Name: Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj mikroskopię lokalizacyjną ultrasonograficzną do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni. Ta metoda umożliwia wizualizację architektury naczyniowej in vivo z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Philippe Mateo i Lantonirinie Abdoul-Agige z Physics for Medicine Paris za wsparcie w zakresie opieki i obsługi zwierząt. Rysunek 1 i Rysunek 2 zostały stworzone z BioRender.com.

<ol><li>Jamadar, S. D., Behler, A., Deery, H., Breakspear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+costs+of+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">The metabolic costs of cognition.</a> Trends Cogn Sci. 29 (6), 541-555 (2025).</li>
<li>Renaudin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+localization+microscopy+reveals+brain-wide+neurovascular+activity+on+a+microscopic+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound localization microscopy reveals brain-wide neurovascular activity on a microscopic scale.</a> Nat Methods. 19 (8), 1004-1012 (2022).</li>
<li>Agarwal, N., Carare, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+Vessels%3A+An+overview+of+anatomy%2C+physiology%2C+and+role+in+the+drainage+of+fluids+and+solutes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebral Vessels: An overview of anatomy, physiology, and role in the drainage of fluids and solutes.</a> Front Neurol. 11, 611485(2021).</li>
<li>Ahmad, A., Patel, V., Xiao, J., Khan, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurovascular+system+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of neurovascular system in neurodegenerative diseases.</a> Mol Neurobiol. 57 (11), 4373-4393 (2020).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nat Neurosci. 21 (10), 1318-1331 (2018).</li>
<li>Kolinko, Y., Krakorova, K., Cendelin, J., Tonar, Z., Kralickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+of+the+brain%3A+Morphological+assessment+in+degenerative+diseases+and+restoration+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microcirculation of the brain: Morphological assessment in degenerative diseases and restoration processes.</a> Rev Neurosci. 26 (1), 75-93 (2015).</li>
<li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+neuroimaging%3A+A+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound neuroimaging: A review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Curr Opin in Neurobiol. 50, 128-135 (2018).</li>
<li>Mace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain%3A+Theory+and+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound imaging of the brain: Theory and basic principles.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 60 (3), 492-506 (2013).</li>
<li>Tanter, M., Fink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+imaging+in+biomedical+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Ultrafast imaging in biomedical ultrasound.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 61 (1), 102-119 (2014).</li>
<li>Errico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+ultrasound+localization+microscopy+for+deep+super-resolution+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrafast ultrasound localization microscopy for deep super-resolution vascular imaging.</a> Nature. 527 (7579), 499-502 (2015).</li>
<li>Réaux-Le-Goazigo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+localization+microscopy+and+functional+ultrasound+imaging+reveal+atypical+features+of+the+trigeminal+ganglion+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound localization microscopy and functional ultrasound imaging reveal atypical features of the trigeminal ganglion vasculature.</a> Commun Biol. 5 (1), 330(2022).</li>
<li>Siepmann, M., Schmitz, G., Bzyl, J., Palmowski, M., Kiessling, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+vascularity+by+tracing+single+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Int+Ultrason+Symp%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor vascularity by tracing single microbubbles.</a> IEEE Int Ultrason Symp. , 1906-1908 (2011).</li>
<li>Couture, O., Hingot, V., Heiles, B., Muleki-Seya, P., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+localization+microscopy+and+super-resolution%3A+A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Ultrasound localization microscopy and super-resolution: A state of the art.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 65 (8), 1304-1320 (2018).</li>
<li>Dencks, S., Schmitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Ultrasound localization microscopy.</a> Z Med Phys. 33 (3), 292-308 (2023).</li>
<li>Renaudin, N., Pezet, S., Ialy-Radio, N., Demene, C., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattering+amplitude+in+ultrasound+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Backscattering amplitude in ultrasound localization microscopy.</a> Sci Rep. 13 (1), 11477(2023).</li>
<li>Blinder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+angiome%3A+An+interconnected+vascular+network+with+noncolumnar+patterns+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cortical angiome: An interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 889-897 (2013).</li>
<li>van Raaij, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+blood+flow+and+volume+in+arterioles+and+venules+of+the+rat+cerebral+cortex+using+functional+micro-ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Quantification of blood flow and volume in arterioles and venules of the rat cerebral cortex using functional micro-ultrasound.</a> Neuroimage. 63 (3), 1030-1037 (2012).</li>
<li>Lindner, J., Song, J., Jayaweera, A. R., Sklenar, J., Kaul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+rheology+of+definity+microbubbles+after+intra-arterial+and+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Echocardiogr%22%5BJournal%5D)">Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration.</a> J Am Soc Echocardiogr. 15 (5), 396-403 (2002).</li>
<li>Nouhoum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+ultrasound+brain+GPS+for+automatic+vascular-based+neuronavigation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A functional ultrasound brain GPS for automatic vascular-based neuronavigation.</a> Sci Rep. 11, 15197(2021).</li>
<li>Lowerison, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+ultrasound+reveals+cerebrovascular+impairment+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution ultrasound reveals cerebrovascular impairment in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Endocrinol. 44 (9), 1-14 (2024).</li>
<li>Nyúl-Tóth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intravital+approaches+to+quantify+deep+vascular+structure+and+perfusion+in+the+aging+mouse+brain+using+ultrasound+localization+microscopy+%28ULM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Novel intravital approaches to quantify deep vascular structure and perfusion in the aging mouse brain using ultrasound localization microscopy (ULM).</a> J Cereb Blood Flow Metab. 0 (0), 1-19 (2024).</li>
<li>Demeulenaere, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+whole+brain+microvascular+imaging+in+mice+using+transcranial+3D+Ultrasound+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">In vivo whole brain microvascular imaging in mice using transcranial 3D Ultrasound Localization Microscopy.</a> EBioMedicine. 79 (1), 103995(2022).</li>
</ol>

