Name: Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę generowania mutacji matczynych w Danio rerio przy użyciu linii zpc:cas9 knock-in i Tol2. Ta technika umożliwia szybkie badanie czynników matczynych związanych z mutacjami zygotycznymi prowadzącymi do śmiertelności lub niepłodności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jianlin Shen, Yiteng Xu i Qingqing Wei z Core Facility and Service Platform, School of Lifesciences. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 32170816, 32370860, 32450630 i 31871451), Program Wybitnych Uczonych w Średnim i Młodym Wieku Uniwersytetu Shandong, Taishan Scholars z prowincji Shandong.

<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

Protokół ten został przyznany jako patent przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej, który złagodzi ograniczone stosowanie metody po uzyskaniu zgody autorów. Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Śmiertelne mutacje zygotyczne utrudniają analizę wkładu genu w rozwój genów u matki. Alternatywne strategie, w szczególności wymiana linii zarodkowej i mikroiniekcja komórek jajowych in situ (OMIS), są technicznie wymagające 6,8. W procesie przeszczepiania komórek w celu wymiany linii zarodkowej zarodek biorcy otrzymuje bardzo mało PGC, co często uniemożliwia prawidłowy rozwój samicy 16,17,18.<...

Wczesny rozwój embrionalny kręgowców zależy w dużej mierze od RNA i białek przechowywanych w jaju, zwanych zbiorczo czynnikami matczynymi. Te matczyne produkty są głównie syntetyzowane podczas diplotenowego etapu mejozy I 1,2,3. Aby zbadać ich role funkcjonalne, konieczne jest wytworzenie homozygotycznych zmutowanych osobników płci żeńskiej, ponieważ tylko homozygotyczna mutacja w oocytach może całkowicie zubożyć te czynniki matczyne. Jednak uzyskanie takich homozygotycznych zmutowanych samic staje się wyzwaniem, gdy mutacje homozygotyczne powodują śmiertelność lub bezpłodność 4,5. Stanowi to istotną przeszkodę w wyjaśnieniu funkcji produktów matczynych kodowanych przez geny zygotyczne, letalne lub sterylne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie techniczne, opracowano kilka innowacyjnych podejść 6,7,8. Niemniej jednak techniki te często borykają się z wydłużonymi czasami trwania eksperymentów lub poważnymi wyzwaniami technicznymi.
W naszej poprzedniej pracy opracowaliśmy również strategię warunkowego nokautu, która pozwala na wytworzenie matczynych mutantów w ciągu jednego pokolenia 9,10. System składa się z dwóch kluczowych komponentów: transgenicznego danio pręgowanego Tg(zpczcas9) oraz transgenicznego systemu plazmidowego I-SceI zawierającego kasety ekspresyjne 3-4 sgRNA. Wykorzystując ten system, udało nam się osiągnąć warunkowy nokaut czynników matczynych w oocytach 9,10, ale nadal jest miejsce na poprawę. Po pierwsze, efektywność edycji genomu wcześniej opisanej linii transgenicznej Tg(zpczcas9) nie była stabilna w utrzymaniu transgenicznej ekspresji Cas9. Ponadto, ponieważ ta linia transgeniczna została wygenerowana przy użyciu systemu transpozonów Tol2, transpozycja Tol2 nie może być dalej wykorzystywana do integracji kasety ekspresji sgRNA; zamiast tego wymagana jest transgeneza za pośrednictwem I-Sce. Jednak takie podejście jest mniej skuteczne niż Tol2, a także jest bardziej podatne na wyciszenie międzypokoleniowe.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, staraliśmy się ustalić linię knock-in, która umożliwiłaby solidną i stabilną ekspresję Cas9 specyficzną dla oocytów. Linia ta pozwala na wykorzystanie systemu transpozonów Tol2 do wysoce wydajnego dostarczania plazmidów ekspresyjnych sgRNA u danio pręgowanego. Wykorzystując strategię edycji genomu opartą na intronie11, z powodzeniem wygenerowaliśmy linię knock-in zpccas9 ze zintegrowanym miejscem w ostatnim intronie genu rbm24a (Figura 1A, B). Wybraliśmy ten locus jako kandydata na genomiczną bezpieczną przystań dla ekspresji transgenu matki na podstawie dwóch niezależnych obserwacji. 1) Nieszkodliwa integracja: w naszym niedawnym badaniu12 homozygotyczne ryby knock-in przenoszące egzogenne DNA w tym miejscu pozostały w pełni zdolne do życia i płodne. 2) Solidna ekspresja: gdy kaseta zpccas9 została wprowadzona w tym samym locus, Cas9 ulegał ekspresji na wysokich poziomach, co dawało niezmiennie wysoką wydajność edycji genomu przez pokolenia (Figura 1C). Jako podstawowy składnik plazmy zarodkowej, białko wiążące RNA Rbm24a współpracuje z Buc w celu włączenia RNA plazmy zarodkowej do granulek zarodkowych. W konsekwencji matczyny niedobór Rbm24a prowadzi do całkowitego braku pierwotnych komórek rozrodczych (PGC)12. Tutaj, biorąc pod uwagę rbm24a jako przykład w naszej ostatniej pracy, zapewniamy ulepszony protokół wideo do generowania i charakteryzowania matczynych mutantów dla jarzygotycznych genów letalnych.

