Name: Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę produkcji mezenchymalnych komórek stromalnych w mikrobioreaktorze z mikroprzyczynnikami. Protokół zapewnia lepszą kontrolę środowiska i wyższą wydajność komórek niż tradycyjne kolby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy ośrodkowi Genomics Core (Weill Cornell Medicine) za konsultacje dotyczące analizy qPCR i rozwiązywania problemów. Z wdzięcznością dziękujemy Evanowi Gatesowi i Ericu Shiue (MilliporeSigma) w zakresie wsparcia technicznego dla mikrobioreaktora.

<ol><li>Sin, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-density+microfluidic+bioreactor+for+the+automated+manufacturing+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells.</a> Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).</li>
<li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Approves+First+Mesenchymal+Stromal+Cell+Therapy+to+Treat+Steroid-refractory+Acute+Graft-versus-host+Disease%22">FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease</a>. , (2024).</li>
<li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).</li>
<li>Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+COVID-19-induced+ARDS%3A+implications+for+an+ageing+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population.</a> Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).</li>
<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).</li>
<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).</li>
<li>Gnecchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+supporting+paracrine+hypothesis+for+Akt-modified+mesenchymal+stem+cell-mediated+cardiac+protection+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement.</a> FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).</li>
<li>Doron, G., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Substrates+for+Improved+Manufacture+of+Mesenchymal+Stromal+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies.</a> Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).</li>
<li>Noronha, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+approaches+to+improve+the+efficacy+of+mesenchymal+stromal+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies.</a> Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).</li>
<li>Hezam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+protective+effects+of+PGE2+priming+mesenchymal+stem+cells+against+LPS-induced+acute+lung+injury+%28ALI%29+through+macrophage+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+alleviate+acute+respiratory+distress+syndrome+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).</li>
<li>Full Prescribing Information - Ryoncil. , 
 <a target="_blank" href="https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf">https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf</a> (2024).</li>
<li>Kumar, A., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+industrialized+cell+expansion%3A+producing+the+critical+raw+material+for+biofabrication+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes.</a> Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).</li>
<li>Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+heterogeneity+in+putative+mesenchymal+stem+cell+colonies%3A+Single-cell+time+lapsed+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis.</a> PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).</li>
<li>Mets, T., Verdonk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Aging+of+Human+Bone+Marrow+Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells.</a> Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).</li>
<li>Tremain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroSAGE+Analysis+of+2%2C353+Expressed+Genes+in+a+Single+Cell-Derived+Colony+of+Undifferentiated+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+Reveals+mRNAs+of+Multiple+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages.</a> Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).</li>
<li>Klein, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prevalent+neglect+of+environmental+control+in+mammalian+cell+culture+calls+for+best+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices.</a> Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).</li>
<li>Bellani, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-Up+Technologies+for+the+Manufacture+of+Adherent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Nutr%22%5BJournal%5D)">Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells.</a> Front Nutr. 7, 575146(2020).</li>
<li>Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+mesenchymal+stromal+cells+in+a+microcarrier-microbioreactor+platform+can+enhance+cell+yield+and+quality+attributes%3A+case+study+for+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome.</a> J Transl Med. 22 (1), 614(2024).</li>
<li>Ng, E. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolvable+Gelatin-Based+Microcarriers+Generated+through+Droplet+Microfluidics+for+Expansion+and+Culture+of+Mesenchymal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).</li>
</ol>

Autorzy ujawniają umowę o współpracy z producentem mikrobioreaktorów, firmą MilliporeSigma.

W tym protokole opisano metodę rozszerzania, przybierania i pozyskiwania komórek przy użyciu podejścia mikronośnik-mikrobioreaktor. Proces ten umożliwia komórkom zależnym od kotwiczenia, takim jak MSC, zwiększanie liczby komórek pod wyższą biochemiczną kontrolą platformy bioreaktorowej (w porównaniu do konwencjonalnych kolb TCPS) na poziomie laboratoryjnym, odpowiednim do szybkiego rozwoju procesu. Ponadto wykazano, że produkcja MSC przez mikronośniki-mikrobioreaktory skutkuje fenotypem komórek z premedytacją, który może...

