Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Witamy w laboratorium dr Hiku Alge Blink. Pragniemy podziękować California Institute of Regenerative Medicine za sfinansowanie tego projektu. Znakowanie komórek macierzystych fluorescencyjnym środkiem kontrastowym umożliwia śledzenie przeszczepionych komórek macierzystych in vivo.

Kolejne obrazowanie optyczne znakowanych komórek macierzystych umożliwia prowadzenie badań podłużnych, w których można nieinwazyjnie monitorować migrację komórek in vivo. W tym filmie pokażemy, jak znakować barwnikami fluorescencyjnymi zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste, jak i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste. Witam, jestem Sophie Boddington z Grupy Badań nad Środkami Kontrastowymi w Katedrze Radiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.

Dzisiaj chciałbym zaprezentować dwie różne techniki znakowania komórek macierzystych za pomocą fluorescencyjnych środków kontrastowych. Jedną z nich jest znakowanie mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikiem fluorescencyjnym DID, a drugą znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą endign ingra. Pozwólcie zatem, że zacznę od przedstawienia naszej techniki znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą DID.

Aby rozpocząć procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych, należy je ztrypsynizować i policzyć, aby uzyskać zawiesinę o określonej liczbie komórek. Ponieważ jest to standardowa technika hodowli tkankowej, nie będziemy jej przedstawiać szczegółowo. Komórki przeznaczone do znakowania chcemy zawiesić w bezzbiątkowym medium hodowlanym w zagęszczeniu 1 miliona komórek na ml.

W pierwszej kolejności dodajemy 5 µL środka kontrastowego DID na każdy 1 mL zawiesiny komórkowej. Następnie mieszamy roztwór poprzez delikatne pipetowanie; komórki inkubuje się z roztworem znakującym w sześciodołkowej płytce o niskim stopniu przylegania w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.

Wirujemy próbkę z prędkością 400 RCF przez pięć minut. Następnie odsysamy pożywkę do znakowania, uważając, aby nie naruszyć osadu. Teraz przemywamy komórki roztworem PBS.

Komórki pipetujemy w górę i w dół, upewniając się, że osad komórkowy został rozbity. Dwa ostatnie kroki powtarzamy jeszcze dwukrotnie, tak aby w sumie przeprowadzić trzy etapy przemywania.

Następnie liczymy komórki i przeprowadzamy test z błękitem trypanu w celu określenia żywotności komórek. Po ustaleniu żywotności komórek są one gotowe do obrazowania w imagerze optycznym. Aby rozpocząć procedurę znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, musimy najpierw przygotować środek kontrastowy znany jako zieleń indocyjaninowa.

Następnie mieszamy to z czynnikiem transfekcyjnym znanym jako protamina. Na początek odważamy jeden miligram proszku indocyjaniny zielonej i rozpuszczamy go w stu mikrolitrach DMSO. Do mieszaniny dodajemy 400 µL DMEM zawierającego 10% FCS i dobrze wstrząsamy, co daje nam stężenie dwóch mg/mL indocyjaniny zielonej.

Następnie dodajemy protaminę jako czynnik transfekcyjny, która pełni rolę nośnika dla środka kontrastowego, umożliwiając mu bardziej efektywne wnikanie do komórki. Teraz mieszamy 5 µL siarczanu protaminy o stężeniu 10 mg/mL z 300 µL ICG oraz 300 µL DMEM bez surowicy. Następnie wstrząsamy nowo przygotowanym roztworem do transfekcji przez pięć minut, aby umożliwić formowanie się kompleksów.

Następnie odsysamy stare medium i dodajemy do komórek 10 mililitrów PODGRZANEGO DMEM. Do komórek dodajemy wcześniej przygotowany roztwór protaminy ICG i rozpoczynamy godzinną inkubację, umieszczając szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji wyjmujemy szalkę z inkubatora, odsysamy roztwór znakujący i przemywamy komórki, płucząc szalkę pięcioma mililitrami PBS.

Następnie komórki poddaje się trypsynizacji przez pięć minut w temperaturze 37°C. Potrząsanie naczyniem pomoże w zawieszeniu komórek. Teraz delikatnie pipetujemy ciecz w górę i w dół, aby rozbić pozostałe kolonie.

Trypsynę neutralizujemy, dodając do naczynia równą ilość DMEM zawierającego 10%FCS. Następnie przenosimy zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirujemy ją z prędkością 400 RCF przez pięć minut. Komórki resuspendujemy w pełnej pożywce.

Możemy teraz usunąć pozostałe grudki lub kompleksy, przepuszczając komórki przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm. Po uzyskaniu roztworu komórek wolnego od grudek, odsysamy stare medium i resuspendujemy osad w ogrzanym pełnym medium do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Na tym etapie musimy oddzielić mysie komórki karmiciele od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Przystępuje się do tego etapu, aby mieć pewność, że w późniejszym czasie obrazowane będą wyłącznie komórki macierzyste. W tym celu przenosimy zawiesinę komórek do 10 centymetrowej szalki Petriego powlekanej żelatyną. Szalkę umieszczamy w inkubatorze w temperaturze 37°C na 45 minut.

W tym czasie należy zadbać o to, aby nie poruszać szalką. W tym momencie komórki karmiące przylgną do dna szalki, natomiast komórki macierzyste nie. Przenosimy roztwór z szalki Petriego, otrzymując w ten sposób oznakowany roztwór pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Możemy teraz policzyć komórki i przeprowadzić test z błękitem trypanu. Po potwierdzeniu żywotności komórki są gotowe do obrazowania. Slajd przedstawia przykład wizualizacji komórek macierzystych in vivo u myszy po ich oznakowaniu fluorescencyjnym środkiem kontrastowym i podaniu drogą domięśniową (IP).

Seryjne skany obrazowania optycznego wykazały początkową akumulację komórek w płucach, a następnie ich redystrybucję do wątroby, szpiku kostnego kończyn oraz tarczycy. Znakowanie fluorescencyjne może być również wykorzystane do bezpośredniej wizualizacji przeszczepionych komórek macierzystych w preparatach histopatologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób znakowania komórek macierzystych fluorescencyjnymi środkami kontrastowymi podczas przeprowadzania znakowania komórek.

Ważne jest, aby pamiętać o standaryzacji każdego kroku. Robimy to w celu zapewnienia spójnej wydajności znakowania oraz żywotności komórek, aby wyniki z różnych eksperymentów można było ze sobą porównać. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w znakowaniu komórek.