Name: Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj mikroskopię SLAM do bezznacznikowego obrazowania wielomodalnego tkanek biologicznych. Ta zaawansowana technika pozwala jednocześnie rejestrować cztery kanały kontrastu, eliminując błędy wyrównania i uszkodzenia fototoksyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie sprzętu użytego w tym badaniu zostało częściowo zapewnione przez GSK za pośrednictwem Centrum Optycznego Obrazowania Molekularnego w Beckman Institute for Advanced Science and Technology. Prace te były również częściowo wspierane przez NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) oraz Centrum Nauki i Technologii NSF ds. Ilościowej Biologii Komórki. K.K.D.T był wspierany przez NIEHS Research Training Program w zakresie toksykologii i zdrowia środowiskowego (5T32ES007326-25), A.D.C był wspierany przez program Beckman Institute for Advanced Science and Technology Postdoctoral Fellows, a AH był wspierany przez NIBIB Tissue Microenvironment Training Program (T32EB019944). Autorzy dziękują Daroldowi Spillmanowi za zarządzanie przestrzeniami laboratoryjnymi, sprzętem i technologią, a także dziękują dr Janet E. Sorrells i Rishyashringowi R. Iyerowi za ich wcześniejszy wkład w system mikroskopowy SLAM wykorzystany w tym badaniu.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wygenerowanie odpowiedniego superkontinuum ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania SLAM, ale może być trudne ze względu na złożoność konfiguracji PCF. Zapewnienie precyzyjnego rozłupywania i ostrożnego obchodzenia się z PCF jest niezbędne do utrzymania czystych powierzchni wolnych od zanieczyszczeń, brudu lub zadrapań, które mogą zakłócać efektywne sprzęganie, generowanie superkontinuum, a nawet skrócić żywotność PCF. Ponieważ PCF wymaga regularnej wymiany, ćwiczenie rozszczepiania włókien i dostrajanie ustawień ta...

Nieliniowa mikroskopia optyczna wykorzystuje reakcję próbki na intensywne promieniowanie optyczne (światło o polach elektrycznych większych niż 3 ×10 3 V/cm) w celu uzyskania kontrastu obrazu, gdzie indukowana polaryzacja (a tym samym generowany sygnał) zależy nieliniowo od intensywności padania 1,2,3. Ponieważ te wielokrotne kontrasty są mediowane przez różne interakcje światło-materia, mikroskopia nieliniowa zapewnia jednoczesny dostęp do unikalnych informacji dotyczących zarówno morfologii, jak i krajobrazu chemicznego próbki 1,2,3. Podczas gdy tradycyjne techniki mikroskopowe obejmujące liniową interakcję ze światłem świetlnym również umożliwiają obrazowanie ilościowe, mikroskopia nieliniowa pozwala na bardziej multimodalne podejście, często poprawiając głębię obrazowania i przekrój optyczny, jednocześnie powodując mniejsze fotouszkodzeniapróbki4. W kontekście zastosowań biomedycznych, takich jak śródoperacyjna ocena histologicznatkanek 5,6, technika ta umożliwia bezpośrednie sondowanie natywnych biomolekuł, ułatwiając bezproblemowe badania żywych komórek bez konieczności stosowania zewnętrznych markerów lub modyfikacji. Takie podejście pozwala uniknąć stosowania znaczników, etykiet7, cząsteczek egzogennych, genetycznie wyrażanych białek fluorescencyjnych lub nanocząstek, które nie tylko wymagają dużego nakładu pracy, ale także mogą zakłócić natywną biochemię próbki i negatywnie wpłynąć na docelowe komórki lub tkanki 8,9,10. W ten sposób mikroskop nieliniowy służy jako potężne i autentyczne narzędzie analityczne, które zapewnia ciągłe obrazowanie struktur mikroskopowych bez zmiany integralności chemicznej i strukturalnej próbki. Ta funkcja otwiera szeroki wachlarz zastosowań, począwszy od diagnozy i odkrywania leków, a skończywszy na sygnalizacji komórkowej i biologii systemów.
Kontrasty wielofotonowe, takie jak autofluorescencja dwufotonowa (2PAF), autofluorescencja trójfotonowa (3PAF), generacja drugiej harmonicznej (SHG) i generacja trzeciej harmonicznej (THG), dają korzyści analityczne w charakteryzowaniu próbek. 2PAF jest generowany przez endogenne flawiny, przy czym dinukleotyd flawino-adenozynowy (FAD) jest najliczniejszy w systemach biologicznych11. 3PAF wykorzystuje wzbudzenie w bliskiej podczerwieni do wizualizacji wewnętrznych chromoforów, takich jak NAD(P)H, i umożliwia obrazowanie metaboliczne, jednocześnie omijając problemy związane z fototoksycznością i tłumieniem związane z promieniowaniem UV12. SHG w szczególności ujawnia niecentrosymetryczne struktury molekularne, takie jak kolagen fibrylarny (typy I, II i III) oraz macierze białkowe 13,14,15,16,17, dostarczając wglądu strukturalnego 1. Wreszcie, THG, wrażliwy na interfejsy i małe cechy strukturalne, przoduje w obrazowaniu rozkładów lipidów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych 18,19,20,21,22.
Każdy z tych sygnałów kontrastowych został niezależnie zbadany przez grupy badawcze, ustanawiając niszę dla wielofotonowej mikroskopii nieliniowej jako niezawodnego i wszechstronnego narzędzia do zastosowań biologicznych 23,24,25,26. Wysiłki te zostały zainicjowane przez wynalazców mikroskopu 2PAF, którzy wykorzystali swoją innowacyjną technologię, aby uzyskać nowe informacje na temat morfologii tkanek, metabolizmu komórek, a nawet morfofunkcjonalnych cech patologii, takich jak choroba Alzheimera i rak23. Ich praca ostatecznie doprowadziła do przełomowych zastosowań w neuronauce27,28. W kolejnych latach kilku badaczy zwróciło uwagę na wrażliwość SHG na zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej, rusztowaniu, które zapewnia strukturalne wsparcie komórkom i które ulega znacznym zmianom podczas patogenezy raka29. Warto zauważyć, że Campagnola i wsp.14,24,30,31 wykazali, że mikroskopia SHG umożliwia wizualizację zespołów makromolekularnych i supramolekularnych, ujawniając szczegóły, takie jak układ, stężenie i rodzaj kolagenu, które nie są wykrywalne za pomocą konwencjonalnych technik opartych na fluorescencji. Wyniki te podkreśliły potencjał mikroskopii SHG jako realnego narzędzia diagnostycznego w warunkach klinicznych. Wreszcie, mikroskopia THG została z powodzeniem zastosowana do wizualizacji warstw siatkówki u gryzoni w rozdzielczości subkomórkowej25, mapowania struktur mózgu32 i uchwycenia wielofazowej topografii inwazji komórek czerniaka33.
Te historyczne zastosowania mikroskopii nieliniowej zazwyczaj obejmowały laser femtosekundowy (fs) z synchronizacją modów sprzężony z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (NA) w celu generowania i zbierania sygnałów nieliniowych, które następnie były kierowane za pomocą zwierciadła dichroicznego do filtra pasmowoprzepustowego i zbierane za pomocą lampy fotopowielacza (PMT)34. Pomimo podobnych implementacji, większość aplikacji skupiała się na pozyskaniu tylko jednego, a co najwyżej dwóch kontrastów, pomijając pozostałe. Aby w pełni wykorzystać potencjał mikroskopu wielofotonowego, Boppart i in. najpierw zaimplementowali sekwencyjną akwizycję wielu kontrastów nieliniowych 21,35,36,37, a następnie ich jednoczesną detekcję 4,22,38,39,40,41 . Uzyskana w ten sposób technika, znana jako mikroskopia SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), rejestruje przestrzennie i czasowo nieliniowe sygnały 2PAF, 3PAF, SHG i THG poprzez wzbudzenie pojedynczego strzału i detekcję multipleksową, uzyskując w ten sposób doskonałą moc analityczną. Kolokacja czasoprzestrzenna tych czterech kanałów zapewnia wysoko uszeregowane i bogate w funkcje dane42 oferując przewagę nad danymi pozyskiwanymi sekwencyjnie, eliminując artefakty ruchu i zapewniając lepszą rejestrację obrazu. W związku z tym SLAM umożliwia generowanie cech kompozytowych, takich jak optyczne współczynniki redukcji i utleniania, które skutecznie charakteryzują właściwości metaboliczne 43,44,45. Co więcej, połączona analiza sygnałów z różnych modalności ułatwia projektowanie dodatkowych funkcji w oparciu o korelację i kolokalizację kanałów. Na przykład Shi i in. wykazali znaczenie cech kolokalizacji mikroskopii SLAM w dokładnej klasyfikacji komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) stosowanych w produkcji farmaceutycznej42. W ten sposób SLAM kładzie podwaliny pod to, co jest obecnie uważane za najnowocześniejsze w mikroskopii wielofotonowej, torując drogę dla przyszłych postępów w tej dziedzinie46.