<table><tbody><tr><td>2x mieszanka M5 HiPer Taq PCR</td><td>Mei5bio powiedział:</td><td>Nr kat.#MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>Agarozy</td><td>Lek MDbio</td><td>Kot#A006L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw AxyPrep Plasmid Miniprep</td><td>Axygen (Axigen)</td><td>Kot#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do elektroforezy kapilarnej (Qsep400)</td><td>Układ BiOptic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do etykietowania DIG</td><td>Roche</td><td>Kot#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche</td><td>Kot#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Naziemna telewizja cyfrowa</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Kot#R0861</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>TransGen Biotechnologia</td><td>Kot#AT301</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza GenCrispr NLS-Cas9-NLS</td><td>Język GenScript</td><td>Kot#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane (1,0 x 100 mm)</td><td>Fabryka sprzętu edukacyjnego Rantai</td><td>Kot#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>BBI Nauki przyrodnicze</td><td>Kot#28985</td><td></td></tr><tr><td>Grafton Pryzmat 9</td><td>Podkładka graficzna</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>ObrazJ</td><td>Otwarty kod źródłowy</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Biotechnologicznych</td><td>Kot#CA1351</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokuźnia (MF2)</td><td>NARISHIGE (NARISZGIE)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospektrofotometr (Nano-300)</td><td>ALLSHENG (WSZYSTKO)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OlyVIA (OlyVIA)</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Kot#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz Pico-Litr (PLI-100A)&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spiczasta pęseta</td><td>Wskaźnik WPI</td><td>Kot#500341</td><td></td></tr><tr><td>Spiczasta pęseta</td><td>&nbsp; WPI&nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz (PC-100)</td><td>NARISHIGE (NARISZGIE)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy RiboLock</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Kot#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Protokół rNTP</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat.#R0481</td><td></td></tr><tr><td>Krzemowe hydroksylowe kulki magnetyczne</td><td>Sangon Biotechnologia</td><td>Kot#B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>NEB</td><td>Kot#M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Zold powiedział:</td><td>Wskaźnik WPI</td><td>Formy z Cat#</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 knock-in danio pręgowanego

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Oogeneza i wczesny rozwój embrionalny są krytycznie zależne od mRNA i białek pochodzących od matki. Wyeliminowanie tych czynników matczynych wymaga homozygotycznych mutacji u samic danio pręgowanego, co często skutkuje letalnymi lub niepłodnymi fenotypami, które uniemożliwiają nabycie matczynych zmutowanych zarodków. W naszych poprzednich pracach wprowadziliśmy szybkie podejście do ominięcia śmiertelności jarzmowej poprzez edycję genomu specyficznego dla oocytów. Jednak wcześniej opisany transgen cas9 wykazuje niestabilność i ulega stopniowemu wyciszaniu w kolejnych pokoleniach. Co więcej, obecność elementów transpozycyjnych Tol2 otaczających kasetę zpc:cas9 w tej linii utrudnia potencjalną dalszą transgenezę sgRNA przy użyciu systemu Tol2, który jest obecnie najbardziej wydajnym systemem transgenicznym u danio pręgowanego. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na linię danio pręgowanego wolną od Tol2, która zapewni stabilną i solidną ekspresję Cas9 specyficzną dla oocytów. Tutaj przedstawiamy linię z wpięciem zpccas9 w locus rbm24a , która spełnia ten wymóg. Korzystając z tego ulepszonego narzędzia, zapewniamy proces szybkiego generowania matczynych mutantów genów z zygotycznie letalnymi zmutowanymi fenotypami w modelu danio pręgowanego.

