięcia plateau pod koniec fazy naświetlania (Rysunek 5A). Jeśli spadek jest zbyt szybki lub zbyt wolny, można zoptymalizować parametry akwizycji (patrz dyskusja). Leczenie Leptomycyną B w wystarczających stężeniach może również potwierdzić, że analizy i technika są wystarczająco czułe, aby wykazać całkowite zablokowanie eksportu jądrowego, przy czym wartości względnej intensywności jądrowej pozostają stabilne na poziomie około 1 przez cały eksperyment. Natomiast pośrednie stężenia Leptomycyny B powinny wykazywać łagodny eksport jądrowy (Rysunek 5A). Obserwacje wizualne te powinny zostać potwierdzone ilościowo poprzez wyznaczenie szybkości eksportu (Rysunek 5B).
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Oczekiwana względna intensywność jądrowa LEXY oraz szybkość transportu. (A) Wykres przedstawia względną intensywność jądrową sygnału fluorescencyjnego LEXY w czasie, znormalizowaną do średniej intensywności mCherry w fazie stabilnej. Względna intensywność jądrowa w warunkach z metanolem (kontrola, czerwony) spada o połowę po naświetleniu, w przeciwieństwie do komórek traktowanych inhibitorem eksportu Leptomycin B w stężeniu 0,5 nM (jasnoniebieski) lub 1 nM (ciemnoniebieski). Słupki błędu: SEM. (B) Szybkość eksportu w warunkach kontrolnych oraz z Leptomycin B, uzyskana poprzez dopasowanie krzywej do modelu monoeksponencjalnego. Wartości uzyskane przy zablokowaniu eksportu przez Leptomycin B są znacznie niższe niż w warunkach kontrolnych. N = 18 komórek dla metanolu (czerwony), 19 komórek dla Leptomycin B 0,5 nM (jasnoniebieski) i 15 komórek dla Leptomycin B 1 nM (ciemnoniebieski). Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego testu t Welcha. ***: P &#60; 1×10−4, ****: P &#60; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Arkusz kalkulacyjny z predefiniowanymi obliczeniami. Arkusz ten został udostępniony w celu ułatwienia analizy. Wartości intensywności uzyskane za pomocą TrackMate można bezpośrednio skopiować i wkleić do arkusza, aby otrzymać znormalizowane wartości względnej intensywności jądrowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S2: Przykład oczekiwanych wyników dla warunku kontrolnego w analizie LEXY. Arkusz kalkulacyjny przedstawia przykład uzyskanych wartości dla warunku kontrolnego stabilnej linii komórkowej LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Nasze laboratorium bada wzajemne oddziaływanie między porami jądrowymi a organizacją chromatyny. Badamy więc, jak pory jądrowe wpływają na organizację chromatyny, ale także odwrotnie, czy organizacja chromatyny wpływa na funkcję porów jądrowych, zwłaszcza w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Transport nukleocytoplazmatyczny jest bardzo szybkim procesem, dlatego jednym z wyzwań jest wykrycie zmian w dynamice transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach.Nie ma zbyt wielu narzędzi do monitorowania transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach. Wdrażając częściowo zautomatyzowaną i ulepszoną technikę, mamy nadzieję ułatwić korzystanie z tych narzędzi. Nasz protokół opiera się na głębokim uczeniu.Ogranicza to błędy i znacznie skraca czas potrzebny na analizę. To, co wcześniej zajmowało dzień, teraz zajmuje tylko godzinę lub dwie. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie FIJI w systemie komputerowym.Wybierz fazę stabilną jako obraz pierwszy, fazę oświetlenia jako obraz drugi i fazę odzyskiwania jako obraz trzeci. Połącz trzy obrazy reprezentujące trzy fazy, aby uzyskać jeden obraz. Zapisz uzyskany, scalony obraz w celu segmentacji, przechodząc do Plik i wybierając opcję Zapisz jako TIFF.Następnie podziel kanał mCherry, wybierając Obraz, Kolor i Podziel kanały. Następnie zapisz podzielony obraz, przechodząc do Plik, Zapisz jako i TIFF. Aby sprawdzić, czy podczas akwizycji nie ma wybielania, wybierz kolejno opcje Obraz, Stosy i Profil druku osi Z.Następnie kliknij Dane, a następnie Kopiuj pierwszy zestaw danych i wklej go do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego w komórce profilu osi Z. Teraz narysuj okrągły obszar zainteresowania, przybliżając średni rozmiar jądra, klikając Analizuj, a następnie Narzędzia i klikając Menedżer ROI. Dodaj ROI i zapisz go, przechodząc do Więcej i klikając Zapisz.Umieść zapisany zwrot z inwestycji w regionie wolnym od komórek podczas filmu poklatkowego. Upewnij się, że średnia wartość szarości" jest wybrana w obszarze Analizuj i ustaw pomiary. Następnie kliknij Więcej, Multi Measure.Zaznacz Zmierz wszystkie 50 plasterków"i Jeden zwrot z inwestycji na plasterek"i kliknij OK, aby zarejestrować intensywność. Skopiuj i wklej wszystkie zmierzone wartości intensywności do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego w komórce tła ROI. Następnie zamknij obraz tylko z kanałem mCherry i wybierz zapisany obraz ze scalonymi kanałami.Teraz otwórz