Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Nasze badania mają na celu scharakteryzowanie architektury mikronaczyń mózgu i przepływu mikronaczyń oraz udoskonalenie metod ultrasonografii o superrozdzielczości. Najnowsze osiągnięcia zoptymalizowały śledzenie mikrobąbelków oraz wzmocniły procesy przetwarzania, tworząc bardziej stabilne protokoły do superrozdzielczego mapowania naczyniowego za pomocą ULM. Na początek umieść znieczuloną mysz na stereotaksyjnej ramie z termoforem ustawionym na 37 stopni Celsjusza.

Używając mocnego, ale nieszkodliwego nacisku, uszczypnij palec u stopy lub ogon, aby sprawdzić brak odruchów i potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec owrzodzeniom i powstawaniu zaćmy podczas zabiegu. Teraz ogol głowę myszy za pomocą trymera.

Nakładaj krem depilacyjny. Pozwól odstać maksymalnie przez 1 do 1,5 minuty, potem dokładnie opłukaj ciepłą wodą i wysusz gazą. Następnie nałóż żel ultradźwiękowy w wirowaniu na głowę, aby zapewnić sprzężenie akustyczne.

Do cewnikowania żył ogonowych użyj zestawu infuzyjnego o średnicy pół cala o średnicy 27, połączonego z igłą o grubości 18 cala i rurką o średnicy 8 cali. Jeśli to możliwe, skrróć rurkę, aby zminimalizować martwą objętość. Delikatnie obróć ogon zwierzęcia o 90 stopni, aby odsłonić boczne żyły ogona.

Następnie zabezpiecz ogon taśmą, aby zachować stabilność i zapobiec ruchowi podczas cewnikowania. Teraz zidentyfikuj żyłę ogonową. Aby poprawić widoczność żył, podgrzej ogon letnią wodą, aby pobudzić rozszerzenie naczyń.

Palcem delikatnie naciskaj u podstawy ogona i przesuwaj go w kierunku miejsca wkłucia w przeciwną stronę przepływu krwi. Włóż igłę równolegle do żyły tak, że faza jest skierowana do góry. Obserwuj rurkę pod kątem powrotu krwi, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie igły.

Na systemie obrazowania uruchom funkcjonalne oprogramowanie do akwizycji ultradźwiękowej i stwórz nową sesję eksperymentalną. Popraw pozycję sondy USG. Teraz rozpocznij akwizycję na żywo w oprogramowaniu i dostosuj sondę w czasie rzeczywistym, używając obrazowania Power Dopplera, aby wycentrować mózg na ekranie.

Optymalizuj parametry obrazowania, takie jak kontrast i kompresja, aby poprawić jakość wizualizacji. Następnie otwórz menu Angio 3D w oprogramowaniu do akwizycji. Dostosuj parametry skanowania, aby całkowicie pokryły mózg, a następnie rozpocznij pobieranie skanu.

Zachowaj otwarte oprogramowanie do pozyskiwania, a gdy Angio 3D będzie gotowe, uruchom oprogramowanie IcoStudio do analizy i wizualizacji. Załaduj skan Angio 3D do przeglądu. Przejdź do panelu rejestracji mózgu i zarejestruj skan Angio 3D w trybie w pełni automatycznym lub ręcznym.

Zapisz wypełnioną rejestrację jako plik BPS. Teraz otwórz menu nawigacji Brain i przewiń do panelu menedżera Atlas. Użyj nawigatora drzew rodziców i dzieci do przeglądania atlasu mózgu Allen Mouse i wybierz pożądane obszary anatomiczne do nakładki w panelu trzech widoków.

Wybierz płaszczyznę obrazowania, która nakłada się na wybrane obszary zainteresowania. W widoku koronalnym ręcznie umieść dwa markery, aby określić pożądany fragment obrazowania. Następnie kliknij BPS Positioning, aby wyodrębnić współrzędne motoryczne dla wybranej płaszczyzny obrazowania.

Przejrzyj podgląd obrazu ze skanu Angio 3D i kliknij Skopiuj współrzędne BPS. Przełącz się na oprogramowanie IcoScan i otwórz panel sondy Move. Kliknij na Neuronavigation, wklej skopiowane wartości i pozwól systemowi automatycznie wyrównać sondę z wybranym płaszczyzną obrazowania.

Następnie rozpocznij obrazowanie na żywo, aby potwierdzić, że aktualna płaszczyzna obrazowania jest wyrównana z wcześniej wybraną płaszczyzną. Za pomocą sterylnej strzykawki wstrzyknij pięć mililitrów roztworu chlorku sodu o stężeniu 0,9% do fiolki mikrobąbelkowej środka kontrastowego ultrasonograficznego przez przegrodę nosową. Intensywnie mieszaj fiolkę przez 20 sekund, aby ponownie zawiesować mikropęcherzyki i zapewnić równomierne rozproszenie.

Wstępnie zdefiniuj parametry nagrywania, w tym sekwencję ultradźwięków, liczbę klatek na sekundę oraz całkowity czas nagrywania. Następnie narysuj pożądaną objętość mikrobąbelków do wstrzykiwania i rozpocznij pobieranie. Po rozpoczęciu pobierania podaj myszom 100 mikrolitrów z odpowiednim rozcieńczeniem.

Potwierdź wzmocnienie kontrastu na panelu wizualizacji na żywo. Natychmiast przepłucz pozostałe mikrobąbelki w martwej objętości, wstrzykując płyn fizjologiczny do cewnika. Poczekaj na zakończenie akwizycji i zapisz nagrane dane.

Otwórz oprogramowanie Icolab i kliknij zakładkę Lokalizacja mikroskopii ultrasonograficznej. Następnie kliknij na Obliczaj mapy ULM, aby rozpocząć proces przetwarzania. Wybierz folder źródłowy, który zawiera wcześniej pozyskane dane.

Następnie wybierz konkretny plik skanowania do przetworzenia i dostosuj granice czasu przetwarzania w razie potrzeby. Kliknij Dalej, aby przejść do etapu raportowania. Ustaw ścieżkę folderu wyjściowego do zapisywania przetworzonych plików oraz konfiguruj parametry wizualizacji obrazów raportu.

Teraz kliknij Run, aby rozpocząć przetwarzanie danych. Po ukończeniu zostanie utworzony plik TRK zawierający zlokalizowane współrzędne mikrobąbelków oraz pliki TIFF reprezentujące gęstość, prędkość i amplitudę rozproszenia wstecznego. Załaduj plik TRK do IcoStudio, aby rozpocząć eksplorację przetworzonych danych.

Następnie użyj prawego panelu bocznego w IcoStudio, aby dostosować parametry wizualizacji, takie jak kontrast, kompresja i mapa kolorów, aby poprawić reprezentację danych. Aby ustawić czas integracji, dostosuj podwójny suwak znajdujący się na dole głównego widoku, aby zdefiniować klatki początkowe i końcowe dla analizy. Zakładka gęstości pokazuje rozkład występowania mikrobąbelków.

Wybierz między gęstością bezwzględną a gęstością kierunkową. Następnie kliknij zakładkę Prędkość, aby wyświetlić prędkość mikrobąbelków w milimetrach na sekundę w trybie absolutnym, kierunkowym, osiowym i bocznym. Dostosuj progi kontrastu, kompresji i prędkości, aby poprawić klarowność obrazu.

Następnie przejrzyj zakładkę Amplituda Rozproszenia Wstecznego, aby zobaczyć odbicie mikrobąbelków, co zwiększa kontrast i ujawnia struktury mikronaczyniowe oraz ruchy poza płaszczyzną. Eksportuj obrazy jako pliki PNG o wysokiej rozdzielczości lub generuj pliki TIFF do analizy ilościowej z możliwością personalizacji rozmiaru pikseli. Mapy gęstości mikropęcherzyków koronalnego przecięcia mózgu szczura pobrane metodą ULM rozróżniły zarówno duże naczynia, jak i drobne struktury kapilarne, ujawniając szczegółową topologię naczyniową, w tym bifurkacje i wzory rozgałęzień.

Mapa prędkości tego samego przecięcia mózgu pokazała wyraźny przepływ kierunkowy osiowo, z przepływem w górę jako odpływem żylnym, a przepływem w dół odpowiadającym perfuzji tętnicy, co jest zgodne ze znaną architekturą naczyń korowych. Mapa amplitudy z rozproszeniem wstecznym zapewniała kontrast zależny od głębokości i podkreślała naczynia na podstawie ich położenia elewacji, co było przydatne do segmentowania jednostek poza płaszczyzną lub o niskiej amplitudzie. Mapy gęstości naczyniowej uzyskane o jeden słaby odstęp u tej samej myszy wykazały silne nakładanie się przestrzenne, potwierdzając powtarzalność celowania w płaszczyźnie koronowej przy użyciu systemu pozycjonowania mózgu.

Ilościowa analiza lewej kory somatosensorycznej na różnych sesjach wykazała podobne rozkłady promienia naczynia, prędkości i przepływu, co potwierdza powtarzalność pomiaru. Podobną powtarzalność zaobserwowano w rejonie lewego wzgórza, z stałymi wartościami promienia naczyń, prędkości i przepływu między sesjami pierwszym a drugim. Prace te potwierdzają, że mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna może niezawodnie generować superrozdzielcze mapy struktury i przepływu mikronaczyniowego in vivo.

Protokół ten spełnia wymagania dotyczące ustandaryzowanej procedury umożliwiającej solidne pozyskiwanie ULM u żywych gryzoni za pomocą dedykowanego funkcjonalnego systemu ultradźwiękowego.