Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo
11 lipca 2025
Techniki oczyszczania optycznego, takie jak roztwory cząsteczek absorpcyjnych, tymczasowo zmniejszają rozpraszanie światła w celu poprawy obrazowania biologicznego i oferują biokompatybilne, odwracalne strategie obrazowania in vivo dla głęboko osadzonych narządów. Protokół ten przedstawia szczegółowe procedury eksperymentalne, a także zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości, dynamicznego obrazowania dynamiki w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.
Badania te mają na celu ocenę i wdrożenie oczyszczania tkanek przy użyciu cząsteczek absorpcyjnych jako nieinwazyjnej strategii poprawy obrazowania biomedycznego zarówno w tkankach ex vivo, jak i żywych zwierzętach. Wykazaliśmy, że barwnik spożywczy tartrazyna może być stosowany do uzyskania szybkiego i odwracalnego oczyszczenia optycznego zarówno w tkankach, jak i u żywych zwierząt, znacznie zwiększając głębię i klarowność obrazowania. Nasz protokół wypełnia krytyczną lukę w odtwarzalności przejściowego oczyszczania optycznego poprzez obserwację cząsteczek i zawiera zaawansowane techniki wizualizacji obliczeniowej w celu zwiększenia widoczności cech.
Dostarczając szczegółowy protokół oczyszczania tkanek za pomocą cząsteczek absorpcyjnych, nasza praca pomaga szerszej społeczności badawczej zajmującej się biologią i obrazowaniem biomedycznym zastosować te metody w ich własnych badaniach. Nasze laboratorium rozwija tę technologię, badając fizyczną interakcję między światłem a tkanką, rozszerzając zakres dostępnych materiałów i opracowując zoptymalizowane platformy obrazowania optycznego. Na początek oblicz wymaganą masę barwnika tartrazyny w proszku, aby przygotować żądaną objętość roztworu.
Przenieś obliczoną ilość barwnika w proszku do czystej szklanej fiolki. Za pomocą pipety miarowej dodaj wymaganą objętość wody dejonizowanej do fiolki, aby zachować precyzję. Jeśli barwnik nie rozpuści się całkowicie w temperaturze pokojowej, umieść szklaną fiolkę w piecu laboratoryjnym nagrzanym do 40 stopni Celsjusza na 10 minut lub do całkowitego rozpuszczenia.
Następnie wiruj roztwór barwnika przez 30 sekund do jednej minuty, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. W przypadku tkanki ex vivo pokrój tkankę piersi kurczaka na żądaną grubość w kierunku równoległym do włókien kolagenowych i delikatnie wyczyść pokrojoną tkankę wodą. Umieść tkankę między dwoma czystymi szkiełkami mikroskopowymi, aby zmierzyć grubość.
Delikatnie dociśnij szkiełka do siebie i użyj kalibru noniusza, aby zmierzyć odległość w środku tkanki. Następnie namocz tkankę w przygotowanym roztworze barwnika. Umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej i potrząsaj z prędkością 100 obrotów na minutę przez 10 minut.
Usuń tkankę z roztworu barwnika za pomocą czystych kleszczyków. Umieść próbkę między dwoma przezroczystymi szkiełkami i uchwyć obrazy za pomocą kamery cyfrowej lub naukowej ustawionej na odpowiednią rozdzielczość i powiększenie. Przeprowadź proces obrazowania w kontrolowanym środowisku oświetleniowym, aby zminimalizować zakłócenia światła zewnętrznego.
Aby zmierzyć transmisję optyczną, należy umieścić przygotowaną próbkę w spektrometrze bliskiej podczerwieni w świetle UV. Upewnij się, że system jest prawidłowo wyłożony bazowo i że wiązka światła przechodzi przez ten sam obszar tkanki przed i po leczeniu roztworem barwnika, aby zachować spójność pomiaru. Do zabiegu należy umieścić znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą maszynki do strzyżenia małych zwierząt przytnij futro z żądanego obszaru obrazowania. Nałóż krem do depilacji na przycięty obszar na mniej niż 60 sekund, aby usunąć resztki włosów i natychmiast usuń krem. Oczyść skórę chusteczkami nasączonymi alkoholem, aby zapobiec podrażnieniom.
Aby przygotować zestaw do obrazowania, umieść pod zwierzęciem poduszkę grzewczą ustawioną na 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec hipotermii. Wyrównaj źródło światła i kamerę, aby uchwycić obrazy wysokiej jakości. Do aplikacji użyj 0,65 molowego roztworu tartrazyny zmieszanego z 0,3% do 0,4% żelu agarozowego.
Za pomocą zakraplacza nałóż przygotowany roztwór na skórę, na brzuch lub głowę, w zależności od eksperymentu. Pozostaw roztwór na kilka sekund, aby rozpocząć wchłanianie. Teraz za pomocą bawełnianego wacika delikatnie wyszoruj obszar aplikacji, aby równomiernie rozprowadzić roztwór i zwiększyć wchłanianie przez skórę.
Następnie delikatnie masuj obszar czystym bawełnianym wacikiem i w razie potrzeby nałóż więcej roztworu. Obserwuj pojawienie się pomarańczowych czerwonych kropek, które stopniowo łączą się w jednolity kolor, wskazując na udaną penetrację barwnika i początek oczyszczania optycznego. Kontynuuj masowanie obszaru, aż skóra stanie się przezroczysta i widoczne będą narządy wewnętrzne, co zwykle zajmuje około trzech do pięciu minut na małym obszarze.
Delikatnie umieść szkiełko lub szkiełko nakrywkowe na skórze, aby zmniejszyć połysk powierzchni i zminimalizować odbicia. Delikatnie oczyść roztwór barwnika ze skóry za pomocą bawełnianego wacika lub miękkiej szmatki zwilżonej wodą. Efekt optycznego oczyszczania odwróci się, a skóra stopniowo powróci do swojego pierwotnego nieprzezroczystego wyglądu.
Po wyłączeniu znieczulenia gazowego pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność. Gdy zwierzę jest w pełni przytomne i mobilne, wróć do klatki domowej. W nieleczonej tkance piersi kurcząt ex vivo podstawowe wzorce nie były widoczne, a dane ze spektrometru wykazały niskie wartości transmisji, które zmniejszały się wraz ze wzrostem grubości tkanki.
Po leczeniu 0,65-molowym roztworem tartrazyny tkanki stały się widocznie przezroczyste, a leżące pod nimi wzory siatki i logo pojawiły się wyraźnie. Zaobserwowano również znaczny wzrost wartości transmisji we wszystkich grubościach widma widzialnego. U żywych myszy zastosowanie 0,65 molowego roztworu tartrazyny umożliwiło wizualizację narządów wewnętrznych przez skórę w ciągu kilku minut po zabiegu, wykazując widocznie zwiększoną przezroczystość w okolicach brzucha.
Optyczne oczyszczenie skóry głowy pozwoliło na wizualizację naczyń krwionośnych mózgu bez chirurgicznego usuwania skóry, demonstrując skuteczność tej techniki w obrazowaniu mózgu. Efekt rozjemczy był w pełni odwracalny. Spłukanie tkanki wodą przywróciło zmętnienie i normalny wygląd skóry powrócił w ciągu kilku godzin, a odrost włosów obserwowano przez kilka dni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia procesy klarowania tkanek z wykorzystaniem cząsteczek absorbujących w celu usprawnienia obrazowania biomedycznego w tkankach ex vivo oraz u żywych zwierząt. Wykazano, że barwnik spożywczy tartrazyna służy jako szybki i odwracalny środek klarowania optycznego, zwiększający głębokość i klarowność obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Obrazowanie biomedyczne
- Techniki utrwalania i przejrzystości tkanek
- Obrazowanie optyczne
Wstęp
- Techniki utrwalania optycznego ograniczają rozpraszanie światła w celu uzyskania lepszego obrazowania.
- Odwracalne strategie obrazowania in vivo są kluczowe dla badania głęboko położonych organów.
- Konieczne jest opracowanie powtarzalnych metod w zakresie przejściowego utrwalania optycznego.
- Zaawansowane techniki obliczeniowe mogą zwiększyć widoczność cech w obrazowaniu.
Cel badania
- W celu oceny zastosowania cząsteczek absorbujących do nieinwazyjnej poprawy jakości obrazowania.
- W celu przedstawienia szczegółowego protokołu przejrzyszczania tkanek z użyciem tartrazyny.
- W celu wyeliminowania braków w powtarzalności metod optycznego przejrzyszczania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów barwnika tartrazyny do klarowania tkanek.
- Zastosowanie technik klarowania optycznego w modelach ex vivo oraz u żywych zwierząt.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik wizualizacji komputerowej.
- Ocena głębokości obrazowania oraz poprawy przejrzystości.
Główne wyniki
- Tartrazyna znacząco zwiększa głębokość i przejrzystość obrazowania.
- Wykazano szybkie i odwracalne przejaśnianie optyczne tkanek.
- Poprawiono powtarzalność metod przejściowego przejaśniania optycznego.
- Zaawansowane techniki wizualizacji zwiększają widoczność cech.
Wnioski
- Badanie dostarcza cenny protokół dla badaczy w dziedzinie obrazowania biomedycznego.
- Tartrazyna stanowi biokompatybilną opcję do optycznego klarowania tkanek.
- Wyniki wnoszą wkład do szerszej społeczności badawczej zajmującej się biologią i obrazowaniem biomedycznym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Przejściowe przejaśnianie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorbujących, takich jak tartrazyna, rozwiązuje krytyczny problem w obrazowaniu dynamicznym, umożliwiając głębszą i wyraźniejszą wizualizację struktur wewnętrznych zarówno w systemach ex vivo, jak i in vivo. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną odkryć opartych na obrazowaniu oraz wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnych i translacyjnych etapach badań. Odwracalny i powtarzalny charakter tego podejścia sprawia, że stanowi ono wielokrotnie używalną platformę dla innowacji w zakresie obrazowania w całym portfolio badawczym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację wewnętrznych struktur tkankowych w celu walidacji celów w oparciu o postawione hipotezy.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną poprzez wyjaśnienie granic tkanek i morfologii organów in situ.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego, dostarczając wysokokontrastowe i powtarzalne dane obrazowe.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Ułatwia przygotowanie optycznie przezroczystych próbek biologicznych do ilościowych analiz obrazowania.
- Poprawia powtarzalność analiz poprzez standaryzację warunków klarowania tkanek i obrazowania.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków w sklarowanych tkankach przy zwiększonej rozdzielczości w głąb.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania do modeli istotnych dla danej choroby poprzez nieinwazyjną wizualizację narządów wewnętrznych u żywych zwierząt.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki możliwości przeprowadzania odwracalnych i powtarzalnych sesji obrazowania.
- Stanowi platformę do zaawansowanej segmentacji obliczeniowej i ekstrakcji cech w badaniach translacyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda przejaśniania optycznego wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając obrazowanie o wysokiej wierności na wielu etapach procesu, od wczesnego testowania hipotez po walidację modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez bezpośrednią wizualizację architektury tkanek.
- Screening: Zapewnia znormalizowane, powtarzalne warunki obrazowania do opracowywania ilościowych testów.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące transmisji i segmentacji w celu rzetelnego porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Umożliwia nieinwazyjne, odwracalne obrazowanie w żywych modelach zwierzęcych na potrzeby badań nad biomarkerami i progresją chorób.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalny, odwracalny protokół przejrzyszczania, który można dostosować do różnych typów tkanek i platform obrazowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na obrazowaniu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy obrazowania i zwiększa powtarzalność wyników pomiędzy zespołami.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając głębszych i wyraźniejszych danych obrazowych do oceny kandydatów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka dzięki wsparciu solidnego, nieinwazyjnego obrazowania w wielu programach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie przygotowania tkanek, sporządzania barwników oraz obsługi aparatury obrazowej.
- Wymaga dostępu do spektrometrów, kamer o wysokiej rozdzielczości oraz narzędzi do analizy obliczeniowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów utrudniania i obrazowania w obrębie zespołów w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość dostosowania do różnych typów tkanek i modeli zwierzęcych poprzez optymalizację protokołu.
- Odwracalność i biokompatybilność muszą zostać zwalidowane dla każdego nowego kontekstu zastosowania.
