Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Badamy, jak komórki oddziałują ze środowiskiem, w tym podczas produkcji lub produkcji komórek jako terapii. Tutaj odpowiadamy na pytania dotyczące tego, jak komórki zależne od kotwiczenia, takie jak MSC, mezenchymalny stromal czy komórki macierzyste, mogą być wytwarzane, aby pokonać niektóre bariery w translacji klinicznej. Rosnąca świadomość, że zmienność populacji komórek wpływa zarówno na spójność, jak i skuteczność końcowego produktu komórkowego dla każdej partii lub osoby.

Te wyzwania mogą nawet wpływać na zatwierdzenie niektórych terapii komórkowych. Celujemy w lukę, która pozwala uzyskać dużą liczbę komórek na mililitr płynu przy wysokiej kontroli środowiska i w sposób możliwy do skalowania. Protokół ten umożliwia wprowadzenie monitoringu środowiskowego w linii dla komórek zależnych od kotwiczenia, takich jak MSC.

Ta kontrola procesu jest przewagą w porównaniu z kolbami, które nadal są używane w większości produkcji laboratoryjnej i klinicznej. Istnieje kilka otwartych pytań dotyczących MSC i innych typów komórek wrażliwych na sygnały mechaniczne. Na przykład, jak takie podejście może pomóc komórkom zaprojektować się w inne stany chorobowe?

Na początek zdejmij przezroczystą plastikową kapsułkę podłączoną do LL na butelkach w stojaku na butelki. Używając nowej sterylnej strzykawki 50-mililitrowej bez tłoka, podłącz dyszę do butelki LL. Wlej sterylną filtrowaną wodę do beczki strzykawki i wstrzyknij do butelki LL. Podobnie napełnij butelkę L 25 mililitrami niskoglukozowego DMEM bez FBS, butelkę R 25 mililitrami sterylnego PBS, a butelkę RR ośmioma mililitrami roztworu antyadherencyjnego. Powtórz procedurę, aby przygotować wymaganą liczbę materiałów zużywalnych do eksperymentu.

Następnie przeprowadź samotest na każdym podu, który zostanie użyty w eksperymencie. Gdy moduł pomyślnie przejdzie wszystkie kontrole z testu samozałatwiający, wyjmij kasety i umieść je w workach zabezpieczonych przed światłem. Zamontuj materiał zużywalny do bioreaktora.

Usuń zieloną taśmę z zaworów zużywalnych i zamontuj materiał w kapsule. Zamontuj zaciski ponownie i sprawdź, czy nie ma syczących dźwięków, aby upewnić się, że szczelność jest stabilna. Podłącz białą linię czujnika ciśnienia, czerwoną linię ciśnienia powietrza oraz niebieską linię próżniową między materiałem zużywalnym a stacją bazową lub kapsułą.

Potwierdź, że boczny port wtryskowy jest zacisnięty białą klemą w kształcie łez, zanim rozpoczniesz nowy eksperyment. Kliknij ikonę Flush Bottles w interfejsie oprogramowania. Włącz przycisk radiowy dla butelki L, wybierz Output to Waste, a następnie kliknij Start Flush MSCserum.

W oknie Zawartość butelki wskaz, że MSCserum znajduje się w butelce R, która zawiera PBS. Następnie przejdź do Manual Ops i wykonaj trzy cykle Eject Wash na butelce na odpady. W oknie Zawartość butelki wskazuje, że MSCserum znajduje się teraz w butelce RR, która zawiera roztwór antyadherencyjny.

Wróć do Manual Ops i wykonaj jeden cykl Eject Wash na butelce na odpady. Po 30 minutach spłukaj produkt spożywczy PBS. Opróżnić reaktor, aby oczekiwać na wtrysk komórki i mikronośników.

W panelu Manual Ops kliknij Reinoculate. Zostaw system wstrzymany na etapie, gdy na pulpicie pojawia się podpowiadanie o zaszczepieniu reaktora. Następnie pipetować obliczoną objętość komórek zawieszonych w stożkowatej rurce o pojemności 15 mililitrów zawierającej mikronośniki dla każdego schorzenia.

Uzupełnij każdą probówkę do 2,2 do 2,5 mililitra świeżym, ciepłym ośrodkiem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Pracując z jednym lub dwoma materiałami eksploatacyjnymi naraz, wyjmij je ze stacji bazowej i włóż do szafy zabezpieczeń biologicznych. Należy włożyć mieszankę komórki i mikronośnika do strzykawki pięciomililitrowej za pomocą zielonej igły o średnicy czterech cali.

Wtryskuj mieszankę do reaktora. Chwyć linię portu wtryskowego blisko podstawy kasety, ostrożnie, aby jej nie odłączać. Używając ruchu rolkowego między kciukiem a palcem wskazującym, skręć linię portu wtryskowego przez dwa pełne obroty, tworząc zacięty zaginek w żyłce.

Wsuń węzeł w wycięcie blisko podstawy portu wtryskowego i zabezpiecz go małym kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie zwróć materiał zużywalny do stacji bazowej. Po powtórzeniu wstrzyknięcia dla wszystkich materiałów zużywalnych, przejdź przez interfejs oprogramowania, aby poinformować, że szczepienie zostało zakończone.

Gdy oprogramowanie wróci na stronę główną, usuń biały zacisk z linii wyjściowych materiałów zużywalnych. Wejdź w Manual Ops i wykonaj funkcję Eject Excess z portem wyjściowym ustawionym na P dla perfuzji. Włącz tryb statycznego miksowania przy użyciu cyklu 1, 680 sekund włączonego i 120 sekund przerwy, a częstotliwość miksowania ustaw na pięć herców.

Aby rozpocząć pobieranie komórek, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby pobrać 200 mikrolitrów Pronazy oraz około 300 do 400 mikrolitrów powietrza. Odkręć korek bocznej linii wtryskowej i spryskaj złącze zaworu bezigłowego 70% etanolem. Zdejmij taśmę z zawiązanej bocznej linii wtryskowej, rozwiąż węzeł i odciśnij białą zacisk w kropli łez.

Teraz podłącz strzykawkę o średnicy jednego mililitra i delikatnie wstrzyknij Pronazę do reaktora. Ścigać ciecz powietrzem, aby zapewnić pełną dostawę. Ponownie załącz zacisk w kropli i zakręć linię wtryskową.

Następnie zwróć materiał do kapsuły, podłącz wszystkie przewody, zdejmij biały zacisk C i wznowij mieszanie. Połóż butelkę na odpady i butelkę z nośnikiem na lodzie. Uruchom pięciominutowy timer i pozwól Pronaze trawić mikronośniki w reaktorze.

Po pięciu minutach sprawdź, czy mikronośniki się zdegradowały, sprawdzając ich brak w reaktorze. Zbieraj komórki, wchodząc w Manual Ops, ustaw liczbę cykli na trzy, wybierz Port wyjściowy W dla odpadów i kliknij Eject Wash. Po zakończeniu cykli wyrzucania przenieś materiał zużywalny do szafy zabezpieczeń biologicznych.

Następnie wyjmij zawartość butelki odpadów za pomocą strzykawki o pojemności 10 lub 20 mililitrów. Zawartość butelki odpadów należy wydać do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów. Wiruj ogniwa przy 300g przez pięć minut.

Aspiruj supernatant i oceń rozmiar pelletu komórkowego. Warunki środowiskowe, takie jak pH, temperatura, rozpuszczony tlen i dwutlenek węgla, były stabilnie utrzymywane przez cały 10-dniowy okres hodowli w systemie mikrobioreaktora. Wahania pH były znacząco niższe w mikrobioreaktorze w porównaniu do warunków kolby polistyrenowej w hodowli tkankowej.

Wydajność komórek była wyższa w mikrobioreaktorze niż w kolbie T25, przy zachowaniu podobnej żywotności komórek. Spośród 14 zmierzonych cech krytycznych związanych z mocą mocy, dziewięć wykazało istotnie wyższą ekspresję mRNA w warunkach mikrobioreaktora w porównaniu do kolby T75.