Szybkie generowanie matczynych mutantów rbm24a Skonstruowaliśmy wektor transgeniczny umożliwiający ekspresję matczynego markera BFP i czterech wysoce wydajnych sgRNA ukierunkowanych na sekwencję kodującą rbm24a. Po wprowadzeniu tego wektora do homozygotycznych zarodków rbm24a-RFP KIzpc: cas9 poprzez transpozycję Tol2, Mrbm24a został łatwo i szybko zidentyfikowany wśród zarodków F1 dodatnich BFP ze względu na bra...

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

W tym filmie prezentujemy ulepszoną metodę nokautu u danio pręgowanego specyficzną dla oocytów, oferując wszechstronną platformę do badania czynników matczynych z mutacjami zygotycznymi skutkującymi śmiertelnością lub bezpłodnością. Obecne metody nokautu matek są albo trudne technicznie, albo czasochłonne. Wcześniej informowaliśmy, że transgen zpc:cas9 jest wyciszony transkryptologicznie przez pokolenia.Korzystając z linii knock-in zpc:cas9, stworzyliśmy solidną platformę do generowania warunkowego nokautu podczas oogenezy, umożliwiając szybką i wysoce wydajną produkcję matczynych mutantów. Na początek zbierz zarodki, które zostały odrodzone przez homozygotyczne ryby rbm24a RFPKI zpc:cas9. Połączyć jeden mikrolitr pyłu PGG EB rbm24a 4sGRNA z jednym mikrolitrem informacyjnego RNA transpozazy Tol2 w celu przygotowania mieszaniny iniekcyjnej.Rozcieńczyć zarówno plazmid, jak i informacyjny RNA Tol2 bezpośrednio w czystej wodzie. Teraz umieść szklane szkiełko nakrywkowe w 90-milimetrowym naczyniu. Ułóż zarodki wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego i delikatnie użyj pipety, aby usunąć nadmiar wody.Następnie wstrzyknąć dwa nanolitry przygotowanej mieszaniny do blastodysku każdego zarodka w stadium jednokomórkowym. Delikatnie spłucz wstrzyknięte zarodki niebieską wodą i przenieś je do innego naczynia. Umieść naczynie w inkubatorze ustawionym na 28 stopni Celsjusza do uprawy.Po 24 godzinach od zapłodnienia wybierz zarodki, które wykazują silną i wszechobecną ekspresję białek niebieskiej fluorescencji. Po czterech dniach od zapłodnienia wychowuj tylko te zarodki, które utrzymują silne transgeniczne sygnały fluorescencyjne. Zbieraj zarodki wyprodukowane z krycia mozaikowych transgenicznych samic założyciela z samcami typu dzikiego.Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podnieś zarodki z dodatnim białkiem niebieskiej fluorescencji w stadium jednokomórkowym. Następnie utrwal zarodki na odpowiednich etapach w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby przygotować 1,5% roztwór OGER, zważ i połącz proszek OGER w buforze Ringera o sile 1/3 i gotuj do całkowitego rozpuszczenia.Wlej stopiony roztwór OGER do 90-milimetrowej szalki Petriego i włóż formę Z do stopionej agarozy. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie wyjmij formę, aby stworzyć gotową do użycia płytkę. Następnie dostosuj ustawienia ściągacza do igieł, aby użyć dwóch lekkich ciężarków i wybierz procedurę kroku pierwszego.Załaduj szklane kapilary do ściągacza, aby uzyskać igły uszczelnione ze stopu. Za pomocą spiczastej pęsety przytnij końcówki kapilar do średnicy od 30 do 40 mikrometrów. Następnie użyj mikrokuźni, aby uformować kolec na końcu, który pomoże w penetracji zarodka i zmniejszy uszkodzenia tkanek.Połącz domniemane założycielki z dzikimi rybami danio pręgowanymi i zbieraj zarodki. Na etapie jednokomórkowym wyizoluj zarodki, które są dodatnie dla niebieskiego białka fluorescencyjnego, za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Po trzech godzinach od zapłodnienia inkubować zarodki w pronazie, rozpuszczać w buforze Ringera o mocy jednej trzeciej przez 10 minut z delikatnym pipetowaniem w celu ich dechorionacji.Ostrożnie przenieś zdekorionowane zarodki na przygotowaną płytkę argarozy zalaną 1/3 buforem Ringera, uzupełnionym penicyliną streptomycyną. Zmień orientację zarodków tak, aby blastomer był skierowany w stronę końcówki naczynia włosowatego w celu aspiracji komórek. Teraz użyj mikrowstrzykiwacza, aby zaaspirować od 20 do 40 komórek z każdego zarodka, delikatnie zmniejszając ciśnienie równowagi, aby przeciwdziałać sile aspiracji kapilarnej.Zwiększ ciśnienie równowagi, aby uwolnić zasysane komórki do dwóch mikrolitrów dejonizowanej wody na krawędzi 1,5-mililitrowych probówek Eppendorfa. Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji RNA do probówki, aby zmyć zassane komórki i umieść probówkę na lodzie w celu tymczasowego przechowywania. Trzymaj zarodki po aspiracji komórek na płytce agarozowej do czasu uwidocznienia nieprawidłowych fenotypów.Następnie dodaj 40 mikrolitrów chloroformu do komórek z wybranych zarodków w odczynniku ekstrakcyjnym i delikatnie wymieszaj. Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 12 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po zebraniu supernatantu dodać jeden mikrolitr roztworu glikogenu.Następnie dodać równą objętość izopropanolu w oparciu o objętość supernatantu i dokładnie wymieszać. Inkubować probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby umożliwić wytrącenie RNA. Teraz odwirować próbkę o sile 12 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Następnie, aby dwukrotnie przepłukać osad RNA, dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu i odwiruj przy 12 000 G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu otworzyć pokrywę probówki, aby osad wyschł w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Dodaj siedem mikrolitrów wody, aby rozpuścić osad RNA.Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu zestawu do syntezy cDNA pierwszej nici, a następnie przeprowadź sekwencjonowanie PCR i Sangera w celu analizy mutacji w zmutowanych zarodkach matki. Matczyne mutanty rbm24a zostały zidentyfikowane na podstawie braku RFP rbm24a, podczas gdy inne mutanty matczyne zostały wykryte na podstawie określonych fenotypów lub genotypowania opartego na aspiracji komórek. Wśród zarodków BFP-dodatnich te pozbawione sygnału RFP zostały zidentyfikowane jako matczyne mutanty rbm24a.Hybrydyzacja in situ przy użyciu sondy NANOS3 wykazała, że zarodki Mrbm24a nie rekrutowały mRNA plazmy zarodkowej do granulek zarodkowych w stadium czterokomórkowym i brakowało im pierwotnych komórek rozrodczych w 24 godziny po zapłodnieniu. Wszystkim dorosłym samcom Mrbm24a nie udało się zapłodnić jaj złożonych przez samice typu dzikiego, wykazując nieprawidłowości anatomiczne ze złogami tłuszczu zastępującymi normalne jądra. Analiza histologiczna potwierdziła całkowity brak komórek rozrodczych i plemników w jądrach Mrbm24a.Analiza Western blot potwierdziła prawie niewykrywalne poziomy białka rbm24a w zarodkach BFP-dodatnich RFP-ujemnych. Wyniki RT-qPCR wykazały istotnie niższe poziomy transkryptu rbm24a w zarodkach RFP-ujemnych BFP w porównaniu z grupą kontrolną. Sekwencjonowanie RT-PCR i Sangera ujawniło duże delecje i indele zarówno w zarodkach BFP-dodatnich, jak i RFP-dodatnich BFP-dodatnich z transkryptami typu dzikiego wykrywalnymi tylko w zarodkach RFP-dodatnich.Wprowadzono matczyny marker GFP i nanog sgRNA w celu wytworzenia matczynych mutantów nanog, a zarodki GFP-dodatnie wykazywały szereg fenotypów grzbietowych. Wskaźniki transmisji w linii zarodkowej wahały się od 12% do 32% wśród linii transgenicznych GFP-dodatnich. Fenotyp grzbietowy zgodny z matczynymi mutantami nanog zaobserwowano u 22% do 60% zarodków z dodatnim wynikiem GFP.

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Poznaj ulepszoną metodę generowania mutacji matczynych w Danio rerio przy użyciu linii zpc:cas9 knock-in i Tol2. Ta technika umożliwia szybkie badanie czynników matczynych związanych z mutacjami zygotycznymi prowadzącymi do śmiertelności lub niepłodności.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów