Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu
19 grudnia 2025
Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.
Jesteśmy biologami komórkowymi badającymi rolę mikrotubul i ich powiązaną funkcję w różnych organizmach modelowych. Naszym celem jest zbadanie ich roli w organizacji komórek, morfogenezie, rzęskach i podziale. W ciągu ostatnich pięciu lat przyczyniliśmy się do zrozumienia okrągłego składu molekularnego, szczególnie dzięki zastosowaniu mikroskopii ekspansyjnej.
I dzięki temu ujawniamy kluczową cechę ich montażu i funkcji. Łącząc mikroskopię ekspansyjną z kriofiksacją, nasz protokół umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, zachowując niemal naturalną strukturę pierwiastka komórkowego, co przezwycięża główne ograniczenie mikroskopii superrozdzielczej. Mikroskopia ekspansyjna to tanie i łatwe do wdrożenia techniki, które dają dostęp do całego laboratorium w superrozdzielczości.
Na początek użyj strzykawki i igły, aby napełnić każdą probówkę pięciomilimetrową jednym mililitrem dodatkowego suchego acetonu pod chemiczną okapką. Umieść rurki pionowo w metalowej stojaku i włóż je do ciekłego azotu do zamrożenia. Napełnij połowę pudełka polistyrenowego o grubości 30 na 30 centymetrów suchym lodem, a następnie napełnij dewar typu Vitrobot ciekłym azotem, aż parowanie ustanie.
Teraz wyjmij pająka z aparatu zanurzającego i napełnij metalową komorę zanurzającą ciekłym etanem. Poczekaj 10 minut, aby etan osiągnął równowagę. Następnie weź 12-milimetrową pokrywkę cienką pęsetą i natrzyj ją na bibucie, aby wchłonąć nadmiar materiału z okładki.
Trzymaj slip pokrywowy w połowie, używając pęsety wyposażonej w pierścień zaciskowy kompatybilny z kriogenicznym tłokiem. Włóż pęsetę trzymającą slip do uchwytu na kriogenikę i użyj papieru Whatman, aby usunąć resztki materiału. Aktywuj kriogeniczkę, aby zanurzyć pokrywę w roztworze etanowym zawartym w metalowej komorze.
Następnie szybko przełóż pokrywkę do rurki zawierającej zamrożony aceton. Inkubuj rurki zawierające pokrywy w suchym lodzie pod kątem około 45 stopni. Umieść zamknięty pojemnik na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 do 100 obr./min i mieszaj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby temperatura stopniowo rosła.
Następnie usuń większość suchego lodu z pudełka. Kontynuuj mieszanie na orbitalnym potrząsaczu przez kolejne 45 minut, aby temperatura wzrosła z minus 80 stopni Celsjusza do minus 20 stopni Celsjusza. Krótko otwórz i zamknij każdą rurkę, aby uwolnić ciśnienie wewnętrzne.
Następnie przelej każdą pokrywkę do płytki z 12 dołkami lub odpowiedniego pojemnika napełnionego wcześniej schłodzonym roztworem 100% etanolu. Po pięciominutowej inkubacji nawilż pokrywki za pomocą serii etanolu o stopniu jakości. Po przeniesieniu folii do PBS, umieść je pod mikroskopem.
Użyj cienkiej pęsety, aby delikatnie porysować powierzchnię i ustawić wszystkie pokrywki tak, że strona jest skierowana do góry. Umieść pokrywki na czterodołowej płycie wypełnionej 0,5 do jednego mililitra roztworu 2% akrylamidu i 1,4% roztworu formacji formaldehydu w PBS. Następnie inkubuj pokrywki w tym roztworze w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez poruszenia.
Następnie rozmroz 10% APS i roztwór żelacyjny na lodzie przez 10 minut przed żelem. Przygotuj wilgotną komorę, używając cienkiej warstwy mokrej tkanki i parafilmu. Następnie przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po 10 minutach umieść wilgotną komorę na zimnym bloku, aby użyć go podczas żelowania. Następnie usuń pokrywki z roztworu kotwiczącego białko i wytłucz nadmiar płynu za pomocą bibuły w dwóch kolejnych przejściach. Dodaj APS do roztworu żelacyjnego, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5% i pozostań w wirze przez dwie do trzech sekund.
Następnie pipetować dwie krople po 35 mikrolitrów na parafilm w wilgotnej komorze i delikatnie umieszczać każdą pokrywkę nad kroplą, z komórkami skierowanymi w dół w roztwór żelu. Przenieś wilgotną komorę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut. Do denaturacji użyj narzędzia do wyciskania biopsji o średnicy 0,4 centymetra do wyodrębnienia kawałków żelu i umieść je w sześciodołowej płycie wypełnionej jednym mililitrem buforu denaturacyjnego.
Mieszaj płytę przez 10 do 15 minut, aż żele odłączą się od pokrywek, a następnie przełóż odłączone kawałki żelu do rurek mikrowirowych o pojemności 1,5 mililitra wypełnionych świeżym buforem denaturacyjnym. Inkubuj żele przez 90 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Po inkubacji przelać żele do podwójnie destylowanej wody na 10 minut do mycia.
Zmierz średnicę żeli za pomocą papieru milimetrowego, aby ocenić współczynnik rozszerzalności żelu. Pokrywki pokrywkowe pokrywy pokrywają się około 200 mikrolitrami roztworu polilizyny. Inkubuj pokrywki przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie umyj je podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć nadmiar polilizyny.
Po wyschnięciu pokrywek przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Umieść żel odpowiednio ustawiony, z komórkami skierowanymi do góry, na papierze wolnym od kłaczków i pozwól mu wyschnąć, aby wyeliminować nadmiar wody. Na koniec zamontuj wysuszone żele z komórkami skierowanymi w dół na pokrywkach pokrytych poli-D-Lizyną.
Kriofiksacja zachowała sieć mitochondrialną w komórkach RPE1 skuteczniej niż wiązanie PFA, co wykazały barwienia estrów NHS i ATP5A, oraz umożliwiła rozwiązanie kryszt mitochondrialnych, które nie były widoczne przy fiksacji PFA. Kriofiksacja pozwoliła na lepsze zachowanie dynamicznych mikrotubul, w tym mikrotubul cytoplazmatycznych i astralnych w mitotycznych komórkach RPE1, w porównaniu do fiksacji PFA. Trypanosoma brucei, kriofiksacja lepiej zachowała architekturę mitochondrii i ogólną strukturę komórkową w porównaniu do fiksacji PFA, co jest widoczne za pomocą barwienia esterów TDH i NHS.
Dodatkowo, kriofiksacja lepiej zachowuje retikulum endoplazmatyczne niż wiązanie PFA oparte na barwieniu BIP. Pęknięcia zaobserwowano w komórkach kriofiksowanych RPE1, ale nie zakłóciły one ultrastruktury organelli, takich jak mitochondria czy mikrotubule. Słaba kriofiksacja była wskazywana przez struktury przypominające pęcherzyki i falujące mikrotubule, któremu towarzyszyła utrata integralności organelli błoniastych.
Jakość rozszerzania zależała od klarowności roztworów akrylanu sodu, przy czym roztwory użyteczne wydawały się bezbarwne lub lekko żółte i przezroczyste, podczas gdy nieużyteczne były mętne i pomarańczowe.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół, który łączy kriofiksację i mikroskopię ekspansyjną (Cryo-ExM) dla wysokorozdzielczego obrażania próbek biologicznych. Metoda zachowuje strukturę komórkowych elementów zbliżoną do naturalnej, umożliwiając obrażanie z nadrozdzielczością za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopiczne
- Biologia strukturalna
Tło
- Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w organizacji i funkcjonowaniu komórek.
- Mikroskopię ekspansyjną wykorzystano do badania składu molekularnego.
- Kriofiksacja poprawia zachowanie struktur komórkowych w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Techniki mikroskopiczne z nadrozdzielczością często mają ograniczenia w zakresie zachowania struktur.
Cel badania
- Opracowanie protokołu łączącego kriofiksację i mikroskopię ekspansyjną.
- Umożliwienie wysokorozdzielczego obrażania struktur komórkowych.
- Poprawa zachowania dynamicznych mikrotubul i organelli podczas obrażania.
Stosowane metody
- Przygotowanie próbek biologicznych za pomocą kriofiksacji.
- Włączenie próbek w ekspandacyjny polimer dla mikroskopi ekspansyjnej.
- Imunoznakowanie w celu wizualizacji określonych komponentów komórkowych.
- Wykorzystanie standardowych mikroskopów świetlnych do obrażania.
Główne wyniki
- Kriofiksacja zachowała sieci mitochondrialne bardziej efektywnie niż fiksacja PFA.
- Dynamiczne mikrotubule były lepiej zachowane, co pozwoliło na szczegółowe obrażanie.
- Architektura organelli, w tym mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego, została zachowana.
- Zaobserwowano integralność strukturalną pomimo pewnych pęknięć w kriofiksowanych komórkach.
Wnioski
- Protokół Cryo-ExM zapewnia niezawodną metodę wysokorozdzielczego obrażania.
- Przełamuje ograniczenia tradycyjnej mikroskopi z nadrozdzielczością.
- Ta technika jest dostępna i opłacalna dla różnych laboratoriów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Expansion microscopy with cryo-fixation enables nanoscale imaging of cellular structures using standard fluorescence microscopes, overcoming the resolution and preservation limitations of conventional super-resolution methods. This capability supports early discovery and target validation by providing high-fidelity visualization of organelles and cytoskeletal elements in near-native states. The approach enhances predictive confidence in structural biology workflows and broadens access to advanced imaging for diverse R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of subcellular architecture relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving dynamic structures such as microtubules and organelles.
- Facilitates mechanistic de-risking through artifact-minimized imaging of cellular assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, high-resolution biological systems for quantitative imaging assays.
- Standardizes sample preservation and expansion for reproducible assay outputs.
- Enables scalable imaging workflows using conventional confocal platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular phenotypes in preclinical models.
- Maintains translational continuity by minimizing fixation artifacts across sample types.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-resolution structural data.
- Provides mechanistic insights into organelle and cytoskeletal dynamics relevant to therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling high-resolution imaging without specialized nanoscopy infrastructure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing native cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides measurable expansion factors and structural readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity of structural data from cell lines to whole organisms.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly accessible, cost-effective imaging capability for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-fixation, hydrogel embedding, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal or widefield fluorescence microscopes and basic cryo-infrastructure.
- Demands cross-team standardization of fixation and expansion protocols for reproducibility.
- Adaptable to a range of model systems, from cultured cells to whole organisms.
- Expansion quality depends on reagent clarity and precise handling, as supported by source observations.