Wykorzystanie żywych komórek jako produktu terapeutycznego niedawno stało się obiecującą nową opcją leczenia wielu wyzwań zdrowotnych. Na przykład limfocyty T receptorów antygenowych chimerycznych (CAR) przyniosły trwałą remisji u osób z tzw. nowotworami płynnymi — białaczką, chłoniakiem i szpiczakiem mnogim — które były oporne na wszystkie wcześniej dostępne metody leczenia1. Niedawno zatwierdzono produkt mezenchymalnych komórek macierzystych/stromalnych (MSC) (Ryoncil) do leczenia dzieci cierpiących na ostrą chorobę przeszczepu przeciw gospodarzowi (SR-aGvHD), chorobę ośmiertelności > 50%. Jednak rozszerzenie innych niezaspokojonych potrzeb klinicznych wymaga intensywnego opracowania zarówno terapii, jak i środków do opracowania i produkcji tego produktu.
Jedną z takich niezaspokojonych potrzeb klinicznych można znaleźć u osób cierpiących na zespół ostrego niedociągania oddechowego (ARDS). ARDS jest tutaj omawiany, aby przedstawić konkretny przypadek użycia ilustrujący metodę, wyniki oraz dyskusję na temat możliwych rozszerzeń na inne cele chorobowe. Krytyczny (progresja w ciągu kilku godzin do dni), powszechny (> 200 000 przypadków rocznie w USA) i śmiertelny wskaźnik (27%-46% śmiertelności, w zależności od nasilenia objawienia), ARDS wzbudził nową i szeroką uwagę podczas pandemii COVID-19 jako typowy mechanizm śmierci pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 3,4. ARDS charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością naczyń płucnych, prowadzącą do obrzęku śródmiąższowego, zalania pęcherzyków oraz infiltracji składników komórkowych, w tym neutrofilów i czerwonych krwinek, do przedziału pęcherzyka pęcherzyka5. W początkowej fazie wyrzutowej ARDS wrodzone zapalenie komórek odpornościowych powoduje te patogenne efekty poprzez uszkodzenie integralności śródbłonka i bariery nabłonkowej oraz wspieranie rekrutacji i aktywacji komórek odpornościowych poprzez wydzielanie prozapalnych cytokin; Skuteczne rozwiązanie odpowiedzi zapalnej, naprawa integralności bariery oraz uniknięcie nadmiernego włóknienia są kluczowe dla przeżycia3. Chociaż terapie przeciwwirusowe, takie jak Remdesivir, wykazują obiecujące wyniki w zwalczaniu ARDS pośredniczonego przez SARS-CoV-2, w innych przypadkach obecnie nie ma zatwierdzonych interwencji farmakologicznych zmniejszających śmiertelność5.
MSC mogą stanowić obiecujące podejście do leczenia ARDS, biorąc pod uwagę specyficzny tropizm płucny po podaniu systemowego oraz zdolność do wydzielania immunomodulacyjnych sygnałów parakrynologicznych do otaczającego mikrośrodowiska 6,7. Badania mechanistyczne wykazały ekspresję takich czynników parakrynicznych jak interleukina-10 (IL-10)8, indoleamina 2,3-dioksygenaza 1 (IDO1)9, prostaglandyna E2 (PGE2)10 oraz inne w wywoływaniu domniemanej terapeutycznej skuteczności MSC dla wielu wskazań, w tym ostrych urazów płuc (ALI)/ARDS11; dlatego poziomy ekspresji tych produktów genowych stanowią potencjalne krytyczne cechy jakości (pCQA), które mogą przewidywać skuteczność kliniczną, zapewniając możliwe kryteria uwalniania końcowego produktu komórkowego podczas produkcji. Jednak wyprodukowanie wystarczającej ilości komórek, aby osiągnąć skuteczną dawkę terapeutyczną, jest wyzwaniem; Ryoncil, na przykład, jest wskazany do dawkowania w dawce 2 x 106 komórek/kg masy pacjenta, podawanej dwa razy w tygodniu przez 4 tygodniei 12. Dla pacjenta ważącego 80 kg oznacza to > 1,2 miliarda MSC na jeden cykl leczenia, co wymaga dużej powierzchni fizycznej, aby pomieścić odpowiednią powierzchnię dla tego dwuwymiarowego stanu wzrostu. Ponieważ tego produktu z żywych komórek nie można wysterylizować przed podaniam pacjentowi bez uszkadzania potencjału terapeutycznego komórek, stosowanie obecnych wytycznych Dobrych Praktyk Produkcyjnych dla produkcji w sterylny sposób jest kluczowe, co zwiększa złożoność logistyczną produkcji komórek, a tym samym koszt towarów13.
Ponadto wcześniejsze badania wykazały dowody na to, że typowa produkcja MSC w kolbach polistyrenu do hodowli tkankowej (TCPS) przyczynia się do powstawania niejednorodności fenotypowej wewnątrzpopulacji. W niektórych zastosowaniach końcowych utrudnia to kontrolę jakości między partiami w badaniach i w tłumaczeniu klinicznym 14,15,16,17. Spekuluje się, że ograniczona kontrola biochemiczna dostępna w kolbach TCPS, w tym gradienty dyfuzyjne gazów, składników odżywczych i produktów metabolicznych, słaba regulacja pH itp., przyczynia się do tych wyzwań.
Te kwestie motywują do przyjęcia hodowli opartej na bioreaktorach, aby wykorzystać wyższą regulację biochemiczną i gęstość komórek dostępne w kontrolowanym trójwymiarowym formacie wzrostu z dynamicznym mieszaniem18. Jednak przetwarzanie lub produkcja oparta na bioreaktorach wiąże się z własnym zestawem wyzwań: jako typ komórek zależny od kotwiczenia, MSC wymagają jakiegoś rodzaju substratu do wzrostu w bioreaktorze, co wymaga dodania mikronośników. Dodatkowo, wiele komercyjnie dostępnych bioreaktorów pracuje na skalach objętościowych, które są zbyt zasobochłonne (> 3 litry podłoża wzrostowego) dla badań laboratoryjnych niezbędnych do identyfikacji i udoskonalenia nieznanych parametrów procesu wpływających na ekspresję mierzalnych wskaźników jakości komórek. Te cechy określa się jako potencjalne atrybuty krytycznej jakości, czyli pCQA19.
Krupczak i in. wcześniej opisali podejście mikronośnik-mikrobioreaktor, które doprowadziło do uzyskania MSC z poprawą ekspresji pCQA dla ARDS, ograniczonego do ocen in vitro 20. Podejście to łączyło wykorzystanie rozpuszczalnej platformy mikronośników żelatyny, produkowanej na miejscu, z komercyjnie dostępną platformą mikrobioreaktorową, mikrobioreaktorem Mobius Breez21. Ten mikrobioreaktor wykorzystuje jednorazowe komory reaktora o pojemności 2 mL i zawiera wiele pożądanych funkcji poprawiających kontrolę biochemiczną, w tym regulację temperatury, pH,CO2 iO2 w dynamicznie mieszanym, zamkniętym systemie zasilanym perfuzją, ale nie został zaprojektowany z myślą o komórkach zależnych od kotwiczenia, takich jak MSC. Rzeczywiście, standardowe kanały mikrofluidyczne używane do wtrysku zawartości reaktora są zbyt małe, by umożliwić przepuszczenie mikronośników, co wymaga znacznej adaptacji, aby umożliwić skuteczną produkcję MSC na tej platformie.
Tutaj opisano i zilustrowano szczegółowy protokół w celu dostosowania tego mikrobioreaktora do hodowli zależnej od kotwiczenia u MSC. Parametry procesu przedstawione tutaj zostały zidentyfikowane z zamiarem informowania o rozwoju procesu i produkcji MSC do przedklinicznej, in vitro oceny skuteczności terapeutycznej dla ARDS. Jednak w zasadzie protokół ten może być dostosowany do innych zastosowań końcowych, innych stanów zapalnych lub immunomodulacyjnych oraz innych typów komórek zależnych od kotwiczenia, które mogłyby skorzystać na lepszej kontroli biochemicznej w warunkach laboratoryjnych. Rysunek 1 schematyzuje protokół opisany w dołączonym filmie, a Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4 ilustrują kluczowe wyniki.

<table><tbody><tr><td>Roztwór antyadhezyjne do płukania</td><td>Technologie komórek mamiennych</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobioreaktor Breez</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa stożkowa, 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa stożkowa, 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, niskoglukozowy</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronośniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówkowa, 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iglica,, 4", 18 gauge</td><td>Amazon</td><td>B0D663ZR6D</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza, od Streptomyces griseus</td><td>MilliporeSigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetka serologiczna, 10 mL</td><td>VWR</td><td>75816-100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda dejonizowana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawki, 0,22 um, sterylny</td><td>Produkty naukowe Celltreat</td><td>229762</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 20 mL</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Kolba polistyrenowa do hodowli tkankowej, T75</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>SigmaAldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Microbioreactor-Based Production of Anchorage-Dependent Mesenchymal Stromal Cells Primed for Acute Respiratory Distress Syndrome

Terapia oparta na komórkach to nowe podejście terapeutyczne dla różnych schorzeń. Jednak produkcja wystarczającej ilości wysokiej jakości komórek pozostaje aktywnym wyzwaniem naukowym i technicznym. Końcowy produkt komórkowy nie może być sterylizowany; Dlatego sterylność i jakość przez projekt są kluczowe. Dla komórek zależnych od kotwiczenia, ekspansja oparta na kolbach jest nadal wykorzystywana na skali rozwojowej i przemysłowej, co wymaga dużych fizycznych śladów, ogranicza kontrolę nad środowiskiem biochemicznym (pH,CO2 iO2, dyfuzyjne gradienty składników odżywczych i metabolitów) oraz dostarcza sygnałów fizycznych wpływających na ostateczną jakość komórek. Te wyzwania skłoniły do przyjęcia podejść opartych na produkcji bioreaktorów, jednak takie podejścia zazwyczaj odbywają się na skalę objętościową, co wiąże się z wyzwaniami i może być zbyt kosztowne dla badań laboratoryjnych lub rozwoju procesów. Produkcja terapii mikrobioreaktorowo-mikronośnikowej wykazała biochemiczną kontrolę podczas hodowli dla przypadku testowego typu źródłowego komórki – komórek stromalnych mezenchymalnych. Do wstępnej oceny jakości komórek in vitro rozważano zespół ostrego niedogodności oddechowego jako potencjalny przypadek zastosowania. Podejście przedstawione tutaj umożliwia szybki rozwój procesów na skalę laboratoryjną dzięki małej objętości (2 mL) i ścisłej kontroli biochemicznej w mikrobioreaktorze. Aby to osiągnąć dla typu komórek zależnych od kotwicy, takich jak komórki stromalne mezenchymalne, wymagały znaczne modyfikacje procesu mikrobioreaktora i wykorzystano platformę mikronośnikową żelatyny, produkowaną wewnętrznie w procesie mikrofluidowym. Tutaj przedstawiono dodatkowe szczegóły dotyczące metody i parametrów procesu stosowanych do hodowli takich komórek zależnych od kotwiczenia w mikrobioreaktorze, aby umożliwić innym badaczom dostosowanie tych praktyk do własnych zastosowań i typów źródeł komórek.

Mikrobioreaktor umożliwił monitorowanie i regulację czynników środowiskowych przez około 10 dni w hodowli. Czynniki środowiskowe, takie jak pH (rysunek 2A), temperatura (rysunek 2B), rozpuszczony tlen (rysunek 2C) oraz dwutlenek węgla (rysunek 2D), były precyzyjnie mierzone i utrzymywane w warunkach mikrobioreaktora, ale nie w warunkach kolb, podczas okresu hodowli. Dane...

Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Cell-based therapy is an emerging therapeutic approach for a range of health conditions. However, producing sufficient quantities of quality cells remains ...