wtyczkę TrackMate, klikając kolejno Wtyczki, Śledzenie i TrackMate. Upewnij się, że punkty czasowe mieszczą się w zakresie od zera do 49, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz detektor StarDist i kliknij przycisk Dalej.Wybierz kanał drugi, SiR-DNA, do segmentacji jąder i poczekaj na zakończenie procesu. Pozostaw parametry domyślne w oknie progowania i kliknij przycisk Dalej. Utwórz filtry za pomocą Średnia intensywność, Kanał pierwszy, aby wykluczyć jądra o ekstremalnych wartościach sygnału.Utwórz jeden filtr, aby wybrać wartości powyżej zdefiniowanego progu, a drugi, aby wybrać wartości poniżej progu. Podobnie dodaj dwa filtry obszarowe, aby usunąć zanieczyszczenia lub umierające komórki i kliknij Dalej. Wybierz Prosty tracker LAP i kliknij Dalej.Następnie dostosuj parametry śledzenia. Ustaw maksymalną odległość łączenia "na 30 mikrometrów", maksymalną odległość zamykania przerwy "na 15 mikrometrów i maksymalną przerwę zamykania ramki" na trzy. Następnie kliknij przycisk Dalej.Po obliczeniach kliknij Dalej, aby ustawić filtry na ścieżkach. Aby wybrać tylko te jądra, które były śledzone w całym przebiegu czasu, wybierz największą liczbę punktów na ścieżce i kliknij przycisk Dalej. Następnie zaznacz opcję Wyświetl nazwy miejsc"aby prześledzić każde jądro w dalszych analizach i dostosować inne funkcje wyświetlania zgodnie z preferencjami.Na dole strony kliknij Ścieżki i wybierz Eksportuj do CSV", aby zapisać tabelę pomiarów. Zamknij tabelę i kontynuuj, klikając przycisk Dalej. Teraz kliknij Przechwyć nakładkę"jako akcję, a następnie naciśnij Wykonaj, a następnie OK, aby wygenerować obraz ze śledzonymi jądrami.Zapisz obraz, klikając kolejno Plik, Zapisz jako i wybierając TIFF. Aby zaimportować plik CSV TrackMate do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego, kliknij kartę Dane. W obszarze Pobierz dane transformacji"grupa kliknij Z tekstu/CSV" i kliknij Importuj.Skopiuj kolumnę Spot IDB, Track IDC, Frame I i mean intensity Channel 1M, a następnie wklej do kolumn od A do D dostarczonego arkusza kalkulacyjnego. Posortuj wyniki alfabetycznie najpierw według identyfikatora ścieżki, pojedynczego jądra, z komórki B5, a następnie według klatki, punktu czasowego, od komórki C5. Teraz otwórz GraphPad Prism, utwórz nowy arkusz i skopiuj i wklej kolumnę czasu z arkusza kalkulacyjnego. Następnie wklej wartości uzyskane jako względna intensywność jądrowa w tabeli GraphPad Prism.Aby wygenerować wykres względnej intensywności jądrowej, przejdź do sekcji Wykres i wybierz XY jako rodzinę wykresów. Następnie wybierz Punkty i linia łącząca ze słupkami błędów"jako typ wykresu. W ustawieniach wydruku wybierz opcję Średnia i błąd" oraz SEM, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie, aby uzyskać szybkość eksportu, kliknij na Nowa tabela danych i wprowadź czasy w ułamkach dziesiętnych tylko dla faz stabilnych i oświetlenia.Wklej do tabeli wartości uzyskane jako względna intensywność jądrowa dla tych faz. W sekcji Wyniki kliknij Analiza XY, a następnie Wykładnicza. Następnie wybierz opcję Regresja nieliniowa i kliknij przycisk OK. Wybierz Plateau, a następnie jeden zanik fazy"jako model pod parametrami.Następnie wybierz stałą równą 2,25 jako X0, stałą równą jeden jako Y0 i stałą równą zero dla plateau. Wskaż, że K powinno być większe od zera i naciśnij OK. Utwórz nową tabelę i wklej i przetransponuj uzyskane wartości K. W sekcji Wykres wybierz opcję Kolumna jako rodzinę wykresów, a następnie wybierz wykres skrzypcowy jako typ wykresu.Wybierz Pokaż wszystkie punkty" jako wykres i kliknij OK. Eksport jądrowy za pomocą leksyki sondy optogenetycznej został zwizualizowany w obrazowaniu żywych komórek. W warunkach kontrolnych z komórkami traktowanymi metanolem, intensywność jądrowej mCherry gwałtownie spadła po podświetleniu światłem niebieskim, po czym nastąpiła stopniowa regeneracja w fazie po oświetleniu. Leczenie inhibitorem eksportu, leptomycyną B, spowodowało zmianę w eksporcie jądrowym, ponieważ sygnał sondy pozostał niezmiennie jądrowy we wszystkich punktach czasowych.Analiza ilościowa względnej intensywności jądra wykazała z biegiem czasu powolny spadek, aż do osiągnięcia plateau pod koniec fazy oświetlenia. Pośrednie stężenia leptomycyny B powinny wykazywać łagodny eksport jądrowy. Wskaźniki eksportu obliczone na podstawie danych dotyczących intensywności potwierdziły znacznie wyższy wskaźnik eksportu w komórkach poddanych działaniu metanolu, znacznie niższy wskaźnik w przypadku 0,5 nanomolowej leptomycyny B i prawie brak eksportu w przypadku jednej nanomolowej leptomycyny B.

using-lexy-linus-optogenetics-tools-automated-image-analysis-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ilościowego określania dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach przy użyciu narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów