Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników
August 29th, 2025
Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.
Jednoczesna mikroskopia multiharmoniczna autofluorescencyjna bez znaczników (mikroskopia SLAM) rejestruje unikalne informacje w próbkach biologicznych poprzez pomiar nieliniowych oddziaływań ze światłem. W naszym laboratorium używamy tej techniki do badania życia i chorób w skali mikroskopowej. Obserwujemy przejście w kierunku obrazowania multimodalnego bez znaczników, oferującego bogatszy wgląd w struktury i dynamikę komórek i tkanek, przy jednoczesnym unikaniu toksyczności i umożliwieniu komplementarnych kontrastów i korelacji między modalnościami.
Najnowocześniejsze mikroskopy nieliniowe bez etykiet rejestrują jeden sygnał na raz, co grozi niewspółosiowością, uszkodzeniem zdjęć i wieloma współbieżnymi procesami. SLAM rozwiązuje te problemy, umożliwiając ściśle współrejestrowany kontrast multimodalny, zapewniając wiarygodne dane przestrzenne i czasowe. Technika ta umożliwia jednoczesne wzbudzenie i detekcję czterech kanałów w mikroskopie wielofotonowym.
Wykorzystanie fotonicznego światłowodu krystalicznego do poszerzenia impulsów dla SHG, THG oraz fluorescencji dwu- i trzyfotonowej. SLAM przechwytuje zwielokrotnione informacje o metabolicznej, strukturalnej i dynamicznej sygnalizacji komórkowej bez artefaktów wyrównania lub etykiet egzogennych, umożliwiając standaryzowaną ilościową analizę tkanek. Jego zastosowania obejmują biologię podstawową, badania translacyjne i odkrywanie biomarkerów w onkologii, neurodegeneracji i regeneracji tkanek.
Na początek użyj spektrometru lub optycznego analizatora widma, aby zmierzyć laser za zwierciadłem parabolicznym i zweryfikować generowanie superkontinuum światłowodu fotonicznego. Obróć płytę w połowie drogi za rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej, aby zoptymalizować szerokość superkontinuum. Włącz autokorelator mikroskopowy.
W oprogramowaniu ustaw detektor na detektor wewnętrzny i dostosuj zakres skanowania do 5 pikosekund, aby uchwycić pełną szerokość autokorelacji impulsów. Odblokuj laser i ustaw autokorelator w stosunku do wiązki wychodzącej z kształtownika impulsów, aż pojawi się sygnał. Upewnij się, że migawka 2 jest zamknięta.
Następnie nałóż odpowiednie media immersyjne, takie jak woda lub olej, na soczewkę obiektywu. Umieść zewnętrzny detektor autokorelatora na stoliku mikroskopu i umieść go bezpośrednio nad obiektywem. Teraz włącz lustra galwanometru skanującego, aby ustawić ich napięcie na 0.
Otwórz migawkę i użyj tarczy fluorescencyjnej, aby potwierdzić, że wiązka dociera do detektora zewnętrznego. Ustaw detektor autokorelatora jako detektor zewnętrzny. Następnie dostosuj stage pozycja, aż pojawi się sygnał.
Dostosuj współczynniki wielomianowe kształtownika impulsów, aby iteracyjnie zminimalizować szerokość impulsu mierzoną przez autokorelator. Wraz ze zmniejszaniem się szerokości impulsu należy odpowiednio zmniejszyć zakres skanowania, aby poprawić dokładność i wizualizację funkcji autokorelacji. Upewnij się, że wejście lasera do światłowodu fotonicznego jest zablokowane i włącz laser.
Pozwól laserowi się rozgrzać przez 30 minut. Sprawdź, czy ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód, a następnie umieść miernik mocy optycznej na ścieżce wiązki tuż przed światłowodem fotonicznym. Naciśnij przycisk Kontrola, aby otworzyć migawkę 1 i zmierz moc wejściową.
Ponownie zamknij migawkę 1. Przesuń miernik mocy na wyjście światłowodu fotonicznego za zwierciadłem parabolicznym. Otwórz migawkę 1 i użyj wejściowego stolika trójosiowego, aby zmaksymalizować moc wyjściową.
Pozwól fotonicznemu światłowodowi krystalicznemu rozgrzać się przez 10 minut, a następnie ponownie zmaksymalizuj moc wyjściową za pomocą stolika trójosiowego i zarejestruj transmisję PCF. Przesuń miernik mocy za filtrem o neutralnej gęstości i obróć filtr, aby dostosować moc lasera docierającą do próbki. Pomnóż zmierzoną moc przez transmitancję pozostałego układu optycznego, aby określić moc próbki.
Teraz włącz galwanometry i scenę. Uruchom oprogramowanie akwizycyjne i wprowadź żądane parametry obrazowania. Umieść próbkę na stoliku przy użyciu tego samego środka zanurzeniowego, który został wcześniej nałożony na soczewkę obiektywu.
Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i zasłoń zasłony, aby zapobiec przedostawaniu się światła z otoczenia. Następnie włącz zasilacze i wzmacniacze czujki. Zamknij kaseton świetlny otaczający stolik mikroskopu.
Użyj elektronicznych przełączników sterujących, aby ręcznie otworzyć przesłony czujki 3-6. W oprogramowaniu do akwizycji naciśnij opcję Kliknij, aby rozpocząć akwizycję, aby rozpocząć obrazowanie SLAM. Wyreguluj ostrość mikroskopu za pomocą stage pokrętło regulatora, aż sample będzie wyraźnie widoczne.
Użyj joysticka na sterowniku stolika mikroskopu, aby znaleźć żądane pole view. Po ustawieniu kliknij przycisk Zatrzymaj i zresetuj. Na karcie Zapisywanie przełącz opcję Zapisz dane na Tak.
Następnie naciśnij opcję Kliknij, aby rozpocząć akwizycję i poczekaj na zakończenie obrazowania. Aby manipulować próbką podczas obrazowania, zamknij przesłony detektora i użyj latarki lub czołówki do oświetlenia. Po dokonaniu regulacji wróć do ustawień obrazowania.
Aby zakończyć akwizycję obrazu, zamknij przesłony czujników, wyłącz czujniki, a dopiero potem włącz światła w pomieszczeniu. Zablokuj laser za pomocą migawki 1, a następnie wyłącz laser. Wyłącz galwanometry i stage i zamknij oprogramowanie do akwizycji.
Próbkę tkanki należy odpowiednio zutylizować i oczyścić stanowisko pracy. Prawidłowo rozszczepione fotoniczne włókno krysliczne miało płaską powierzchnię końcową prostopadłą do jego osi i czystą powierzchnię. Słabo rozszczepione fotoniczne włókna krystaliczne wykazywały ukośne cięcia, wyszczerbione powierzchnie i wyraźne rysy lub zanieczyszczenia na powierzchni.
Niewłaściwa obsługa lub zanieczyszczenie spowodowało widoczne nagromadzenie brudu i cząstek stałych wokół powierzchni włókna, zasłaniając wzór otworów wentylacyjnych. Spalone jądro z pociemniałymi obszarami wskazywało na uszkodzony fotoniczny światłowód krystaliczny pod koniec swojego życia. Widmo superkontinuum obejmowało około 975-1 175 nanometrów z płaskim wierzchołkiem i wyraźnymi modulacjami spektralnymi.
Autokorelacja impulsów po kompresji wykazała symetryczny profil z wąskim maksimum połówkowym na całej szerokości, co wskazuje na dobre kształtowanie impulsu. Prawidłowo działające źródła superkontinuum wytwarzały silne sygnały drugiej i trzeciej harmonicznej. Zawężone superkontinuum powodowało utratę intensywności sygnału trzeciej harmonicznej przy zachowaniu sygnału drugiej harmonicznej.
Brak kształtowania impulsów drastycznie zmniejszył wszystkie sygnały nieliniowe, dając słaby obraz o niskim kontraście. Udane obrazowanie SLAM tkanki nerkowej ex vivo wykazało wyraźne struktury nefronów z wieloma silnymi sygnałami optycznymi, w tym generowaniem trzeciej harmonicznej i fluorescencją NADPH. Śródmiąższowe włókna kolagenowe nerek można było zidentyfikować za pomocą silnych sygnałów generacji drugiej harmonicznej.
Obraz współczynnika redoks wskazywał na podwyższony tlenowy metabolizm mitochondrialny w kanalikach proksymalnych kory nerkowej w porównaniu z rdzeniem. Druga mapa współczynnika redoks potwierdziła przestrzenną zmienność metabolizmu oksydacyjnego i glikolitycznego, wzmacniając zróżnicowane zużycie energii w tkance.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia szczegółowy przewodnik po technice mikroskopii jednoczesnej autofluorescencji wieloharmonicznej bez oznaczników (SLAM), która rejestruje unikalne informacje w próbkach biologicznych. SLAM rozwija nieliniową mikroskopię poprzez pomiar czterech uzupełniających się kontrastów bez oznaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Mikroskopia SLAM mierzy nieliniowe interakcje ze światłem.
- Ta technika umożliwia jednoczesne pobudzenie i wykrycie czterech kanałów.
- Zapewnia bogatsze wgląd w struktury komórkowe i tkankowe.
- SLAM unika toksyczności i umożliwia uzupełniające kontrasty w różnych modalnościach.
Cel badania
- Aby badać życie i choroby na skalę mikroskopijną.
- Aby przeciwdziałać problemom z niezgodnością i uszkodzeniem świetlnym w tradycyjnej obrazowaniu.
- Aby umożliwić niezawodne zbieranie danych przestrzennych i czasowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie próbek tkankowych do obrazowania.
- Przeprowadzanie obrazowania za pomocą mikroskopii SLAM.
- Analiza danych uzyskiwanych z procesu obrazowania.
- Generowanie źródła światła laserowego dla mikroskopii.
Główne wyniki
- SLAM zapewnia współrejestrowaną multimodalną kontrast.
- Zwiększa zrozumienie mikrośrodowisk tkankowych.
- Zebrane dane są wiarygodne i kompleksowe.
- Mikroskopia SLAM ułatwia zaawansowane badania biologiczne.
Wnioski
- Mikroskopia SLAM jest istotnym postępem w technikach obrazowania.
- Pozwola na szczegółową analizę próbek biologicznych bez oznaczników.
- Ta technika ma potencjał do poprawy badań w różnych dziedzinach biologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
