Name: Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi w celu nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metody znakowania ludzkich komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi w celu nieinwazyjnego śledzenia ich migracji in vivo za pomocą obrazowania optycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten został wsparty grantem Leon J. Thal SEED z California Institute for Regenerative Medicine. Tobias Henning otrzymał finansowanie w ramach stypendium badawczego z Niemieckiej Społeczności Badawczej (DFG, HE 4578/1-2). Pragniemy z wdzięcznością podziękować Juanito Menesesowi za jego rady dotyczące hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Znakowanie mezenchymalnych komórek macierzystych fluorescencyjnym barwnikiem DiD
<ol>
<li>Aby rozpocząć procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych, poddaj komórki trypsynizacji i policz je, aby uzyskać zawiesinę o określonej liczbie komórek. </li>
<li>Wyjmij komórki z inkubatora i odessij starą pożywkę z kolb zawierających komórki przeznaczone do znakowania. </li>
<li>Przemyj komórki 10 ml PBS bez Mg/Ca. Odessij PBS. Mg i Ca hamowałyby działanie trypsyny, dlatego stosuje się PBS pozbawiony tych jonów.</li>
<li>Dodaj uprzednio ogrzaną 0,05% trypsynę; w przypadku kolby T75 stosujemy 5 ml. Upewnij się, że cała powierzchnia kolby jest pokryta roztworem.</li>
<li>Inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37°C przez około 5 minut.</li>
<li>Potwierdź odklejenie komórek pod mikroskopem. Jeśli komórki nadal przylegają do kolby, opukaj ją kilka razy i odczekaj nieco dłużej, aż trypsynizacja zakończy się pomyślnie.</li>
<li>Następnie należy zneutralizować trypsynę, dodając pożywkę zawierającą 10% FCS. Stosujemy taką samą ilość pożywki, jaka została użyta dla trypsyny. </li>
<li>Pipetuj roztwór kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały ponownie zawieszone w pożywce.</li>
<li>Przenieś roztwór komórek do sterylnej, zakręcanej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.</li>
<li>Wiruj przy 400 rcf przez 5 minut.</li>
<li>Odessij nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
<li>Resuspenduj komórki w DMEM i przeprowadź liczenie komórek.</li>
<li>Zawieś komórki do znakowania w bezserwatkowej pożywce hodowlanej (DMEM) z gęstością 1x10^6 na ml. </li>
<li>Tym kończy się przygotowanie zawiesiny komórkowej. Teraz można rozpocząć znakowanie.</li>
<li>Najpierw dodaj 5 µL środka kontrastowego DiD na każdy ml zawiesiny komórek.</li>
<li>Następnie wymieszaj roztwór poprzez delikatne pipetowanie.</li>
<li>Inkubuj komórki z roztworem znakującym w temperaturze 37°C przez 20 minut w 6-dołkowej płytce o niskim stopniu adhezji (low-attachment). </li>
<li>Po zakończeniu inkubacji należy przenieść roztwór komórek do zakręcanej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.</li>
<li>Odwiruj roztwór przy 400 rcf przez 5 minut.</li>
<li>Odessij pożywkę do znakowania, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. </li>
<li>Przemyj komórki PBS. Pipetuj komórki w górę i w dół, dbając o rozbicie osadu komórkowego.</li>
<li>Powtórz dwa ostatnie kroki jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić 3 etapy przemywania.</li>
<li>Policz komórki i wykonaj test z błękitem trypanu w celu określenia żywotności komórek. Są to standardowe protokoły hodowli komórkowych, których tutaj nie będziemy wyjaśniać.</li>
<li>Komórki są teraz gotowe do obrazowania w skanerze optycznym.</li>
</ol>
Znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych fluorescencyjnym barwnikiem ICG
<ol>
<li>Aby rozpocząć procedurę znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, należy przygotować środek kontrastowy z zieleni indocyjaninowej. Następnie należy zmieszać go z protaminą, pełniącą rolę czynnika transfekcyjnego.</li>
<li>Odważ 1mg proszku z zieleni indocyjaninowej. Rozpuść proszek ICG w 100 µL dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
<li>Do mieszaniny dodaj 400 µL pożywki DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (Dulbecco's Modified Eagles Medium) i dokładnie wstrząśnij. Otrzymany roztwór będzie miał końcowe stężenie zieleni indocyjaninowej wynoszące 2mg/ml.</li>
<li>Dodaj protaminę jako czynnik transfekcyjny. Protamina pełni funkcję nośnika dla środka kontrastowego, co pozwala na jego bardziej efektywne wniknięcie do wnętrza komórki.</li>
<li>Zmieszaj 5 µL siarczanu protaminy o stężeniu 10mg/ml z 300 µL ICG oraz 300 µL bezzsurowiczej pożywki DMEM.</li>
<li>Delikatnie wstrząsaj nowym roztworem do transfekcji przez 5 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów.</li>
<li>Roztwór do znakowania jest gotowy.</li>
<li>Odsącz starą pożywkę z 10mm szalki Petriego z hESC.</li>
<li>Dodaj 5ml uprzednio ogrzanej, bezzsurowiczej pożywki DMEM.</li>
<li>Do komórek dodaj wcześniej przygotowany roztwór protaminy i ICG. Rozpocznij godzinną inkubację, umieszczając szalkę w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji wyjmij szalkę z inkubatora i odsącz roztwór do znakowania.</li>
<li>Przepłucz komórki, płucząc szalkę 5 ml PBS.</li>
<li>Odsącz PBS i zastąp go 5ml 0,25% trypsyny. Inkubuj szalkę w temperaturze 37°C przez 5 minut, aby umożliwić zajście trypsynizacji. Warto co jakiś czas lekko wstrząsnąć szalką.</li>
<li>Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby rozbić pozostałe kolonie.</li>
<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając do szalki taką samą ilość KSR.</li>
<li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 15ml i odwiruj roztwór przy 400 rcf przez 5 minut.</li>
<li>Resuspenduj komórki w pełnej pożywce.</li>
<li>Jeśli na tym etapie wciąż występują agregaty,&nbsp;powtórz proces trypsynizacji i wirowania.</li>
<li>Po uzyskaniu zawiesiny komórkowej wolnej od agregatów,&nbsp;odsącz starą pożywkę i resuspenduj osad w 10ml uprzednio ogrzanej pełnej pożywki dla ESC.</li>
<li>Na tym etapie konieczne jest oddzielenie mysich komórek karmicielskich od hESC. Jest to niezbędne, aby w dalszej kolejności obrazować wyłącznie komórki macierzyste.</li>
<li>W tym celu przenieś zawiesinę komórkową do 10 cm szalki pokrytej żelatyną.</li>
<li>Umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 45 minut.&nbsp;W tym czasie należy unikać poruszania szalką.&nbsp; W ten sposób komórki karmicielskie przywrą do dna szalki, natomiast komórki macierzyste nie.</li>
<li>Przenieś roztwór z szalki Petriego; w ten sposób otrzymujemy roztwór znakowanych pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.</li>
<li>Komórki można teraz policzyć i poddać testowi z błękitem trypanu.</li>
<li>Komórki&nbsp;są gotowe do obrazowania!</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI jest stosunkowo nową techniką obrazowania, opartą na detekcji fluorescencji. OI jest tak samo czuła jak techniki obrazowania oparte na radiotracerach, ale nie wiąże się z ekspozycją na promieniowanie. OI zapewnia skuteczny sposób nieinwazyjnego i powtarzalnego śledzenia komórek, dostarczając tym samym wiedzy na temat migracji komórek do miejsca docelowego. Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest ograniczona penetracja tkanek przez sondy fluorescencyjne in vivo. W związku z tym akumulacja znacznika w głębokich t...

<table><tbody><tr><td>Zieleń indocyjaninowa (IR-125)</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Rozcieńczyć do stężenia końcowego 0.1% w PBS</td></tr><tr><td>PBS, bez Mg i Ca</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.05% </td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.25% </td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, charakteryzowana</td><td>Odczynnik</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Merkapto&amp;#8211;etanol </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy </td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Odczynnik</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina 200mM </td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Odczynnik</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Obrazowanie optyczne (OI) jest łatwym, szybkim i niedrogim narzędziem do monitorowania in vivo nowych terapii opartych na komórkach macierzystych. Technika ta opiera się na znakowaniu komórek macierzystych ex vivo barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie dożylnym wstrzyknięciu znakowanych komórek i wizualizacji ich gromadzenia się w określonych organach docelowych lub obszarach patologicznych. Przedstawiona technika demonstruje sposób znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) poprzez prostą inkubację z lipofilnym barwnikiem fluorescencyjnym DiD (C67H103CIN2O3S) oraz sposób znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) zatwierdzonym przez FDA barwnikiem fluorescencyjnym indocyjaniną zieloną (ICG). Mechanizm pobierania polega na adhezji i dyfuzji lipofilnego barwnika przez dwuwarstwę fosfolipidową błony komórkowej. Efektywność znakowania jest zazwyczaj wyższa, gdy komórki są inkubowane z barwnikiem w mediach bezsurowiczych, w przeciwieństwie do inkubacji w mediach zawierających surowicę. Ponadto dodatek czynnika transfekcyjnego, siarczanu protaminy, znacząco poprawia pobieranie środka kontrastowego.

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Obrazowanie optyczne (OI) jest prostym, szybkim i niedrogim narzędziem do monitorowania in vivo nowych terapii opartych na komórkach macierzystych. Technika ta opiera się na ex vivo ...

Witamy w laboratorium dr Hiku Alge Blink. Pragniemy podziękować California Institute of Regenerative Medicine za sfinansowanie tego projektu. Znakowanie komórek macierzystych fluorescencyjnym środkiem kontrastowym umożliwia śledzenie przeszczepionych komórek macierzystych in vivo.Kolejne obrazowanie optyczne znakowanych komórek macierzystych umożliwia prowadzenie badań podłużnych, w których można nieinwazyjnie monitorować migrację komórek in vivo. W tym filmie pokażemy, jak znakować barwnikami fluorescencyjnymi zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste, jak i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste. Witam, jestem Sophie Boddington z Grupy Badań nad Środkami Kontrastowymi w Katedrze Radiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.Dzisiaj chciałbym zaprezentować dwie różne techniki znakowania komórek macierzystych za pomocą fluorescencyjnych środków kontrastowych. Jedną z nich jest znakowanie mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikiem fluorescencyjnym DID, a drugą znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą endign ingra. Pozwólcie zatem, że zacznę od przedstawienia naszej techniki znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą DID.Aby rozpocząć procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych, należy je ztrypsynizować i policzyć, aby uzyskać zawiesinę o określonej liczbie komórek. Ponieważ jest to standardowa technika hodowli tkankowej, nie będziemy jej przedstawiać szczegółowo. Komórki przeznaczone do znakowania chcemy zawiesić w bezzbiątkowym medium hodowlanym w zagęszczeniu 1 miliona komórek na ml.W pierwszej kolejności dodajemy 5 µL środka kontrastowego DID na każdy 1 mL zawiesiny komórkowej. Następnie mieszamy roztwór poprzez delikatne pipetowanie; komórki inkubuje się z roztworem znakującym w sześciodołkowej płytce o niskim stopniu przylegania w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.Wirujemy próbkę z prędkością 400 RCF przez pięć minut. Następnie odsysamy pożywkę do znakowania, uważając, aby nie naruszyć osadu. Teraz przemywamy komórki roztworem PBS.Komórki pipetujemy w górę i w dół, upewniając się, że osad komórkowy został rozbity. Dwa ostatnie kroki powtarzamy jeszcze dwukrotnie, tak aby w sumie przeprowadzić trzy etapy przemywania.Następnie liczymy komórki i przeprowadzamy test z błękitem trypanu w celu określenia żywotności komórek. Po ustaleniu żywotności komórek są one gotowe do obrazowania w imagerze optycznym. Aby rozpocząć procedurę znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, musimy najpierw przygotować środek kontrastowy znany jako zieleń indocyjaninowa.Następnie mieszamy to z czynnikiem transfekcyjnym znanym jako protamina. Na początek odważamy jeden miligram proszku indocyjaniny zielonej i rozpuszczamy go w stu mikrolitrach DMSO. Do mieszaniny dodajemy 400 µL DMEM zawierającego 10% FCS i dobrze wstrząsamy, co daje nam stężenie dwóch mg/mL indocyjaniny zielonej.Następnie dodajemy protaminę jako czynnik transfekcyjny, która pełni rolę nośnika dla środka kontrastowego, umożliwiając mu bardziej efektywne wnikanie do komórki. Teraz mieszamy 5 µL siarczanu protaminy o stężeniu 10 mg/mL z 300 µL ICG oraz 300 µL DMEM bez surowicy. Następnie wstrząsamy nowo przygotowanym roztworem do transfekcji przez pięć minut, aby umożliwić formowanie się kompleksów.Następnie odsysamy stare medium i dodajemy do komórek 10 mililitrów PODGRZANEGO DMEM. Do komórek dodajemy wcześniej przygotowany roztwór protaminy ICG i rozpoczynamy godzinną inkubację, umieszczając szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji wyjmujemy szalkę z inkubatora, odsysamy roztwór znakujący i przemywamy komórki, płucząc szalkę pięcioma mililitrami PBS.Następnie komórki poddaje się trypsynizacji przez pięć minut w temperaturze 37°C. Potrząsanie naczyniem pomoże w zawieszeniu komórek. Teraz delikatnie pipetujemy ciecz w górę i w dół, aby rozbić pozostałe kolonie.Trypsynę neutralizujemy, dodając do naczynia równą ilość DMEM zawierającego 10%FCS. Następnie przenosimy zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirujemy ją z prędkością 400 RCF przez pięć minut. Komórki resuspendujemy w pełnej pożywce.Możemy teraz usunąć pozostałe grudki lub kompleksy, przepuszczając komórki przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm. Po uzyskaniu roztworu komórek wolnego od grudek, odsysamy stare medium i resuspendujemy osad w ogrzanym pełnym medium do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Na tym etapie musimy oddzielić mysie komórki karmiciele od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.Przystępuje się do tego etapu, aby mieć pewność, że w późniejszym czasie obrazowane będą wyłącznie komórki macierzyste. W tym celu przenosimy zawiesinę komórek do 10 centymetrowej szalki Petriego powlekanej żelatyną. Szalkę umieszczamy w inkubatorze w temperaturze 37°C na 45 minut.W tym czasie należy zadbać o to, aby nie poruszać szalką. W tym momencie komórki karmiące przylgną do dna szalki, natomiast komórki macierzyste nie. Przenosimy roztwór z szalki Petriego, otrzymując w ten sposób oznakowany roztwór pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.Możemy teraz policzyć komórki i przeprowadzić test z błękitem trypanu. Po potwierdzeniu żywotności komórki są gotowe do obrazowania. Slajd przedstawia przykład wizualizacji komórek macierzystych in vivo u myszy po ich oznakowaniu fluorescencyjnym środkiem kontrastowym i podaniu drogą domięśniową (IP).Seryjne skany obrazowania optycznego wykazały początkową akumulację komórek w płucach, a następnie ich redystrybucję do wątroby, szpiku kostnego kończyn oraz tarczycy. Znakowanie fluorescencyjne może być również wykorzystane do bezpośredniej wizualizacji przeszczepionych komórek macierzystych w preparatach histopatologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób znakowania komórek macierzystych fluorescencyjnymi środkami kontrastowymi podczas przeprowadzania znakowania komórek.Ważne jest, aby pamiętać o standaryzacji każdego kroku. Robimy to w celu zapewnienia spójnej wydajności znakowania oraz żywotności komórek, aby wyniki z różnych eksperymentów można było ze sobą porównać. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w znakowaniu komórek.

labeling-stem-cells-with-fluorescent-dyes-for-non-invasive-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi w celu nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metody znakowania ludzkich komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi w celu nieinwazyjnego śledzenia ich migracji in vivo za pomocą obrazowania optycznego.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Przeglądaj więcej filmów