W niniejszym protokole przedstawiamy kluczowe elementy mikroskopu SLAM (rysunek 1) i opisujemy krok po kroku metodologię jego wdrażania. Obejmuje to generowanie i kształtowanie impulsów wzbudzenia, przygotowanie reprezentatywnych próbek tkanek, procedury obrazowania i przetwarzanie, a także wyświetlanie uzyskanych danych. Dzięki wykorzystaniu gotowej technologii i sprawdzonych technik, protokół ten jest uniwersalny, przenośny i może być łatwo powielany przy użyciu podobnych systemów optycznych w różnych laboratoriach.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Rysunek 1: Konstrukcja optyczna mikroskopu multiharmonicznego z autofluorescencją bez znaczników (SLAM). Laser femtosekundowy emituje światło o długości fali 1040 nm w impulsach o długości fali 370 fs z częstotliwością powtarzania 10 MHz. Intensywność i polaryzacja lasera są dokładnie kontrolowane przed pompowaniem kryształu fotonicznego w celu wytworzenia superkontinuum. Impulsy są następnie kompresowane przez kształtownik impulsów i kierowane do dostosowanego do potrzeb laserowego mikroskopu skaningowego (pudełko przerywane). Zwierciadła dichroiczne i filtry pasmowoprzepustowe izolują nieliniowe sygnały generowane przez próbkę, zanim zostaną wykryte przez detektory fotonów o wysokiej czułości, takie jak fotopowielacze (PMT) lub fotodetektory hybrydowe (HPD). Konstrukcja optyczna oparta jest na wcześniej opisanym układzie41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Stolik 3-osiowy</td><td>ThorLabs powiedział:</td><td>MAX316</td><td>Przerwać.</td></tr><tr><td>Szklana antena obrazowa 35 mm</td><td>MatTek powiedział:</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Niepowlekane szkło nakrywkowe #0.</td></tr><tr><td>DMEM (DMEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>21063029</td><td>Wysoki poziom glukozy, HEPES, brak czerwieni fenolowej.</td></tr><tr><td>Suplementy pożywki do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Komórka promocyjna</td><td>C-39210</td><td>Pomiń płodową surowicę cielęcą.</td></tr><tr><td>Laser femtosekundowy FemtoTrain</td><td>Fizyka widm</td><td>1040-5</td><td>Moc średnia: >5,0 W, Energia impulsu: >500 nJ, Długość fali: 1040 nm &plusmn; 8 nm, Częstotliwość powtarzania: 10 MHz, Szerokość impulsu (FWHM): < 220 fs.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>SH30071.03</td><td>Scharakteryzowany HyClone.</td></tr><tr><td>Ściągacz izolacji z włókien</td><td>ThorLabs powiedział:</td><td>Zobacz materiał T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa dinukleotydu flawinoadeninowego hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F6625 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Lustra galwanometryczne</td><td>Technologia Cambridge</td><td>6215H</td><td>Przerwać.</td></tr><tr><td>Stanowisko do obróbki szkła</td><td>Vytran powiedział:</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ObrazJ</td><td>Laboratorium Eliceiri na Uniwersytecie Wisconsin w Madison</td><td>Wersja 2.16.0</td><td>Dystrybucja FIDŻI.</td></tr><tr><td>Bibuła Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Profesjonalistka</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Stolik mikroskopowy</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>FTP-2050 (wersja elektroniczna)</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler stolika mikroskopu</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autokorelator mikroskopowy</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Zanurzenie w wodzie, 25-krotne powiększenie, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Miernik mocy optycznej</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>Optyczny analizator widma</td><td>ThorLabs powiedział:</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fotoniczne światłowód krystaliczny</td><td>NKT Photonics</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Duży obszar trybu, utrzymanie polaryzacji. Średnica rdzenia: 15 &mikrom.</td></tr><tr><td>Precyzyjna obcinarka do światłowodów</td><td>Fujikura powiedział:</td><td>Zobacz materiał CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Kształtownik impulsów</td><td>Rozwiązania biofotoniczne Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Przerwać.</td></tr><tr><td>&beta;-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

Nieliniowa mikroskopia optyczna obrazuje próbki biologiczne poprzez wykrywanie sygnałów z nieliniowego oddziaływania ultrakrótkich impulsów laserowych z cząsteczkami endogennymi. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację chemiczną i strukturalną w rozdzielczości subkomórkowej w sposób nieniszczący i wolny od znaczników lub znaczników, umożliwiając w ten sposób skuteczne podejście do badania komórek i tkanek. Te charakterystyczne nieliniowe kontrasty obejmują autofluorescencję wzbudzoną wieloma fotonami i generowanie harmonicznych. Ponieważ każdy z tych kontrastów ma unikalne zalety i ograniczenia, ich połączenie i czasoprzestrzenna współrejestracja zapewniają komplementarną paletę kontrastów, która zwiększa możliwości analityczne nieliniowej mikroskopii optycznej. Dlatego nasza grupa opracowała mikroskopię SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), technikę obrazowania, która mierzy cztery lub więcej jednocześnie generowanych nieliniowych sygnałów optycznych, mając na celu zidentyfikowanie odrębnych cech morfologicznych, metabolicznych i funkcjonalnych w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania tkanek w SLAM, skupiając się na istotnych elementach techniki, w tym źródle lasera, kompresji impulsu i mikroskopie. Ponadto omówiono przygotowanie próbki i nakreśliliśmy proces przetwarzania danych dla danych SLAM. Prezentowany przepływ pracy nadaje się do badania stanu metabolicznego, układu, odpowiedzi komórkowych i składu tkanek zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych bez polegania na etykietach egzogennych.

Złożone, wielokanałowe, multimodalne podejście mikroskopu SLAM (ilustracja 1) może utrudniać nowym użytkownikom rozwiązywanie problemów i zrozumienie wyników. Po pierwsze, dobrze rozcięty PCF ma czystą powierzchnię (rysunek 2C) z płaską powierzchnią prostopadłą do długości PCF (rysunek 2A). Ukośna, wyszczerbiona powierzchnia rozszczepienia (rysunek 2B) i obecność zadrapań (rysunek 2...

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

Jednoczesna mikroskopia multiharmoniczna autofluorescencyjna bez znaczników (mikroskopia SLAM) rejestruje unikalne informacje w próbkach biologicznych poprzez pomiar nieliniowych oddziaływań ze światłem. W naszym laboratorium używamy tej techniki do badania życia i chorób w skali mikroskopowej. Obserwujemy przejście w kierunku obrazowania multimodalnego bez znaczników, oferującego bogatszy wgląd w struktury i dynamikę komórek i tkanek, przy jednoczesnym unikaniu toksyczności i umożliwieniu komplementarnych kontrastów i korelacji między modalnościami.Najnowocześniejsze mikroskopy nieliniowe bez etykiet rejestrują jeden sygnał na raz, co grozi niewspółosiowością, uszkodzeniem zdjęć i wieloma współbieżnymi procesami. SLAM rozwiązuje te problemy, umożliwiając ściśle współrejestrowany kontrast multimodalny, zapewniając wiarygodne dane przestrzenne i czasowe. Technika ta umożliwia jednoczesne wzbudzenie i detekcję czterech kanałów w mikroskopie wielofotonowym.Wykorzystanie fotonicznego światłowodu krystalicznego do poszerzenia impulsów dla SHG, THG oraz fluorescencji dwu- i trzyfotonowej. SLAM