Name: Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T16:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Odkryj przejściowe oczyszczanie optyczne z tartrazyną do obrazowania ex vivo i in vivo. Ta metoda wykorzystuje cząsteczki absorpcyjne do szybkiego, odwracalnego zwiększania głębokości i przejrzystości obrazowania biomedycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ZO dziękuje za wsparcie ze strony Uniwersytetu Teksańskiego w Dallas.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Teksański w Dallas' Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów. Kod przetwarzania obrazu jest dostępny na Githubie: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing
1. Przygotowanie roztworu tartrazyny
<ol>
	<li>Do próbek ex vivo<ol>
		<li>Aby przygotować roztwory barwników, oblicz wymaganą masę barwnika w proszku (tartrazyny), aby przygotować żądaną objętość roztworu. Użyj wzoru: Masa (g) = molowość (M) × Masa cząsteczkowa (g/mol) × Objętość (L) UWAGA: Aby skalibrować rzeczywistą molowość, należy zmierzyć absorbancję przygotowanych roztworów za pomocą spektrometru UV-VIS i zastosować prawo Beera-Lamberta19. UWAGA: Użyj wagi analitycznej, aby zważyć dokładną ilość proszku. Podczas pracy z proszkami barwnikowymi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPI), w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Unikać wdychania lub kontaktu ze skórą.</li>
		<li>Przenieś barwnik w proszku do czystej szklanej fiolki i dodaj wymaganą objętość wody dejonizowanej (DI) za pomocą pipety wolumetrycznej, aby zapewnić precyzję objętościową.</li>
		<li>Jeżeli proszek nie rozpuści się całkowicie w temperaturze pokojowej, umieścić szklaną fiolkę w piecu laboratoryjnym lub piecu nagrzanym do temperatury 40 °C i podgrzewać przez 10 minut lub do całkowitego rozpuszczenia proszku (rysunek 1A). UWAGA: Roztwory o niskim molopatii są całkowicie rozpuszczalne w temperaturze pokojowej i pozostają w postaci płynnej, podczas gdy roztwory o wysokim stężeniu (>0,37 M) wymagają podgrzania. UWAGA: Nadmierne podgrzanie spowoduje odparowanie wody i zmianę rzeczywistego stężenia roztworu.</li>
		<li>Mieszaj w mieszaczu wirowym przez 30 s do 1 minuty, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.</li>
		<li>Aby przygotować 0,65 M roztwór, rozpuść 427,5 mg tartrazyny w proszku w 1 ml wody DI19. W przypadku innych stężeń patrz tabela 1. UWAGA: Niewykorzystane roztwory barwników i zanieczyszczone materiały należy utylizować zgodnie ze standardowymi procedurami usuwania odpadów chemicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do próbek in vivo<ol>
		<li>Obliczyć wymaganą masę mikrocząstek agarozy o niskiej temperaturze topnienia i tartrazyny, aby przygotować stężenie 0,65 M z 0,4% (4 mg/ml) roztworem hydrożelu agarozowego. UWAGA: Podczas obchodzenia się ze wszystkimi odczynnikami należy przestrzegać standardowych środków ostrożności opisanych w kroku 1.1.1.</li>
		<li>Przenieść zważone proszki do czystej szklanej fiolki. Dodaj wodę DI za pomocą pipety miarowej.</li>
		<li>Umieścić fiolkę w piecu laboratoryjnym nagrzanym do temperatury 75 °C na około 10-15 minut lub do całkowitego rozpuszczenia cząstek agarozy.</li>
		<li>Od czasu do czasu mieszaj za pomocą mieszalnika wirowego podczas procesu podgrzewania, aby uzyskać równomierne rozpuszczenie.</li>
		<li>Przed użyciem pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Jeśli zestali się do postaci żelu, użyj mieszalnika wirowego przez 30 sekund, aby go ponownie upłynnić.</li>
		<li>Aby przygotować 0,65 M roztwór hydrożelu, rozpuść 427,5 mg tartrazyny w proszku i 4 mg agarozy w 1 ml wody demineralizowanej. W celu przygotowania roztworów o innych stężeniach należy utrzymać stężenie agarozy na poziomie 0,4% (4 mg/ml) i zapoznać się z tabelą 1 dla odpowiedniej masy tartrazyny17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Optyczne oczyszczanie tkanek ex vivo
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki<ol>
		<li>Aby przygotować tkankę ex vivo , pokrój tkankę piersi kurczaka na żądaną grubość równolegle do włókien kolagenowych.</li>
		<li>Pokrojoną chusteczkę delikatnie oczyść wodą.</li>
		<li>Zmierz grubość, umieszczając tkankę między dwoma czystymi szkiełkami mikroskopowymi. Delikatnie dociśnij szkiełka do siebie i użyj suwmiarki, aby zmierzyć odległość między szkiełkami w środku tkanki.</li>
		<li>Namocz tkankę w roztworze barwnika. UWAGA: Upewnij się, że objętość roztworu jest większa niż objętość próbki i że tkanka jest całkowicie zanurzona.</li>
		<li>Umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej i potrząsaj z prędkością 100 obrotów na minutę przez 10 minut.</li>
		<li>Pozostawić tkankę w roztworze przez 60 minut w temperaturze pokojowej dla niskich stężeń ≤0,4 M i w temperaturze 40 °C dla wyższych stężeń >0,4 M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania<ol>
		<li>Usuń tkankę z roztworu barwnika za pomocą czystych kleszczyków.</li>
		<li>Umieść próbkę między dwoma przezroczystymi szkiełkami i uchwyć obrazy za pomocą aparatu cyfrowego lub naukowego o odpowiedniej rozdzielczości i ustawieniach powiększenia.</li>
		<li>Przeprowadź proces obrazowania w kontrolowanym środowisku oświetleniowym, aby zminimalizować zakłócenia światła zewnętrznego.</li>
		<li>Powtórz proces obrazowania dla próbek tkanek o różnych grubościach i stężeniach roztworu barwnika (ryc. 2B). UWAGA: Użyj źródła światła LED do podświetlenia pleców. Działa jednak dokładnie w ten sam sposób również w przypadku górnego źródła światła z oświetleniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary transmisji optycznej<ol>
		<li>Aby zmierzyć transmisję optyczną, umieść tkankę kurczaka między dwoma przezroczystymi szkiełkami i zmierz transmisję za pomocą spektrometru UV-Visible-NIR (rysunek 2C).</li>
		<li>Upewnij się, że system jest prawidłowo wyłożony podstawą, a wiązka światła przechodzi przez ten sam obszar tkanki przed i po potraktowaniu jej roztworami barwników, aby zachować spójność. UWAGA: Rejestruj widma transmisji w zakresie długości fal od 400 nm do 2000 nm, używając średniej prędkości skanowania i interwału danych 1.0 nm. Pełne skanowanie spektralne trwa około 5 minut na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przezroczystość optyczna u żywych zwierząt
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt<ol>
		<li>Przed eksperymentem zmierz wagę zwierzęcia i zanotuj ogólny poziom aktywności, aby ustalić fizjologiczny punkt odniesienia.</li>
		<li>Użyj poduszki grzewczej o temperaturze ustawionej na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas eksperymentu. UWAGA: Stale monitoruj zwierzę, aby zapobiec przegrzaniu.</li>
		<li>Podać znieczulenie zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami odpowiednimi do obrazowania jamy brzusznej i mózgu.</li>
		<li>W przypadku znieczulenia wziewnego indukować izofluranem w stężeniu 1,5%-3% i natężeniu przepływu 0,8 l/min przez około 5 minut przed eksperymentem obrazowym i utrzymywać go na poziomie 1%-2% przez cały eksperyment. UWAGA: Stale monitoruj wzorzec i głębokość oddychania zwierzęcia. Używaj dobrze wentylowanego pomieszczenia, aby zminimalizować narażenie personelu na znieczulenie.</li>
		<li>Do znieczulenia iniekcyjnego przygotuj koktajl zawierający ketaminę HCL (16 mg/ml) i deksmedetomidynę HCL 0,2 mg/ml. Dawkowanie zależy od masy ciała zwierzęcia i zatwierdzonych protokołów instytucjonalnych.</li>
		<li>Przytnij futro za pomocą maszynki do strzyżenia małych zwierząt z żądanego obszaru obrazowania.</li>
		<li>Nałóż krem do depilacji na przycięty obszar skóry na mniej niż 60 sekund, aby usunąć resztki włosów. Natychmiast usuń krem i oczyść skórę chusteczkami nasączonymi alkoholem, aby uniknąć podrażnienia skóry.</li>
		<li>Jeśli stosuje się znieczulenie iniekcyjne z agonistami receptorów alfa-2 (np. deksmedetomidyną lub ksylazyną), po doświadczeniu należy podać atipamezol jako środek odwracający objawy. Monitoruj zwierzę podczas rekonwalescencji i upewnij się, że wraca do normalnego oddychania i poruszania się przed powrotem do klatki domowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura nadawania przezroczystości tkanki<ol>
		<li>Przygotuj zestaw do obrazowania, umieszczając pod zwierzęciem poduszkę grzewczą ustawioną na 37 °C, aby zapobiec hipotermii. Wyrównaj źródło światła i aparat, aby uchwycić obrazy.</li>
		<li>Do aplikacji użyj 0,65 M roztworu hydrożelu tartrazyny zmieszanego z 0,3%-0,4% żelu agarozowego (krok 1.2).</li>
		<li>Nanieść roztwór na skórę (brzuch lub głowę, w zależności od charakteru eksperymentu) za pomocą zakraplacza i pozostawić na kilka sekund, aby rozpocząć wchłanianie (ryc. 3A).</li>
		<li>Delikatnie wyszoruj obszar za pomocą bawełnianego wacika, aby równomiernie rozprowadzić roztwór barwnika i ułatwić wchłanianie przez skórę.</li>
		<li>Delikatnie masuj obszar czystym bawełnianym wacikiem i nałóż więcej roztworu, aż skóra zacznie być przezroczysta, a narządy wewnętrzne będą widoczne. Podczas wchłaniania na skórze najpierw pojawią się pomarańczowo-czerwone kropki, które stopniowo łączą się w jednolity kolor. Ta zmiana koloru jest kluczowym wizualnym wskaźnikiem odpowiedniej penetracji barwnika i początku oczyszczania optycznego. UWAGA: Upewnij się, że roztwór nie krystalizuje się w obszarze aplikacji - krystalizacja może blokować drogi skórne, utrudniając wchłanianie cząsteczek barwnika przez skórę, co jest bardzo ważne dla uzyskania przezroczystości. Wystarczająca absorpcja cząsteczek barwnika zmienia kolor skóry na pomarańczowo-czerwony.</li>
		<li>Kontynuuj delikatne masowanie obszaru, aż skóra zacznie wykazywać przezroczystość, a narządy wewnętrzne staną się widoczne. Proces ten trwa zazwyczaj około 3-5 minut masowania niewielkiego obszaru, ale czas trwania może się różnić w zależności od wielkości zwierzęcia i grubości skóry.</li>
		<li>Rób obrazy za pomocą wyrównanej kamery. Dostosuj ostrość, ekspozycję i balans bieli, aby zoptymalizować jakość obrazu.</li>
		<li>Delikatnie umieść szkiełko podstawowe lub szkiełko nakrywkowe na skórze, aby zminimalizować połysk i zmniejszyć odbicia, aby uzyskać lepszą jakość obrazów. UWAGA: Ze wszystkimi roztworami chemicznymi należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu) oraz utylizować zużyte materiały zgodnie z protokołami usuwania odpadów chemicznych instytucji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zwiększenie widoczności narządów dzięki przetwarzaniu obrazu
<ol>
	<li>Etapy przetwarzania obrazu<ol>
		<li>Python z OpenCV jest używany do przetwarzania obrazu. Zaimportuj OpenCV, numpy, matplotlib i PyWavelets.</li>
		<li>Załaduj i znormalizuj oryginalny obraz. Załaduj oryginalny obraz .tif o dużej głębi bitowej. Jeśli wartość któregokolwiek piksela przekracza 255, znormalizuj wszystkie piksele do zakresu [0, 255].</li>
		<li>Przytnij obszar zainteresowania (ROI). Wywołaj selektor ROI OpenCV, aby narysować obwiednię wokół obszaru organów. Kontynuuj tylko przy użyciu przyciętej wersji dla wszystkich kolejnych kroków. UWAGA: Upewnij się, że obwiednia szczelnie zamyka obszar docelowy, nie odcinając żadnych istotnych konstrukcji.</li>
		<li>Podziel się na kanały LAB. Przekonwertuj przycięty kolorowy obraz na przestrzeń kolorów LAB i podziel na kanały L (jasność), A i B. UWAGA: Obrazy są przetwarzane w kolorze, więc użyto przestrzeni kolorów lab, a techniki przetwarzania obrazu zastosowano tylko do kanału L, w którym znajdują się intensywności pikseli.</li>
		<li>Analizuj rozkład intensywności pikseli. Narysuj histogram kanału L, aby ocenić rozpiętość kontrastu i intensywności. UWAGA: Użyj histogramu, aby sprawdzić, czy wzmocnienie kontrastu jest konieczne i pomóc w wyborze parametrów wzmocnienia kontrastu. Chcesz, aby histogram był rozłożony w poprzek [0, 255].</li>
		<li>Zastosuj CLAHE (Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization) w celu lokalnego wzmocnienia kontrastu. Utwórz obiekt CLAHE z clipLimit = 5.0 i tileGridSize = (16,16). Uruchom CLAHE na kanale L i połącz kanał L wzbogacony o CLAHE z oryginalnymi kanałami A i B. W razie potrzeby przekonwertuj CLAHE z LAB na RGB w celu wizualizacji. UWAGA: Jeśli histogram pokazuje nadmiernie wzmocniony szum (skoki), dostosuj wartość "clipLimit" lub "tileGridSize" i zastosuj ponownie, aby uzyskać zrównoważony kontrast lokalny.</li>
		<li>Odszumianie obrazu ze wzmocnionym kontrastem. Wykonać 2-poziomową dyskretną dekompozycję falkową na znormalizowanym kanale CLAHE L (skalowanym [0, 1]) z miękkim progiem 0,1. Zrekonstruuj odszumiony kanał L, przeskaluj z powrotem do [0, 255] i połącz odszumiony kanał L z oryginalnymi kanałami A i B. Wyświetla oryginalny, przycięty kolorowy obraz w porównaniu z wynikiem odszumiania falkowego. UWAGA: Odszumianie falkowe redukuje niewielkie fluktuacje, które mogą zostać błędnie zinterpretowane jako pierwszy plan w jednolitych regionach.</li>
		<li>Segmentuj narządy zainteresowań za pomocą Adaptacyjnego Progowania Otsu. Oblicz próg Otsu na odszumionym kanale L. Odejmij odchylenie 15 od progu, aby uwzględnić obszary narządów o niskiej intensywności.<ol>
			<li>Zastosuj próg binarny z wartością odchylenia, aby uzyskać maskę pikseli narządu. Połącz maskę z oryginalnymi kanałami A i B i przekonwertuj na RGB do oglądania. UWAGA: Korekta odchylenia wymusza włączenie obszarów narządów znajdujących się pod naczyniami. W razie potrzeby ponownie dostosuj odchylenie dla innego zestawu danych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przejdź do analizy zgodnie z potrzebami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yun, S. H., Kwok, S. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+in+diagnosis%2C+therapy+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Light in diagnosis, therapy and surgery.</a> Nat Biomed Eng. 1 (1), 0008(2017).</li>
<li>Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTuchin%2C+VV+%22Optical+clearing+of+tissues+and+blood%22">Optical clearing of tissues and blood</a>. , SPIE Publications. (2005).</li>
<li>Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+3D+histology+powered+by+tissue+clearing%2C+omics+and+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep 3D histology powered by tissue clearing, omics and AI.</a> Nat Methods. 21 (7), 1153-1165 (2024).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues%3A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo optical clearing methods for biological tissues: Review.</a> Biomed Opt Express. 10 (10), 5251-5267 (2019).</li>
<li>Genina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+optical+clearing%3A+State+of+the+art+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Tissue optical clearing: State of the art and prospects.</a> Diagnostics. 12 (7), 1534(2022).</li>
<li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+penetration+depth+in+optical+coherence+tomography+and+photoacoustic+microscopy+in+vivo+enabled+by+absorbing+dye+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Enhanced penetration depth in optical coherence tomography and photoacoustic microscopy in vivo enabled by absorbing dye molecules.</a> Optica. 12 (1), 24-30 (2025).</li>
<li>Jia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrazine-enabled+optical+clearing+for+in+vivo+optical+resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Tartrazine-enabled optical clearing for in vivo optical resolution photoacoustic microscopy.</a> Biomed Opt Express. 16 (6), 2504-2515 (2025).</li>
<li>Zuo, T., Tao, C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbing+molecules+as+optical+clearing+agents+improve+the+resolution+and+sensitivity+of+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Absorbing molecules as optical clearing agents improve the resolution and sensitivity of photoacoustic microscopy.</a> Opt Lett. 50 (7), 2282-2285 (2025).</li>
<li>Narawane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+with+Tartrazine+enables+deep+transscleral+imaging+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Photonics+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical clearing with Tartrazine enables deep transscleral imaging with optical coherence tomography.</a> J Biomed Photonics Eng. 29 (12), 120501(2024).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+cellular+mapping+in+mouse+using+standard+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Whole-body cellular mapping in mouse using standard IgG antibodies.</a> Nat Biotechnol. 42, 617-627 (2024).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+optical+transparency+in+live+animals+with+absorbing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules.</a> Science. 385 (6713), eadm6869(2024).</li>
<li>Sai, T., Saba, M., Dufresne, E. R., Steiner, U., Wilts, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+refractive+index+fluids+using+the+Kramers-Kronig+relations%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Designing refractive index fluids using the Kramers-Kronig relations.</a> Faraday Discuss. 223, 136-144 (2020).</li>
<li>Yu, T., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+absorbing+molecules+make+tissue+transparent%3A+A+new+insight+for+understanding+tissue+optical+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Strongly absorbing molecules make tissue transparent: A new insight for understanding tissue optical clearing.</a> Light Sci Appl. 14 (1), 10(2025).</li>
<li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+W+%22Optical+coherence+tomography%3A+Technology+and+applications%22">Optical coherence tomography: Technology and applications</a>. Drexler, W., Fujimoto, J. G. , Springer International Publishing. Cham. 277-318 (2015).</li>
<li>Wang, F., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+mice%27%3A+Deep-tissue+live+imaging+using+food+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Transparent mice': Deep-tissue live imaging using food dyes.</a> Commun Biol. 7 (1), 1307(2024).</li>
<li>Yu, H., Liu, J. -B., Ma, Y. -S., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+live+mice+offer+more+possibilities+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Innov+Med%22%5BJournal%5D)">Transparent live mice offer more possibilities for biomedical research.</a> Innov Med. 2 (4), 100098(2024).</li>
<li>Shabbir, M. W., Biswas, S., Kajla, R., Nadella, S., Ou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+refractive+index+fluids+of+food+dye+for+light+propagation+through+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Commun%22%5BJournal%5D)">Designing refractive index fluids of food dye for light propagation through scattering media.</a> MRS Commun. , (2025).</li>
<li>Scheele, C. L. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+intravital+microscopy+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiphoton intravital microscopy of rodents.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).</li>
<li>Schmidt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+II+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Near-infrared II fluorescence imaging.</a> Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 23(2024).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono kompleksową i powtarzalną metodę protokołu w celu osiągnięcia przezroczystości optycznej w tkankach biologicznych wykorzystujących cząsteczki absorpujące, w szczególności zatwierdzony przez FDA barwnik spożywczy Tartrazyna (zatwierdzony do stosowania w produktach spożywczych, a nie w zastosowaniach medycznych). Metoda ta skutecznie minimalizuje wewnętrzne rozpraszanie w tkance poprzez zmianę współczynnika załamania światła w mikrośrodowisku tkanki, co zwiększa przezroczystość optyczną. Ba...

Obrazowanie biologiczne od dawna stanowi wyzwanie związane z rozpraszaniem światła, które przesłania interesujące nas struktury1. Techniki oczyszczania optycznego mają na celu zmniejszenie rozpraszania światła i zwiększenie przejrzystości wizualnej, umożliwiając wizualizację wcześniej ukrytych struktur2. Rozwój tych technik doprowadził do powstania różnorodnych metod mających na celu poprawę obrazowania optycznego tkanek biologicznych ex vivo, nawet całych zwierząt, bez fizycznej sekcji próbek3. Jednak opracowanie podobnych technik do zastosowań in vivo było wyzwaniem. Techniki takie jak CLARITY Clear Lipid-exchanged Azhybrydyzowany krylamidem Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel), oferują obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, ale nie są odwracalne, co czyni je nieodpowiednimi do badań na żywych zwierzętach4. Constantini i wsp. wykazali wolniejszy postęp w obrazowaniu in vivo w porównaniu z klarownością obrazowania ex vivo, co wynika ze złożoności utrzymania żywotności tkanek przy jednoczesnym unikaniu toksycznych poziomów czynników potrzebnych do przezroczystości tkanek5. Genina podkreśla, że przyszłość optycznego oczyszczania tkanek opiera się na metodach nieinwazyjnych i odwracalnych6. Ostatnie badania wykazały skuteczność rozpuszczalnych w wodzie barwników absorpcyjnych w oczyszczaniu optycznym in vivo. Na przykład Miller i wsp. wykazali, że miejscowe stosowanie tartrazyny znacznie zwiększyło głębię obrazowania zarówno w OCT, jak i mikroskopii fotoakustycznej (PAM) żywej skóry myszy, zmniejszając rozpraszanie i zwiększając współczynnik załamania światła składników tkanki śródmiąższowej7. Jia i wsp. zastosowali 15% w/w roztwór tartrazyny, aby poprawić obrazowanie in vivo PAM tkanki ucha i jamy brzusznej myszy, ujawniając drobne struktury mikronaczyniowe o rozdzielczości subkomórkowej, które w przeciwnym razie byłyby zasłonięte8. Zuo i wsp. zademonstrowali ponadto obrazowanie mózgu przez nienaruszoną skórę głowy i czaszkę u żywych myszy przy użyciu 0,6 M tartrazyny, osiągając czterokrotnie wyższą intensywność sygnału i 3,5-krotnie lepszą rozdzielczość w porównaniu z nieleczoną tkanką9. W innym zastosowaniu Narawane i wsp. umożliwili głębokie przeztwardówkowe obrazowanie OCT w oczach świń poprzez zastosowanie tartrazyny, uzyskując wyraźną wizualizację przestrzeni nadnaczyniówkowej, która wcześniej była niedostępna z powodu silnego rozpraszania twardówki10. Chociaż metody oczyszczania tkanek ex vivo, takie jak CLARITY i iDISCO (Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs), osiągają wysoką przezroczystość optyczną i rozdzielczość subkomórkową poprzez usuwanie lipidów lub oczyszczanie na bazie rozpuszczalników, często nie nadają się do obrazowania in vivo na żywych zwierzętach 4,11,12. Ograniczenie to wpływa na obrazowanie dynamiczne, które ma kluczowe znaczenie dla obrazowania biomedycznego dynamicznych procesów zachodzących wewnątrz żywych zwierząt, takich jak rozwój chorób i terapia.
Cząsteczki absorpcyjne o wysokiej rozpuszczalności w wodzie i wyraźnych kształtach pasm absorpcyjnych, takie jak tartrazyna, barwnik spożywczy, oferują obiecujące korzyści w osiąganiu przezroczystości optycznej u żywych zwierząt13. Dzięki specyficznemu wprowadzeniu tartrazyny, tkanka selektywnie absorbuje długości fal ultrafioletowych i niebieskich ze względu na unikalną charakterystykę widmową barwnika, co skutkuje zmodyfikowanym profilem współczynnika załamania, który zmniejsza rozpraszanie przy dłuższych falach. Ta sprzeczna z intuicją technika optycznego oczyszczania tkanek jest zoptymalizowana pod kątem obrazowania in vivo, a relacje Kramersa-Kroniga stanowią naukową podstawę dla obserwowanej przezroczystości przy użyciu silnie absorbujących cząsteczek, takich jak Tartrazyna14,15. W przypadku obrazowania in vivo tartrazynę łączy się z podgrzanymi cząsteczkami agarozy i wodą, aby stworzyć spójny roztwór, który lepiej przylega do skóry. Rozpuszczalny w wodzie charakter tartrazyny ułatwia również łatwe usuwanie roztworu na bazie barwnika z żywych zwierząt, zmniejszając potencjalne skutki długotrwałej ekspozycji na roztwory barwników. Ponadto metoda została dostosowana do różnych zastosowań biomedycznych w celu poprawy głębi obrazowania, rozdzielczości i czułości, w tym optycznej tomografii koherentnej 7,16 i obrazowania fotoakustycznego 7,9, wykazując jej potencjał dla szerszej społeczności obrazowania biomedycznego.
Wraz z rosnącym zainteresowaniem zastosowaniem cząsteczek absorpcyjnych w obrazowaniu biomedycznym17,18, w protokole przedstawiono szczegółową procedurę wykorzystania barwnika spożywczego do zastosowań ex vivo i in vivo, wraz z przetwarzaniem obrazu i odwracalnym obrazowaniem in vivo. Protokół ten stosuje się do tkanki piersi kurczaka w celu wykazania przezroczystości ex vivo, a następnie jest modyfikowany w celu obrazowania in vivo głowy i jamy brzusznej myszy, wykazując odwracalność. Roztwór nałożony na skórę myszy in vivo tworzy tymczasową, odwracalną przezroczystość bez uszkadzania integralności skóry lub tkanek. Technikę tę można zintegrować z procesem przetwarzania obrazu, w tym odszumiania, w celu stworzenia zoptymalizowanego protokołu obrazowania optycznego narządów wewnętrznych in vivo. W połączeniu techniki te umożliwiają lepsze nieinwazyjne, podłużne obrazowanie w celu obserwacji procesów biologicznych w czasie rzeczywistym. Stosowanie bezpieczniejszych środków, które wykazują odwracalność, przezwycięża wcześniejsze ograniczenia i zapewnia bardziej odpowiednią metodę dynamicznego obrazowania biologicznego.

<table><tbody><tr><td>Waga analityczna</td><td>HZK powiedział:</td><td>FA220S</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulania zwierząt</td><td>RWD nauki przyrodnicze co</td><td>TAIJI-IE</td><td>Wziewne środki znieczulające</td></tr><tr><td>Atipamezole HCL do wstrzykiwań 5 mg/ml</td><td>Okładka</td><td>82124</td><td>Znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Kamera CMOS</td><td>Laboratoria Thora</td><td>CS165CU/M, Zelux</td><td></td></tr><tr><td>Deksmedetomidyna HCL do wstrzykiwań 5 mg/10 ml</td><td>Okładka</td><td>72960</td><td>Znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Iluminator światła światłowodowego</td><td>RWD nauki przyrodnicze co</td><td>76301</td><td>Źródło światła do oświetlenia górnego</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>CravitySci</td><td>0303-2122</td><td>Szkiełka mikroskopowe najwyższej jakości</td></tr><tr><td>Koc homeotermiczny</td><td>RWD nauki przyrodnicze co</td><td>69027</td><td>Regulator temperatury zwierząt</td></tr><tr><td>Przetwarzanie obrazu</td><td>Otwórz CV</td><td>Pyton</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 0,5 ml 29 g</td><td>Punkt komfortu</td><td>26028</td><td>Znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Okładka</td><td>Kod produktu 029405</td><td>Wziewne środki znieczulające</td></tr><tr><td>Ketmine HCL do wstrzykiwań 100 mg / ml</td><td>Dechra (Głuch)</td><td>20042240</td><td>Znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>GGE corp (spółka kapitałowa)</td><td>TLB-01</td><td>Źródło światła do oświetlenia górnego</td></tr><tr><td>Soczewka</td><td>Laboratoria Thora</td><td>MVL4WA</td><td>Ogniskowa 3,5 mm i przysłona f/1,4</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Kościół & Dwight</td><td>L 1224</td><td>Krem do depilacji</td></tr><tr><td>PBS ph 7,4 (1x)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>2902869</td><td>Znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Końcówka Q-Tip</td><td>Purytańska firma produkująca produkty medyczne</td><td>Szpital 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Tartrazyna</td><td>MiliporeSigma</td><td>Numer CAS: 1934-21-0</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Marka rybacka</td><td>13-711-9AMMD</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS-NIR</td><td>Shimadzu powiedział:</td><td>SolidSpec-3700i</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Fiolki</td><td>Qorpak powiedział:</td><td>242633</td><td></td></tr><tr><td>Pipety miarowe</td><td>Badania Eppendorf plus</td><td>3123000063</td><td>100-1000 i mikro; L</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Nauka o awidności</td><td>SOLO S</td><td>Instrument</td></tr></tbody></table>

przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Transient Optical Clearing Using Absorbing Molecules for Ex Vivo and In Vivo Imaging

Obrazowanie dynamiczne jest podstawowym narzędziem w biologii i medycynie, ale jest ograniczone przez rozpraszanie światła w żywych tkankach spowodowane niedopasowaniem współczynnika załamania światła, co zmniejsza głębokość penetracji i rozdzielczość w tkankach biologicznych. W ramach wcześniejszych prac wprowadzono nowatorskie podejście do osiągnięcia przezroczystości optycznej u żywych zwierząt poprzez wykorzystanie silnie absorbujących cząsteczek. Kiedy te absorbujące cząsteczki, takie jak tartrazyna, zatwierdzony przez FDA barwnik powszechnie stosowany w żywności, rozpuszczają się w wodzie, modyfikują współczynnik załamania światła środowiska wodnego poprzez relacje Kramersa-Kroniga. Modulacja ta pozwala na zmniejszenie niedopasowania współczynnika załamania światła między oddzielnymi składnikami w tkance o różnych współczynnikach załamania światła, łagodząc w ten sposób rozpraszanie. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię techniki oczyszczania tkanek przy użyciu wodnego roztworu na bazie tartrazyny, stosowanego zarówno do próbek ex vivo , jak i in vivo . Takie podejście odwracalnie sprawia, że żywe ciała myszy stają się przezroczyste w widzialnym spektrum, umożliwiając wyraźniejsze i głębsze obrazowanie wewnętrznych procesów i struktur. Następnie wykorzystano zaawansowany algorytm przetwarzania obrazu w celu poprawy kontrastu i segmentacji narządów będących przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo wykazano wysoką przezroczystość w próbkach ex vivo , takich jak pierś z kurczaka, poddanych działaniu roztworu na bazie tartrazyny. Metoda ta oferuje wszechstronne i przystępne podejście do zwiększania możliwości obrazowania w różnych modalnościach i toruje drogę do postępu w zrozumieniu złożonych systemów biologicznych.

Wykazanie przezroczystości optycznej w tkance piersi kurcząt ex vivo Aby zbadać propagację światła w tkance ex vivo , użyliśmy pokrojonych kawałków surowej piersi kurczaka bez kości o grubości 1,5 mm, 2,5 mm i 3,5 mm (ryc. 2B). Tkanki zostały przecięte równolegle do włókien kolagenowych, zapewniając stałą orientację włókien mięśniowych. Obrazy wykonano przy użyciu zarówno wzoru siatki si...

Techniki oczyszczania optycznego, takie jak roztwory cząsteczek absorpcyjnych, tymczasowo zmniejszają rozpraszanie światła w celu poprawy obrazowania biologicznego i oferują biokompatybilne, odwracalne strategie obrazowania in vivo dla głęboko osadzonych narządów. Protokół ten przedstawia szczegółowe procedury eksperymentalne, a także zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości, dynamicznego obrazowania dynamiki w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Dynamic imaging is a foundational tool in biology and medicine, but it is limited by light scattering in live tissues caused by refractive index ...

Badania te mają na celu ocenę i wdrożenie oczyszczania tkanek przy użyciu cząsteczek absorpcyjnych jako nieinwazyjnej strategii poprawy obrazowania biomedycznego zarówno w tkankach ex vivo, jak i żywych zwierzętach. Wykazaliśmy, że barwnik spożywczy tartrazyna może być stosowany do uzyskania szybkiego i odwracalnego oczyszczenia optycznego zarówno w tkankach, jak i u żywych zwierząt, znacznie zwiększając głębię i klarowność obrazowania. Nasz protokół wypełnia krytyczną lukę w odtwarzalności przejściowego oczyszczania optycznego poprzez obserwację cząsteczek i zawiera zaawansowane techniki wizualizacji obliczeniowej w celu zwiększenia widoczności cech.Dostarczając szczegółowy protokół oczyszczania tkanek za pomocą cząsteczek absorpcyjnych, nasza praca pomaga szerszej społeczności badawczej zajmującej się biologią i obrazowaniem biomedycznym zastosować te metody w ich własnych badaniach. Nasze laboratorium rozwija tę technologię, badając fizyczną interakcję między światłem a tkanką, rozszerzając zakres dostępnych materiałów i opracowując zoptymalizowane platformy obrazowania optycznego. Na początek oblicz wymaganą masę barwnika tartrazyny w proszku, aby przygotować żądaną objętość ro

transient-optical-clearing-using-absorbing-molecules-for-ex-vivo-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Tutaj opisana jest metoda uczynienia tkanek roślinnych przezroczystymi przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Technika ta ułatwia głębokie obrazowanie oczyszczonych tkanek roślinnych bez fizycznego cięcia.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Odkryj przejściowe oczyszczanie optyczne z tartrazyną do obrazowania ex vivo i in vivo. Ta metoda wykorzystuje cząsteczki absorpcyjne do szybkiego, odwracalnego zwiększania głębokości i przejrzystości obrazowania biomedycznego.

Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Przeglądaj więcej filmów