TD jest współzałożycielem i doradcą naukowym firmy Iconeus, firmy komercjalizującej ultrasonograficzne skanery neuroobrazowe. PP, SR, AB, TM, MN i JF są pracownikami Iconeus. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Ultrasonografia lokalizacyjna (ULM) stanowi przełomowy postęp w obrazowaniu ultrasonograficznym, umożliwiając superrozdzielczą wizualizację mikronaczyniowej poza konwencjonalnym limitem dyfrakcyjnym. Niniejsza dyskusja podkreśla kluczowe kroki protokołu ULM, omawia potencjalne modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów, bada ograniczenia metody, ocenia jej znaczenie w porównaniu z alternatywnymi metodami obrazowania oraz rozważa jej znaczenie i potencjalne zastosowania w badaniach biomedycznych.
Kluczowe kroki w protokole ULM 
Kilka kroków jest kluczowych dla pomyślnej realizacji ULM, a ich wpływ ilustruje Rysunek 7. Jednym z najważniejszych kroków jest podawanie mikropęcherzyków, ponieważ zarówno stężenie, jak i jakość dostarczania bezpośrednio wpływają na wyniki badań obrazowych. Optymalna koncentracja jest konieczna, aby zrównoważyć rozdzielczość przestrzenną i wykrywalność. Niewystarczające podanie, takie jak źle założenie cewnika lub ekstravazacja, może skutkować bardzo niskim sygnałem naczyniowym i niekompletnymi rekonstrukcjami, jak pokazano na Rysunku 7B, gdzie do krwiobiegu dociera tylko niewielka liczba mikropęcherzyków. Obrazowanie przy wysokiej liczbie klatek, zazwyczaj w zakresie kiloherców, jest niezbędne do uchwycenia szybkiego ruchu mikrobąbelków i umożliwienia niezawodnego śledzenia między klatkami. Każda niestabilność podczas akwizycji, taka jak ruch wywołany przez oddychanie, słabe stabilizowanie lub niewystarczająca anestezja, może pogorszyć dokładność lokalizacji. Przykład tego ilustruje rysunek 7C, gdzie nadmierny ruch podczas akwizycji skutkuje rozmytą i nieużyteczną mapą gęstości.
Lokalizacja i śledzenie mikrobańków zależą od zaawansowanych algorytmów przetwarzania obrazów, które wykrywają pojedyncze pęcherzyki, lokalizują subpiksele i rekonstruują trajektorie z precyzją subdyfrakcyjną. Nawet przy właściwym pozyskiwaniu i przetwarzaniu czynniki anatomiczne, takie jak aberracje wywołane czaszką, mogą nadal wpływać na jakość obrazu. W obrazowaniu przezczaszkowym, szczególnie u starszych myszy, pogrubienie czaszki może powodować zniekształcenia akustyczne. Prowadzi to do charakterystycznych artefaktów cieniowania pod szwem strzałkowym, gdzie nie wykrywa się mikrobąbelków, jak pokazano na Rysunku 7D. Takie aberracje zmniejszają stosunek sygnału do szumu i mogą zaciemniać struktury naczyniowe, jeśli nie zostaną skorygowane filtrowaniem adaptacyjnym lub doprecyzowaniem rozmieszczenia sondy.
Gdy wszystkie kroki zostaną wykonane pomyślnie, możliwe są wysokiej jakości mapy ULM, jak pokazano na Rysunku 7A, gdzie gęsta i dobrze rozdzielona sieć naczyniowa jest rekonstruowana metodą przezczaszkową.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68612/68612fig7.jpg" /> 
Rysunek 7: Przykłady referencyjne i rozwiązujące problemy dotyczące jakości obrazowania ULM u myszy. Panel (A) pokazuje wysokiej jakości przezczaszkową mapę gęstości mikrobąbelków ULM (MB) uzyskaną u młodej dorosłej myszy, ilustrującą udane mapowanie naczyniowe na całej płaszczyźnie koronalnej. Panel (B) pokazuje przykład słabego sygnału naczyniowego spowodowanego ekstrawazacją mikropęcherzyków lub niewystarczającym dostępem żylnym, co skutkuje rzadkimi wykrywaniami MB. Panel (C) pokazuje akwizycję wpływającą na nadmierny ruch zwierząt, co daje rozmytą i nieinterpretowalną mapę gęstości. Panel (D) podkreśla aberrację akustyczną wywołaną przez czaszkę, powszechnie obserwowaną u starszych myszy, widoczną jako stożek cienia pod szwem strzałkowym, gdzie nie wykrywa się żadnych MB z powodu zmniejszonego stosunku sygnału do szumu. Te przykłady służą jako wizualne odniesienia do identyfikacji i adresowania typowych artefaktów eksperymentalnych w obrazowaniu ULM. Pasek skali: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68612/68612fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Ograniczenia metody
Pomimo wielu zalet, ULM ma wrodzone ograniczenia, które wpływają na jego zastosowanie. Błędne napięcie naczyń poza płaszczyzną jest istotnym problemem w obrazowaniu 2D, ponieważ naczynia wystające poza płaszczyznę obrazowania nie są odpowiednio odbudowane, co prowadzi do niepełnych map naczyń. To ograniczenie można złagodzić, przechodząc na obrazowanie objętościowe (3D) napoziomie 22, choć zwiększa to złożoność obliczeniową. Wyzwania związane z dożylną cewnikowaniem stanowią również wyzwanie, zwłaszcza w modelach zwierząt, gdzie osiągnięcie spójnego dostarczania mikropęcherzyków może być technicznie wymagające. Stabilność mikropęcherzyków jest również czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza podczas dłuższych sesji obrazowania. Ze względu na krótki okres półtrwania krążenia, mikrobąbelki mogą wymagać powtarzanych zastrzyków bolusowych lub ciągłych protokołów infuzji, aby utrzymać odpowiedni kontrast przez cały okres pozyskiwania. Artefakty ruchu pozostają istotnym problemem, szczególnie u osób przytomnych, gdzie nawet niewielkie mimowolne ruchy mogą pogorszyć obrazowanie w superrozdzielczości. Wreszcie, penetracja głębokości w ULM jest z natury ograniczona przez tłumienie ultradźwięków. Chociaż zazwyczaj nie stanowi to problemu przy obrazowaniu gryzoni na wysokich częstotliwościach (np. 15 MHz), to staje się to trudniejsze u większych zwierząt, takich jak świnie czy naczelne niebędące ludźmi. W takich przypadkach mogą być wymagane sondy o niższej częstotliwości, aby osiągnąć odpowiednią głębię obrazowania, ale wiąże się to z obniżoną rozdzielczością przestrzenną – podkreślając kluczowy kompromis między głębią a szczegółowością, który należy uwzględnić przy przenoszeniu ULM na większe modele przedkliniczne.
Znaczenie ULM w porównaniu z istniejącymi metodami
Ultrasonograficzna mikroskopia lokalizacyjna (ULM) oferuje znaczące przewagi w porównaniu z konwencjonalnymi metodami obrazowania, szczególnie w kontekście obrazowania mikronaczyniowego. Jedną z jego największych zalet jest zdolność do przekraczania granicy dyfrakcyjnej tradycyjnego ultradźwięku, umożliwiając obrazowanie subdyfrakcyjne na skalach przestrzennych porównywalnych z technikami optycznymi, takimi jak mikroskopia dwufotonowa. W przeciwieństwie do tych metod optycznych, ULM zapewnia głębsze przenikanie tkanek, umożliwiając dostęp do obszarów mózgu, które w innym przypadku trudno byłoby nieinwazyjnie zobaczyć.
ULM oferuje również funkcjonalne możliwości obrazowania, umożliwiające ilościową ocenę prędkości przepływu krwi, dynamiki perfuzji oraz remodelacji naczyń. Te cechy czynią ją doskonale odpowiednią do badania zarówno procesów fizjologicznych, jak i zmian patologicznych w sieciach nerwowo-naczyniowych. W porównaniu z MRI i PET, ULM jest bardziej opłacalny, nie wymaga zaawansowanej infrastruktury i unika stosowania środków kontrastowych o znanym ryzyku toksyczności, polegając zamiast tego na wypełnionych gazami mikrobąbelkach o korzystnym profilu bezpieczeństwa.
Połączenie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej sprawia, że ULM jest szczególnie cenny w wielu zastosowaniach badawczych. Jest szczególnie skuteczny w badaniach ukierunkowanych na struktury mikronaczyniowe i głębokie jądra mózgu, gdzie tradycyjne metody często zawodzą. Co więcej, w przeciwieństwie do metod histologicznych wymagających utrwalania i barwienia tkanek, ULM umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt, wspierając projekty podłużne i dynamiczne interwencje, takie jak wyzwania farmakologiczne.
Poza statycznym mapowaniem naczyń, ULM umożliwia także obrazowanie funkcjonalne o wysokiej rozdzielczości, rejestrując dynamikę przepływu krwi w mózgu z wyjątkową precyzją przestrzenną i czasową. Najnowsze osiągnięcia wykazały jego wykonalność w funkcjonalnym neuroobrazowaniu całego mózgu u gryzoni, ujawniając zmiany przepływu krwi na poziomie kapilar wywołane bodźcem i zależne od aktywności spontaniczne. To pozycjonuje ULM jako potężne narzędzie do badań funkcjonalnych, skutecznie łącząc obrazowanie hemodynamiczne mezoskalowe z mapowaniem aktywności neuronalnej.
Aspekty użyteczności, efektywności i powtarzalności
Workflow ULM opisany w tym protokole został zoptymalizowany pod kątem łatwości implementacji i powtarzalności w różnych konfiguracjach eksperymentalnych. Zastosowanie komercyjnie dostępnych komponentów, w tym zatwierdzonych przez FDA i EMA mikrobąbelków oraz standardowych procedur znieczulających gryzoni, zapewnia szeroki dostęp. Ponadto integracja całego pipeline'u przetwarzania w dedykowanym oprogramowaniu (IcoLab) znacznie zwiększa użyteczność poprzez automatyzację złożonych kroków, takich jak lokalizacja mikrobąbelków, rekonstrukcja trajektorii oraz generowanie map. Ten uprościony interfejs zmniejsza potrzebę stosowania własnego kodu i minimalizuje ingerencję użytkownika, wspierając spójne wyniki między użytkownikami i eksperymentami. Chociaż przetwarzanie ULM o wysokiej rozdzielczości jest wymagające obliczeniowo, zwłaszcza przy długich akwizycjach lub danych wolumetrycznych, narzędzia do przetwarzania wsadowego oraz akceleracja GPU znacznie skracają czas analizy. Modułowa konstrukcja protokołu wspiera również powtarzalność, pozwalając badaczom precyzyjnie dopracowywać parametry akwizycji i przetwarzania przy zachowaniu solidnych ram analitycznych. Protokół zawiera również dedykowaną sekcję dotyczącą pozycjonowania sondy za pomocą IcoScan i IcoStudio, która pozwala użytkownikom niezawodnie przesuwać sondę na dokładnie ten sam przejście obrazowania w różnych sesjach, z dokładnością około 100 μm. Ta cecha jest szczególnie cenna w badaniach podłużnych, gdzie precyzyjna spójność przestrzenna jest niezbędna do śledzenia zmian naczyń w czasie. Te funkcje łącznie obniżają barierę wejścia dla nowych użytkowników i wspierają skalowalne wdrożenie ULM zarówno w badaniach eksploracyjnych, jak i podłużnych.
Podsumowanie
Protokół ten przedstawia kompleksowy workflow wdrażania Ultrasonografii Lokalizacyjnej (ULM) w obrazowaniu mózgu gryzoni, obejmujący przygotowanie chirurgiczne, podawanie mikropęcherzyków, pozyskiwanie obrazów oraz wysokorozdzielcze mapowanie naczyń z wykorzystaniem standaryzowanej platformy do pozyskiwania i analizy zoptymalizowanej do badań przedklinicznych. ULM stanowi znaczący postęp w obrazowaniu biomedycznym, oferując superrozdzielczą wizualizację mikronaczyniową in vivo z niespotykaną dotąd szczegółowością. W porównaniu z istniejącymi metodami obrazowania, ULM oferuje unikalne połączenie wysokiej rozdzielczości przestrzennej, funkcjonalnej ilościowej ilościowości przepływu oraz dostępności, co czyni go szczególnie dobrym do badań rozwoju naczyń, sprzężenia nerwowo-naczyniowego oraz patofizjologii chorób. W miarę jak technologia nadal dojrzewa, ULM jest na dobrej drodze, by stać się filarem zarówno badań przedklinicznych, jak i w przyszłości klinicznych zastosowań neuroobrazowania.

Chociaż mózg odpowiada za zaledwie 2% masy organizmu, zużywa około 20% tlenu i glukozy, aby utrzymać aktywność neuronów1. To wysokie zapotrzebowanie metaboliczne jest zaspokajane przez złożoną sieć naczyń, od dużych tętnic i żył po mikronaczynia takie jak tętnice, żyłki i naczynia włosowate, regulowane przez sprzężenie nerwowo-naczyniowe2. Zakłócenie tego precyzyjnie dostrojonego procesu zostało powiązane z szerokim spektrum zaburzeń neurologicznych. Na przykład rozłączenie nerwowo-naczyniowe to wczesna cecha patologiczna w chorobach takich jak Alzheimer, Parkinson, Huntington i stwardnienie zanikowe boczne (ALS), często poprzedzając klasyczne cechy neurodegeneracji, takie jak patologia amyloid-beta i tau 3,4,5,6. Dlatego obrazowanie złożonego charakteru mózgu in vivo jest priorytetem dla rosnącej potrzeby zrozumienia procesów fizjologicznych. Postęp technologiczny zapewnił unikalne możliwości badania funkcji i aktywności mózgu, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, z coraz większą precyzją, rozdzielczością i dostępnością.
USG Dopplera stało się potężnym narzędziem do funkcjonalnego pomiaru aktywności mózgu za pomocą przepływu krwi7. W szczególności obrazowanie mocowe Dopplera, zaprojektowane do wykrywania ruchu czerwonych krwinek (RBC), przesyła powtarzające się impulsy ultradźwiękowe do naczyń krwionośnych i rejestruje amplitudę echa ultradźwiękowego rozpraszanego przez poruszające się RBC8. Pojawienie się ultraszybkiego obrazowania ultrasonografycznego, a konkretnie ultrasonografii funkcjonalnej (fUS), było kluczowym punktem w przezwyciężaniu wcześniejszych ograniczeń. Rzeczywiście, konwencjonalne USG skanuje tkanki linię po linii – jest to podejście sekwencyjne, które ogranicza zastosowanie do głównych tętnic mózgowych, ponieważ wolny przepływ krwi typowy dla mikronaczynia mózgu nie może być wykrywany9. Nowsza technika fUS wykorzystuje wielokrotne transmisje fal płaskich do uzyskania tysięcy klatek na sekundę, co znacząco poprawia zarówno rozdzielczość czasową, jak i stosunek sygnału do szumu (SNR). Co istotne, fUS umożliwia wykrywanie zmian hemodynamicznych w bardzo małych naczyniach o prędkościach już od 1 mm/s, wspierając funkcjonalne obrazowanie aktywności mózgu w czasie rzeczywistym aż do poziomu tętnic8.
Chociaż ultraszybkie metody Dopplera znacząco poprawiły obrazowanie mikronaczyniowe, nadal są ograniczone rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie ultradźwiękową10. Równolegle z fUS, ultrasonografia lokalizacyjna (ULM) przełamuje tę przeszkodę, umożliwiając wizualizację struktur mikrokrwi na poziomie kapilar poprzez wykorzystanie środków kontrastowych i wysokoprecyzyjnych algorytmów lokalizacji11. Daje to bezprecedensowe wglądy w morfologię i funkcjonowanie naczyń. Dokładniej, w ULM do krwiobiegu wstrzykuje się środki kontrastowe wykonane ze stabilizowanych wypełnionych gazem mikrobąbelków o średnicy około 1-3 μm. Działają one jako silne akustyczne rozpraszacze, które można wykryć jako pojedyncze punktowe źródła. Ponieważ mikropęcherzyki są znacznie mniejsze niż długość fali ultradźwiękowej, można je izolować przestrzennie i czasowo, występując jako funkcja rozproszenia punktowego (PSF) systemu. Zainspirowane optycznymi technikami superrozdzielczości, takimi jak STORM i PALM, lokalizacja tych mikrobąbelków w subpikselach jest osiągana metodami dekonwolucyjnymi, które mapują ich pozycje z wysoką precyzją 10,12,13,14. Pozwala to na rozdzielczość struktur naczyń z rozdzielczością przestrzenną 5-10 μm, znacznie przekraczającą granicę dyfrakcyjną konwencjonalnego ultraszybkiego ultradźwiękowego obrazowania Dopplera.
ULM jest potężnym i skutecznym narzędziem do mapowania naczyń aż do skali kapilarnej i przezwycięża ograniczenia wielu metod optycznych ograniczonych do warstw powierzchniowych. Jego zdolność do wykonywania obrazowania mikronaczyniowego u żywych zwierząt, umożliwiająca badania podłużne i farmakologiczne, jest kolejną kluczową zaletą ULM w porównaniu z innymi technikami wymagającymi utrwalania mózgu i barwienia. Wyciągnięte informacje wykraczają poza statyczne mapy naczyniowe, dostarczając ilościowe szacunki przepływu krwi aż do poziomu kapilarnych, otwierając tym samym obiecujące możliwości zarówno dla zastosowań przedklinicznych, jak i klinicznych. Aby ułatwić powtarzalność, opisujemy pełny workflow dla obrazowania mózgu u gryzoni opartego na ULM, realizowany przy użyciu standaryzowanej funkcjonalnej platformy ultradźwiękowej zaprojektowanej do badań przedklinicznych.