przechwytuje zwielokrotnione informacje o metabolicznej, strukturalnej i dynamicznej sygnalizacji komórkowej bez artefaktów wyrównania lub etykiet egzogennych, umożliwiając standaryzowaną ilościową analizę tkanek. Jego zastosowania obejmują biologię podstawową, badania translacyjne i odkrywanie biomarkerów w onkologii, neurodegeneracji i regeneracji tkanek.Na początek użyj spektrometru lub optycznego analizatora widma, aby zmierzyć laser za zwierciadłem parabolicznym i zweryfikować generowanie superkontinuum światłowodu fotonicznego. Obróć płytę w połowie drogi za rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej, aby zoptymalizować szerokość superkontinuum. Włącz autokorelator mikroskopowy.W oprogramowaniu ustaw detektor na detektor wewnętrzny i dostosuj zakres skanowania do 5 pikosekund, aby uchwycić pełną szerokość autokorelacji impulsów. Odblokuj laser i ustaw autokorelator w stosunku do wiązki wychodzącej z kształtownika impulsów, aż pojawi się sygnał. Upewnij się, że migawka 2 jest zamknięta.Następnie nałóż odpowiednie media immersyjne, takie jak woda lub olej, na soczewkę obiektywu. Umieść zewnętrzny detektor autokorelatora na stoliku mikroskopu i umieść go bezpośrednio nad obiektywem. Teraz włącz lustra galwanometru skanującego, aby ustawić ich napięcie na 0.Otwórz migawkę i użyj tarczy fluorescencyjnej, aby potwierdzić, że wiązka dociera do detektora zewnętrznego. Ustaw detektor autokorelatora jako detektor zewnętrzny. Następnie dostosuj stage pozycja, aż pojawi się sygnał.Dostosuj współczynniki wielomianowe kształtownika impulsów, aby iteracyjnie zminimalizować szerokość impulsu mierzoną przez autokorelator. Wraz ze zmniejszaniem się szerokości impulsu należy odpowiednio zmniejszyć zakres skanowania, aby poprawić dokładność i wizualizację funkcji autokorelacji. Upewnij się, że wejście lasera do światłowodu fotonicznego jest zablokowane i włącz laser.Pozwól laserowi się rozgrzać przez 30 minut. Sprawdź, czy ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód, a następnie umieść miernik mocy optycznej na ścieżce wiązki tuż przed światłowodem fotonicznym. Naciśnij przycisk Kontrola, aby otworzyć migawkę 1 i zmierz moc wejściową.Ponownie zamknij migawkę 1. Przesuń miernik mocy na wyjście światłowodu fotonicznego za zwierciadłem parabolicznym. Otwórz migawkę 1 i użyj wejściowego stolika trójosiowego, aby zmaksymalizować moc wyjściową.Pozwól fotonicznemu światłowodowi krystalicznemu rozgrzać się przez 10 minut, a następnie ponownie zmaksymalizuj moc wyjściową za pomocą stolika trójosiowego i zarejestruj transmisję PCF. Przesuń miernik mocy za filtrem o neutralnej gęstości i obróć filtr, aby dostosować moc lasera docierającą do próbki. Pomnóż zmierzoną moc przez transmitancję pozostałego układu optycznego, aby określić moc próbki.Teraz włącz galwanometry i scenę. Uruchom oprogramowanie akwizycyjne i wprowadź żądane parametry obrazowania. Umieść próbkę na stoliku przy użyciu tego samego środka zanurzeniowego, który został wcześniej nałożony na soczewkę obiektywu.Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i zasłoń zasłony, aby zapobiec przedostawaniu się światła z otoczenia. Następnie włącz zasilacze i wzmacniacze czujki. Zamknij kaseton świetlny otaczający stolik mikroskopu.Użyj elektronicznych przełączników sterujących, aby ręcznie otworzyć przesłony czujki 3-6. W oprogramowaniu do akwizycji naciśnij opcję Kliknij, aby rozpocząć akwizycję, aby rozpocząć obrazowanie SLAM. Wyreguluj ostrość mikroskopu za pomocą stage pokrętło regulatora, aż sample będzie wyraźnie widoczne.Użyj joysticka na sterowniku stolika mikroskopu, aby znaleźć żądane pole view. Po ustawieniu kliknij przycisk Zatrzymaj i zresetuj. Na karcie Zapisywanie przełącz opcję Zapisz dane na Tak.Następnie naciśnij opcję Kliknij, aby rozpocząć akwizycję i poczekaj na zakończenie obrazowania. Aby manipulować próbką podczas obrazowania, zamknij przesłony detektora i użyj latarki lub czołówki do oświetlenia. Po dokonaniu regulacji wróć do ustawień obrazowania.Aby zakończyć akwizycję obrazu, zamknij przesłony czujników, wyłącz czujniki, a dopiero potem włącz światła w pomieszczeniu. Zablokuj laser za pomocą migawki 1, a następnie wyłącz laser. Wyłącz galwanometry i stage i zamknij oprogramowanie do akwizycji.Próbkę tkanki należy odpowiednio zutylizować i oczyścić stanowisko pracy. Prawidłowo rozszczepione fotoniczne włókno krysliczne miało płaską powierzchnię końcową prostopadłą do jego osi i czystą powierzchnię. Słabo rozszczepione fotoniczne włókna krystaliczne wykazywały ukośne cięcia, wyszczerbione powierzchnie i wyraźne rysy lub zanieczyszczenia na powierzchni.Niewłaściwa obsługa lub zanieczyszczenie spowodowało widoczne nagromadzenie brudu i cząstek stałych wokół powierzchni włókna, zasłaniając wzór otworów wentylacyjnych. Spalone jądro z pociemniałymi obszarami wskazywało na uszkodzony fotoniczny światłowód krystaliczny pod koniec swojego życia. Widmo superkontinuum obejmowało około 975-1 175 nanometrów z płaskim wierzchołkiem i wyraźnymi modulacjami spektralnymi.Autokorelacja impulsów po kompresji wykazała symetryczny profil z wąskim maksimum połówkowym na całej szerokości, co wskazuje na dobre kształtowanie impulsu. Prawidłowo działające źródła superkontinuum wytwarzały silne sygnały drugiej i trzeciej harmonicznej. Zawężone superkontinuum powodowało utratę intensywności sygnału trzeciej harmonicznej przy zachowaniu sygnału drugiej harmonicznej.Brak kształtowania impulsów drastycznie zmniejszył wszystkie sygnały nieliniowe, dając słaby obraz o niskim kontraście. Udane obrazowanie SLAM tkanki nerkowej ex vivo wykazało wyraźne struktury nefronów z wieloma silnymi sygnałami optycznymi, w tym generowaniem trzeciej harmonicznej i fluorescencją NADPH. Śródmiąższowe włókna kolagenowe nerek można było zidentyfikować za pomocą silnych sygnałów generacji drugiej harmonicznej.Obraz współczynnika redoks wskazywał na podwyższony tlenowy metabolizm mitochondrialny w kanalikach proksymalnych kory nerkowej w porównaniu z rdzeniem. Druga mapa współczynnika redoks potwierdziła przestrzenną zmienność metabolizmu oksydacyjnego i glikolitycznego, wzmacniając zróżnicowane zużycie energii w tkance.

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Niskointensywna pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa (LIPUS) to metoda nieinwazyjnej mechanicznej stymulacji komórek endogennych lub inżynieryjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym artykule opisano, jak wdrożyć LIPUS do mikroskopu epifluorescencyjnego i jak zminimalizować niedopasowanie impedancji akustycznej wzdłuż ścieżki ultradźwięków, aby zapobiec niepożądanym artefaktom mechanicznym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Techniki biosensorów optycznych mogą wykrywać zmiany w masie w pobliżu błony plazmatycznej w żywych komórkach i pozwalają śledzić reakcje komórkowe zarówno w pojedynczych komórkach, jak i populacjach komórek. Protokół ten będzie opisywał wykrywanie modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G w nienaruszonych komórkach przy użyciu tego podejścia.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Poznaj mikroskopię SLAM do bezznacznikowego obrazowania wielomodalnego tkanek biologicznych. Ta zaawansowana technika pozwala jednocześnie rejestrować cztery kanały kontrastu, eliminując błędy wyrównania i uszkodzenia fototoksyczne.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Przeglądaj więcej filmów