Badamy, jak komórki oddziałują ze środowiskiem, w tym podczas produkcji lub produkcji komórek jako terapii. Tutaj odpowiadamy na pytania dotyczące tego, jak komórki zależne od kotwiczenia, takie jak MSC, mezenchymalny stromal czy komórki macierzyste, mogą być wytwarzane, aby pokonać niektóre bariery w translacji klinicznej. Rosnąca świadomość, że zmienność populacji komórek wpływa zarówno na spójność, jak i skuteczność końcowego produktu komórkowego dla każdej partii lub osoby.Te wyzwania mogą nawet wpływać na zatwierdzenie niektórych terapii komórkowych. Celujemy w lukę, która pozwala uzyskać dużą liczbę komórek na mililitr płynu przy wysokiej kontroli środowiska i w sposób możliwy do skalowania. Protokół ten umożliwia wprowadzenie monitoringu środowiskowego w linii dla komórek zależnych od kotwiczenia, takich jak MSC.Ta kontrola procesu jest przewagą w porównaniu z kolbami, które nadal są używane w większości produkcji laboratoryjnej i klinicznej. Istnieje kilka otwartych pytań dotyczących MSC i innych typów komórek wrażliwych na sygnały mechaniczne. Na przykład, jak takie podejście może pomóc komórkom zaprojektować się w inne stany chorobowe?Na początek zdejmij przezroczystą plastikową kapsułkę podłączoną do LL na butelkach w stojaku na butelki. Używając nowej sterylnej strzykawki 50-mililitrowej bez tłoka, podłącz dyszę do butelki LL. Wlej sterylną filtrowaną wodę do beczki strzykawki i wstrzyknij do butelki LL. Podobnie napełnij butelkę L 25 mililitrami niskoglukozowego DMEM bez FBS, butelkę R 25 mililitrami sterylnego PBS, a butelkę RR ośmioma mililitrami roztworu antyadherencyjnego. Powtórz procedurę, aby przygotować wymaganą liczbę materiałów zużywalnych do eksperymentu.Następnie przeprowadź samotest na każdym podu, który zostanie użyty w eksperymencie. Gdy moduł pomyślnie przejdzie wszystkie kontrole z testu samozałatwiający, wyjmij kasety i umieść je w workach zabezpieczonych przed światłem. Zamontuj materiał zużywalny do bioreaktora.Usuń zieloną taśmę z zaworów zużywalnych i zamontuj materiał w kapsule. Zamontuj zaciski ponownie i sprawdź, czy nie ma syczących dźwięków, aby upewnić się, że szczelność jest stabilna. Podłącz białą linię czujnika ciśnienia, czerwoną linię ciśnienia powietrza oraz niebieską linię próżniową między materiałem zużywalnym a stacją bazową lub kapsułą.Potwierdź, że boczny port wtryskowy jest zacisnięty białą klemą w kształcie łez, zanim rozpoczniesz nowy eksperyment. Kliknij ikonę Flush Bottles w interfejsie oprogramowania. Włącz przycisk radiowy dla butelki L, wybierz Output to Waste, a następnie kliknij Start Flush MSCserum.W oknie Zawartość butelki wskaz, że MSCserum znajduje się w butelce R, która zawiera PBS. Następnie przejdź do Manual Ops i wykonaj trzy cykle Eject Wash na butelce na odpady. W oknie Zawartość butelki wskazuje, że MSCserum znajduje się teraz w butelce RR, która zawiera roztwór antyadherencyjny.Wróć do Manual Ops i wykonaj jeden cykl Eject Wash na butelce na odpady. Po 30 minutach spłukaj produkt spożywczy PBS. Opróżnić reaktor, aby oczekiwać na wtrysk komórki i mikronośników.W panelu Manual Ops kliknij Reinoculate. Zostaw system wstrzymany na etapie, gdy na pulpicie pojawia się podpowiadanie o zaszczepieniu reaktora. Następnie pipetować obliczoną objętość komórek zawieszonych w stożkowatej rurce o pojemności 15 mililitrów zawierającej mikronośniki dla każdego schorzenia.Uzupełnij każdą probówkę do 2,2 do 2,5 mililitra świeżym, ciepłym ośrodkiem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Pracując z jednym lub dwoma materiałami eksploatacyjnymi naraz, wyjmij je ze stacji bazowej i włóż do szafy zabezpieczeń biologicznych. Należy włożyć mieszankę komórki i mikronośnika do strzykawki pięciomililitrowej za pomocą zielonej igły o średnicy czterech cali.Wtryskuj mieszankę do reaktora. Chwyć linię portu wtryskowego blisko podstawy kasety, ostrożnie, aby jej nie odłączać. Używając ruchu rolkowego między kciukiem a palcem wskazującym, skręć linię portu wtryskowego przez dwa pełne obroty, tworząc zacięty zaginek w żyłce.Wsuń węzeł w wycięcie blisko podstawy portu wtryskowego i zabezpiecz go małym kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie zwróć materiał zużywalny do stacji bazowej. Po powtórzeniu wstrzyknięcia dla wszystkich materiałów zużywalnych, przejdź przez interfejs oprogramowania, aby poinformować, że szczepienie zostało zakończone.Gdy oprogramowanie wróci na stronę główną, usuń biały zacisk z linii wyjściowych materiałów zużywalnych. Wejdź w Manual Ops i wykonaj funkcję Eject Excess z portem wyjściowym ustawionym na P dla perfuzji. Włącz tryb statycznego miksowania przy użyciu cyklu 1, 680 sekund włączonego i 120 sekund przerwy, a częstotliwość miksowania ustaw na pięć herców.Aby rozpocząć pobieranie komórek, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby pobrać 200 mikrolitrów Pronazy oraz około 300 do 400 mikrolitrów powietrza. Odkręć korek bocznej linii wtryskowej i spryskaj złącze zaworu bezigłowego 70% etanolem. Zdejmij taśmę z zawiązanej bocznej linii wtryskowej, rozwiąż węzeł i odciśnij białą zacisk w kropli łez.Teraz podłącz strzykawkę o średnicy jednego mililitra i delikatnie wstrzyknij Pronazę do reaktora. Ścigać ciecz powietrzem, aby zapewnić pełną dostawę. Ponownie załącz zacisk w kropli i zakręć linię wtryskową.Następnie zwróć materiał do kapsuły, podłącz wszystkie przewody, zdejmij biały zacisk C i wznowij mieszanie. Połóż butelkę na odpady i butelkę z nośnikiem na lodzie. Uruchom pięciominutowy timer i pozwól Pronaze trawić mikronośniki w reaktorze.Po pięciu minutach sprawdź, czy mikronośniki się zdegradowały, sprawdzając ich brak w reaktorze. Zbieraj komórki, wchodząc w Manual Ops, ustaw liczbę cykli na trzy, wybierz Port wyjściowy W dla odpadów i kliknij Eject Wash. Po zakończeniu cykli wyrzucania przenieś materiał zużywalny do szafy zabezpieczeń biologicznych.Następnie wyjmij zawartość butelki odpadów za pomocą strzykawki o pojemności 10 lub 20 mililitrów. Zawartość butelki odpadów należy wydać do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów. Wiruj ogniwa przy 300g przez pięć minut.Aspiruj supernatant i oceń rozmiar pelletu komórkowego. Warunki środowiskowe, takie jak pH, temperatura, rozpuszczony tlen i dwutlenek węgla, były stabilnie utrzymywane przez cały 10-dniowy okres hodowli w systemie mikrobioreaktora. Wahania pH były znacząco niższe w mikrobioreaktorze w porównaniu do warunków kolby polistyrenowej w hodowli tkankowej.Wydajność komórek była wyższa w mikrobioreaktorze niż w kolbie T25, przy zachowaniu podobnej żywotności komórek. Spośród 14 zmierzonych cech krytycznych związanych z mocą mocy, dziewięć wykazało istotnie wyższą ekspresję mRNA w warunkach mikrobioreaktora w porównaniu do kolby T75.

microbioreactor-based-production-anchorage-dependent-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Poznaj metodę produkcji mezenchymalnych komórek stromalnych w mikrobioreaktorze z mikroprzyczynnikami. Protokół zapewnia lepszą kontrolę środowiska i wyższą wydajność komórek niż tradycyjne kolby.

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Przeglądaj więcej filmów