<table><tbody><tr><td>Regulator temperatury zwierząt (płyta grzewcza połączona z sondą odbytniczą)</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole&nbsp;</td><td>Orion Pharma, Francja</td><td>Antisedan</td><td>Roztwór do zastrzyków 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6</td><td>Janvier Labs</td><td>SC-C57J-M</td><td>Samce myszy C57BL/6Rj, 8 tygodni</td></tr><tr><td>Wiertarka dentystyczna</td><td>Foredom, USA</td><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego K.1070 o dużych prędkościach</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Vichy</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>TVM, Wielka Brytania</td><td>Ocry-żel</td><td></td></tr><tr><td>Podcięcie włosów</td><td>Phymep</td><td>ISIS GT 421 Aesculap</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania IcoLab (w wersji 1.2.0.0)</td><td>Iconeus, Francja</td><td>IcoLab</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja Iconeus One Xpand</td><td>Iconeus, Francja</td><td>IconeusOne Xpand</td><td></td></tr><tr><td>Sonda IcoPrime 15MHz</td><td>Iconeus, Francja</td><td>Sonda IcoPrime-15MHz</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania IcoScan (wersja 1.9.0)</td><td>Iconeus, Francja</td><td>IcoScan</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne IcoStudio (v2.2.0)</td><td>Iconeus, Francja</td><td>IcoStudio</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu &nbsp;</td><td>Mylan, Francja</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Stacja znieczulenia izofluranowego</td><td>Minerve, Esternay, Francja</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Virbac, Francja</td><td>Ketamina1000</td><td>Roztwór do zastrzyków 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>Metacam</td><td>Roztwór do zastrzyków 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>Terumo, Francja</td><td>AN*1838R1</td><td>18 G x &frac12; &rdquo; igła z 8" Rurki</td></tr><tr><td>Woda solna</td><td>Laboratoire Gilbert Physiodose, Pharmacy, Francja</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>DREXCO Medical, Francja</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>Mikropęcherzyki SonoVue</td><td>Bracco Imaging</td><td>SonoVue 8ul/ml</td><td></td></tr><tr><td>Łopatka</td><td>Phymed, Francja.</td><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego K.1070 o dużych prędkościach</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rj: Szczury Han</td><td>Janvier Labs</td><td>RN-SD-M</td><td>RjHan:SD - Samce szczurów Sprague Dawley, 200-300 g</td></tr><tr><td>Rama stereotaksyczna</td><td>David Kopf (Tujunga, USA)</td><td>900-WA</td><td>Używając adaptera do myszy i nie; (Ref: 922) oraz niepęknięte drążki uszne (ref: 922) &nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>DREXCO Medical, Francja</td><td>2058</td><td></td></tr><tr><td>Żel ultradźwiękowy</td><td>DREXCO Medical, Francja</td><td>Medi'Gel</td><td></td></tr><tr><td>Skrzydlaty zestaw infuzujący</td><td>Terumo, Francja</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 2%&nbsp;</td><td>Bayer, Francja</td><td>Rompun</td><td>Roztwór do wstrzykiwania 20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Ultrasound Localization Microscopy for Super-Resolution Mapping of the Rodent Brain Microvasculature

Ultrasonograficzna Mikroskopia Lokalizacyjna (ULM) to technika obrazowania o superrozdzielczości, która umożliwia in vivo wizualizację architektury mikronaczyniowej mózgu, przekraczającą granicę dyfrakcyjną konwencjonalnego ultradźwięku. Poprzez wykrywanie i śledzenie mikrobąbelków wstrzykniętych dożylnie podczas ich krążenia przez naczynia mózgowe, ULM generuje mapy o wysokiej rozdzielczości gęstości naczyniowej, prędkości przepływu oraz amplitudy sygnału odwróconego na skalach przestrzennych do 5-10 μm. Protokół ten przedstawia kompletny workflow do wykonywania obrazowania ULM u gryzoni, w tym przygotowanie zwierząt, pozycjonowanie sondy, akwizycję obrazu, wstrzykiwanie mikropęcherzyków oraz przetwarzanie danych, przy użyciu dedykowanej funkcjonalnej platformy ultradźwiękowej. Opisane są dwie metody przygotowania, dostosowane dla myszy (przezczaszkowa) i szczurów (z oknami czaszkowymi), po których następują szczegółowe instrukcje dotyczące ustawienia sondy i celowania anatomicznego z wykorzystaniem zintegrowanego atlasu mózgu. Podczas akwizycji ultraszybkie sekwencje ultradźwiękowe są synchronizowane z bolusowymi wstrzykiwaniami mikrobąbelków w celu przechwycenia dynamicznych danych przepływu. Kolejne etapy rekonstrukcji obejmują filtrowanie zakłóceń, interpolację obrazów, wykrywanie mikrobąbelków, lokalizację subpikseli oraz śledzenie trajektorii. Wyniki obejmują mapy gęstości odzwierciedlające zajmowanie pojazdów, mapy prędkości ujawniające wzorce przepływu i kierunkowość oraz mapy amplitudy oferujące dodatkowy kontrast do interpretacji strukturalnej. Reprezentatywne wyniki ilustrują pomyślne pozyskiwanie przez pełne płaszczyzny koronalne i wskazują na typowe pułapki, takie jak słaba jakość wstrzykiwania, artefakty ruchu oraz aberracje wywołane przez czaszkę. Protokół jest kompatybilny zarówno z badaniami przekrojowymi, jak i podłużnymi, i szczególnie nadaje się do badania zmian mózgowo-naczyniowych w modelach starzenia, udaru, tętniaków i chorób neurodegeneracyjnych. Łącząc głęboką penetrację, wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną oraz obrazowanie naczyń bez oznakowania, ULM oferuje potężne narzędzie do nieinwazyjnej analizy mikrocyrkulacji mózgu w modelach przedklinicznych.

Reprezentatywne przykłady na Rysunku 5 pokazują typowy przykład danych ULM z mózgiem szczura uzyskanym w ciągu 1 minuty zapisu po wstrzyknięciu 200 μL bolusu mikrobębelkowego, z rozdzielczością 10 μm.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68612/68612fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyjścia ULM uzyskane od kraniotomizowanego szczura po pojedynczym zastrzyku mikropęcherzyka. Przykładowe mapy gęstości mikropęcherzyków (MB) (po lewej), prędkości (w centrum) i amplitudy rozproszenia wstecznego (po prawej) przedstawiono dla pełnego koronalnego cięcia mózgu, uzyskanego w ciągu 1 minuty zapisu po wstrzyknięciu bolusu mikropęcherzyków 200 μL. Pasek skalowy: 2mm. Powiększone wstawki podkreślają mikronaczynia lewej kory (pasek skali: 0,5 mm). Mapa gęstości odzwierciedla przestrzenny rozkład wystąpień MB, ujawniając strukturę sieci naczyniowej. Mapa prędkości ilustruje prędkość przepływu i kierunkowość poszczególnych MB, umożliwiając rozróżnienie typów naczyń. Mapa amplitudy pokazuje sygnał ultradźwiękowy rozproszony wstecznie z MB, zapewniając dodatkowy mechanizm kontrastu, który poprawia wizualizację morfologii naczyń i ruchu poza płaszczyzną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68612/68612fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Uzyskane mapy ilustrują trzy uzupełniające się spojrzenia mikronaczynia mózgu: gęstość mikrobąbelka (MB) (po lewej), prędkość (środek) oraz amplitudę rozproszenia wstecznego (po prawej). Każda mapa odpowiada pełnemu przekrojowi koronalnemu mózgu, z powiększonym wstawką podkreślającym mikronaczynia lewej kory (paski skalowe: odpowiednio 2 mm i 0,5 mm).
Mapa gęstości pokazuje przestrzenny rozkład wystąpień MB w polu widzenia. Morfologia naczyń jest rozwiązywana znacznie poniżej granicy dyfrakcyjnej, co ujawnia zarówno duże naczynia, jak i drobne struktury kapilarne. Ten typ mapy umożliwia wyraźną wizualizację topologii sieci naczyniowej, w tym bifurkacji i wzorców rozgałęzień, nawet w głębokich obszarach kory.
Mapa prędkości pokazuje prędkość przepływu poszczególnych MB rzutowanych wzdłuż kierunku osiowego (z). Ta projekcja generuje wartości prędkości z oznaką, gdzie ujemne prędkości odzwierciedlają przepływ w górę do kory, a wartości dodatnie przepływ w dół. W korze mózgowej gryzoni architektura naczyniowa jest silnie stereotypowa: tętnice penetrujące schodzą z powierzchni pialu do warstw korowych, natomiast żyłki wznoszą się z kory z powrotem na powierzchnię, odprowadzając odtlenioną krew16. To spójne ułożenie anatomiczne umożliwia stosowanie pomiarów prędkości kierunkowej do rozróżniania typów naczyń, przy czym dodatnie prędkości osiowe zazwyczaj wskazują na przepływ tętniczy, a ujemne na drenaż żylny. Ogólnie wartości prędkości mierzone metodą ULM są zgodne z wcześniej podawanymi zakresami w literaturze10,17, obejmując od 10-20 mm/s w tętnikach penetracyjnych do kilku centymetrów na sekundę w głównych tętnicach śródczaszkowych. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że przepływające mikrobąbelki ściśle naśladują reologiczne zachowanie czerwonych krwinek18, potwierdzając zastosowanie ULM do ilościowego określania dynamiki przepływu krwi fizjologicznej na mikroskali.
Mapa amplitudy rozproszonej wstecznie (BSA) dostarcza przestrzenną reprezentację intensywności sygnału ultradźwiękowego zwracanego przez każdy MB. Ponieważ energia rozproszenia wstecznego jest maksymalizowana, gdy MB przechodzą przez obszar ogniskowej, ta mapa oferuje kontrast w zależności od położenia wysokościowego. Pomaga doprecyzować segmentację poprzez identyfikację ruchów poza płaszczyzną lub o niskiej amplitudzie, szczególnie na większych głębokościach lub w pobliżu krawędzi ogniskowych. Mapy BSA są również cenne do wykrywania tłumienia sygnału związanego z głębokością lub identyfikacji niezgodności w ustawieniu ogniskowym15.
Aby zademonstrować powtarzalność celowania na płaszczyźnie za pomocą Brain Positioning System, Rysunek 6A pokazuje mapy gęstości naczyniowej ULM wykonane w tej samej myszy pod znieczuleniem w dniu 0 (Tydzień 1) i dniu 7 (Tydzień 2), celując w tę samą płaszczyznę koronalną. Nałożenie obu map pokazuje silną przestrzenną zgodność sygnału naczyniowego, potwierdzając precyzję przesuwania płaszczyzn oraz wiarygodność eksperymentów podłużnych, jak pokazano wcześniej19.
Analiza ilościowa może być stosowana do każdego z tych wyników. Na przykład użytkownicy mogą segmentować naczynia za pomocą progów intensywności lub algorytmów klastrowania, a następnie wyodrębniać regionalne statystyki, takie jak gęstość naczyń, średnia prędkość przepływu oraz parametry morfometryczne, w tym promień naczyń, średnia długość, liczba odgałęzień oraz inne wskaźniki strukturalne sieci naczyniowej. Porównania między regionami korowymi lub grupami eksperymentalnymi (np. leki poddane ws. kontrolne) można przeprowadzić bezpośrednio na tych mapach lub poprzez wyprowadzone statystyki parametryczne na powszechnie identyfikowanych naczyniach20,21. Jako przykład takiej analizy przeprowadziliśmy regionalne kwantyfikacje parametrów naczyniowych w lewej korze somatosensorycznej (S1BF, rysunek 6B) oraz lewym wzgórzu (rysunek 6C). Mapy gęstości zostały najpierw binarizowane, skeletonizowane, a promienie naczyń oszacowano za pomocą euklidesowej transformacji odległości. Prędkości przepływu były bezpośrednio obliczane na podstawie trajektorii MB, a przepływ wyprowadzono z promienia naczynia za pomocą prawa Poiseuille'a, jak wcześniej szczegółowo opisano21. Zastosowano tu tę samą metodologię, co opisana w tamtym badaniu. Wykresy wąsów pokazują rozkłady promienia naczynia, prędkości i przepływu dla d0 i d7, co wykazuje dobrą powtarzalność między sesjami. Razem te multimodalne wyniki ULM umożliwiają kompleksową charakterystykę sieci mikronaczyniowej mózgu, oferując zarówno anatomiczne, jak i dynamiczne wglądy z niespotykaną dotąd rozdzielczością.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68612/68612fig6.jpg" /> 
Rysunek 6: Podłużna powtarzalność celowania płaszczyznowego oraz przykład ilościfikacji naczyniowych za pomocą Systemu Pozycjonowania Mózgu. (A) Mapy gęstości naczyń ULM pobrane od tej samej znieczulonej myszy w dniu 0 (Tydzień 1) i dniu 7 (Tydzień 2), celując w tę samą płaszczyznę koronną za pomocą Systemu Pozycjonowania Mózgu (pasek skali = 1 cm). Nałożenie obu map pokazuje silną przestrzenną zgodność sygnału naczyniowego, ilustrując powtarzalność pozycjonowania płaszczyzn w różnych sesjach. (B,C) Reprezentatywna ilościowa ilościowa liczba parametrów naczyniowych wyodrębniona z dwóch obszarów zainteresowania: lewej kory somatosensorycznej (S1BF, B) oraz lewego wzgórza (C). Dla każdego obszaru wyświetlamy mapę gęstości naczyniowej w d0 (pasek skali = 0,5 cm), wraz z wykresami wąsów pokazującymi rozkład promienia naczyń (μm), prędkości przepływu (mm/s) i przepływu (mm3/s) przy d0 i d7 (mediana, 25.-75. percentyl, wąsy = 1,5×IQR, wartości odstające poszczególne wykreślone). Wyniki te ilustrują zdolność pipeline'u do wyodrębniania metryk morfometrycznych i hemodynamicznych z danych ULM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68612/68612fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Ultrasonograficzna mikroskopia lokalizacyjna (ULM) to niedawno opracowana technika, która pozwala na niespotykany dotąd poziom rozdzielczości obrazowania mikronaczyń in vivo. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy, jak uzyskać superrozdzielcze obrazy mikronaczyniowej mikronaczyniowej mózgu u gryzoni, wykorzystując standaryzowaną funkcjonalną platformę ultradźwiękową zaprojektowaną do badań przedklinicznych.

Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Ultrasound Localization Microscopy (ULM) is a super-resolution imaging technique that enables in vivo visualization of the brain&#39;s microvascular ...

Nasze badania mają na celu scharakteryzowanie architektury mikronaczyń mózgu i przepływu mikronaczyń oraz udoskonalenie metod ultrasonografii o superrozdzielczości. Najnowsze osiągnięcia zoptymalizowały śledzenie mikrobąbelków oraz wzmocniły procesy przetwarzania, tworząc bardziej stabilne protokoły do superrozdzielczego mapowania naczyniowego za pomocą ULM. Na początek umieść znieczuloną mysz na stereotaksyjnej ramie z termoforem ustawionym na 37 stopni Celsjusza.Używając mocnego, ale nieszkodliwego nacisku, uszczypnij palec u stopy lub ogon, aby sprawdzić brak odruchów i potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec owrzodzeniom i powstawaniu zaćmy podczas zabiegu. Teraz ogol głowę myszy za pomocą trymera.Nakładaj krem depilacyjny. Pozwól odstać maksymalnie przez 1 do 1,5 minuty, potem dokładnie opłukaj ciepłą wodą i wysusz gazą. Następnie nałóż żel ultradźwiękowy w wirowaniu na głowę, aby zapewnić sprzężenie akustyczne.Do cewnikowania żył ogonowych użyj zestawu infuzyjnego o średnicy pół cala o średnicy 27, połączonego z igłą o grubości 18 cala i rurką o średnicy 8 cali. Jeśli to możliwe, skrróć rurkę, aby zminimalizować martwą objętość. Delikatnie obróć ogon zwierzęcia o 90 stopni, aby odsłonić boczne żyły ogona.Następnie zabezpiecz ogon taśmą, aby zachować stabilność i zapobiec ruchowi podczas cewnikowania. Teraz zidentyfikuj żyłę ogonową. Aby poprawić widoczność żył, podgrzej ogon letnią wodą, aby pobudzić rozszerzenie naczyń.Palcem delikatnie naciskaj u podstawy ogona i przesuwaj go w kierunku miejsca wkłucia w przeciwną stronę przepływu krwi. Włóż igłę równolegle do żyły tak, że faza jest skierowana do góry. Obserwuj rurkę pod kątem powrotu krwi, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie igły.Na systemie obrazowania uruchom funkcjonalne oprogramowanie do akwizycji ultradźwiękowej i stwórz nową sesję eksperymentalną. Popraw pozycję sondy USG. Teraz rozpocznij akwizycję na żywo w oprogramowaniu i dostosuj sondę w czasie rzeczywistym, używając obrazowania Power Dopplera, aby wycentrować mózg na ekranie.Optymalizuj parametry obrazowania, takie jak kontrast i kompresja, aby poprawić jakość wizualizacji. Następnie otwórz menu Angio 3D w oprogramowaniu do akwizycji. Dostosuj parametry skanowania, aby całkowicie pokryły mózg, a następnie rozpocznij pobieranie skanu.Zachowaj otwarte oprogramowanie do pozyskiwania, a gdy Angio 3D będzie gotowe, uruchom oprogramowanie IcoStudio do analizy i wizualizacji. Załaduj skan Angio 3D do przeglądu. Przejdź do panelu rejestracji mózgu i zarejestruj skan Angio 3D w trybie w pełni automatycznym lub ręcznym.Zapisz wypełnioną rejestrację jako plik BPS. Teraz otwórz menu nawigacji Brain i przewiń do panelu menedżera Atlas. Użyj nawigatora drzew rodziców i dzieci do przeglądania atlasu mózgu Allen Mouse i wybierz pożądane obszary anatomiczne do nakładki w panelu trzech widoków.Wybierz płaszczyznę obrazowania, która nakłada się na wybrane obszary zainteresowania. W widoku koronalnym ręcznie umieść dwa markery, aby określić pożądany fragment obrazowania. Następnie kliknij BPS Positioning, aby wyodrębnić współrzędne motoryczne dla wybranej płaszczyzny obrazowania.Przejrzyj podgląd obrazu ze skanu Angio 3D i kliknij Skopiuj współrzędne BPS. Przełącz się na oprogramowanie IcoScan i otwórz panel sondy Move. Kliknij na Neuronavigation, wklej skopiowane wartości i pozwól systemowi automatycznie wyrównać sondę z wybranym płaszczyzną obrazowania.Następnie rozpocznij obrazowanie na żywo, aby potwierdzić, że aktualna płaszczyzna obrazowania jest wyrównana z wcześniej wybraną płaszczyzną. Za pomocą sterylnej strzykawki wstrzyknij pięć mililitrów roztworu chlorku sodu o stężeniu 0,9% do fiolki mikrobąbelkowej środka kontrastowego ultrasonograficznego przez przegrodę nosową. Intensywnie mieszaj fiolkę przez 20 sekund, aby ponownie zawiesować mikropęcherzyki i zapewnić równomierne rozproszenie.Wstępnie zdefiniuj parametry nagrywania, w tym sekwencję ultradźwięków, liczbę klatek na sekundę oraz całkowity czas nagrywania. Następnie narysuj pożądaną objętość mikrobąbelków do wstrzykiwania i rozpocznij pobieranie. Po rozpoczęciu pobierania podaj myszom 100 mikrolitrów z odpowiednim rozcieńczeniem.Potwierdź wzmocnienie kontrastu na panelu wizualizacji na żywo. Natychmiast przepłucz pozostałe mikrobąbelki w martwej objętości, wstrzykując płyn fizjologiczny do cewnika. Poczekaj na zakończenie akwizycji i zapisz nagrane dane.Otwórz oprogramowanie Icolab i kliknij zakładkę Lokalizacja mikroskopii ultrasonograficznej. Następnie kliknij na Obliczaj mapy ULM, aby rozpocząć proces przetwarzania. Wybierz folder źródłowy, który zawiera wcześniej pozyskane dane.Następnie wybierz konkretny plik skanowania do przetworzenia i dostosuj granice czasu przetwarzania w razie potrzeby. Kliknij Dalej, aby przejść do etapu raportowania. Ustaw ścieżkę folderu wyjściowego do zapisywania przetworzonych plików oraz konfiguruj parametry wizualizacji obrazów raportu.Teraz kliknij Run, aby rozpocząć przetwarzanie danych. Po ukończeniu zostanie utworzony plik TRK zawierający zlokalizowane współrzędne mikrobąbelków oraz pliki TIFF reprezentujące gęstość, prędkość i amplitudę rozproszenia wstecznego. Załaduj plik TRK do IcoStudio, aby rozpocząć eksplorację przetworzonych danych.Następnie użyj prawego panelu bocznego w IcoStudio, aby dostosować parametry wizualizacji, takie jak kontrast, kompresja i mapa kolorów, aby poprawić reprezentację danych. Aby ustawić czas integracji, dostosuj podwójny suwak znajdujący się na dole głównego widoku, aby zdefiniować klatki początkowe i końcowe dla analizy. Zakładka gęstości pokazuje rozkład występowania mikrobąbelków.Wybierz między gęstością bezwzględną a gęstością kierunkową. Następnie kliknij zakładkę Prędkość, aby wyświetlić prędkość mikrobąbelków w milimetrach na sekundę w trybie absolutnym, kierunkowym, osiowym i bocznym. Dostosuj progi kontrastu, kompresji i prędkości, aby poprawić klarowność obrazu.Następnie przejrzyj zakładkę Amplituda Rozproszenia Wstecznego, aby zobaczyć odbicie mikrobąbelków, co zwiększa kontrast i ujawnia struktury mikronaczyniowe oraz ruchy poza płaszczyzną. Eksportuj obrazy jako pliki PNG o wysokiej rozdzielczości lub generuj pliki TIFF do analizy ilościowej z możliwością personalizacji rozmiaru pikseli. Mapy gęstości mikropęcherzyków koronalnego przecięcia mózgu szczura pobrane metodą ULM rozróżniły zarówno duże naczynia, jak i drobne struktury kapilarne, ujawniając szczegółową topologię naczyniową, w tym bifurkacje i wzory rozgałęzień.Mapa prędkości tego samego przecięcia mózgu pokazała wyraźny przepływ kierunkowy osiowo, z przepływem w górę jako odpływem żylnym, a przepływem w dół odpowiadającym perfuzji tętnicy, co jest zgodne ze znaną architekturą naczyń korowych. Mapa amplitudy z rozproszeniem wstecznym zapewniała kontrast zależny od głębokości i podkreślała naczynia na podstawie ich położenia elewacji, co było przydatne do segmentowania jednostek poza płaszczyzną lub o niskiej amplitudzie. Mapy gęstości naczyniowej uzyskane o jeden słaby odstęp u tej samej myszy wykazały silne nakładanie się przestrzenne, potwierdzając powtarzalność celowania w płaszczyźnie koronowej przy użyciu systemu pozycjonowania mózgu.Ilościowa analiza lewej kory somatosensorycznej na różnych sesjach wykazała podobne rozkłady promienia naczynia, prędkości i przepływu, co potwierdza powtarzalność pomiaru. Podobną powtarzalność zaobserwowano w rejonie lewego wzgórza, z stałymi wartościami promienia naczyń, prędkości i przepływu między sesjami pierwszym a drugim. Prace te potwierdzają, że mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna może niezawodnie generować superrozdzielcze mapy struktury i przepływu mikronaczyniowego in vivo.Protokół ten spełnia wymagania dotyczące ustandaryzowanej procedury umożliwiającej solidne pozyskiwanie ULM u żywych gryzoni za pomocą dedykowanego funkcjonalnego systemu ultradźwiękowego.

ultrasound-localization-microscopy-for-super-resolution-mapping

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Ten film opisuje metodę tymczasowego zakłócania bariery krew-mózg (BBB) poprzez tworzenie przejściowych otworów za pomocą zogniskowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). Te przejściowe lokalne otwory BBB mogą ostatecznie zostać wykorzystane do dostarczania większych cząsteczek leku bezpośrednio do miąższu mózgu.

Focus Ultrasounds Mikropęcherzykowe otwieranie bariery krew-mózg: technika tworzenia zlokalizowanych przejściowych otworów w barierze krew-mózg myszy za pomocą sonoporacji

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Obecna praca opisuje nowy protokół do wykonywania nieinwazyjnych ultradźwięków o wysokiej częstotliwości i obrazowania fotoakustycznego na mózgu szczura, aby efektywnie wizualizować głębokie obszary podkorowe i ich wzorce naczyniowe poprzez kierowanie sygnałów na otwór czaszki naturalnie występujący na zwierzęcej czaszce.

Nieinwazyjne miąższowe, naczyniowe i metaboliczne ultrasonografie wysokiej częstotliwości i fotoakustyczne obrazowanie głębokiego mózgu szczura

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Tutaj opisujemy protokół mikroskopii lokalizacji ultradźwięków (ULM), który osiąga rozdzielczość przestrzenną 12,5 μm do obrazowania mikrokrążenia mózgu u szczurów. Umożliwia szczegółową wizualizację kierunku i prędkości przepływu krwi, oferując potężne narzędzie do zaawansowanych badań nad krążeniem mózgowym i zaburzeniami naczyniowymi.

Dwuwymiarowa wizualizacja mikrokrążenia mózgu szczura w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii lokalizacji ultradźwiękowej

Poznaj mikroskopię lokalizacyjną ultrasonograficzną do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni. Ta metoda umożliwia wizualizację architektury naczyniowej in vivo z wysoką rozdzielczością.

Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Przeglądaj więcej filmów