Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego
December 12th, 2025
Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.
Badamy, jak komórki oddziałują ze środowiskiem, w tym podczas produkcji lub produkcji komórek jako terapii. Tutaj odpowiadamy na pytania dotyczące tego, jak komórki zależne od kotwiczenia, takie jak MSC, mezenchymalny stromal czy komórki macierzyste, mogą być wytwarzane, aby pokonać niektóre bariery w translacji klinicznej. Rosnąca świadomość, że zmienność populacji komórek wpływa zarówno na spójność, jak i skuteczność końcowego produktu komórkowego dla każdej partii lub osoby.
Te wyzwania mogą nawet wpływać na zatwierdzenie niektórych terapii komórkowych. Celujemy w lukę, która pozwala uzyskać dużą liczbę komórek na mililitr płynu przy wysokiej kontroli środowiska i w sposób możliwy do skalowania. Protokół ten umożliwia wprowadzenie monitoringu środowiskowego w linii dla komórek zależnych od kotwiczenia, takich jak MSC.
Ta kontrola procesu jest przewagą w porównaniu z kolbami, które nadal są używane w większości produkcji laboratoryjnej i klinicznej. Istnieje kilka otwartych pytań dotyczących MSC i innych typów komórek wrażliwych na sygnały mechaniczne. Na przykład, jak takie podejście może pomóc komórkom zaprojektować się w inne stany chorobowe?
Na początek zdejmij przezroczystą plastikową kapsułkę podłączoną do LL na butelkach w stojaku na butelki. Używając nowej sterylnej strzykawki 50-mililitrowej bez tłoka, podłącz dyszę do butelki LL. Wlej sterylną filtrowaną wodę do beczki strzykawki i wstrzyknij do butelki LL. Podobnie napełnij butelkę L 25 mililitrami niskoglukozowego DMEM bez FBS, butelkę R 25 mililitrami sterylnego PBS, a butelkę RR ośmioma mililitrami roztworu antyadherencyjnego. Powtórz procedurę, aby przygotować wymaganą liczbę materiałów zużywalnych do eksperymentu.
Następnie przeprowadź samotest na każdym podu, który zostanie użyty w eksperymencie. Gdy moduł pomyślnie przejdzie wszystkie kontrole z testu samozałatwiający, wyjmij kasety i umieść je w workach zabezpieczonych przed światłem. Zamontuj materiał zużywalny do bioreaktora.
Usuń zieloną taśmę z zaworów zużywalnych i zamontuj materiał w kapsule. Zamontuj zaciski ponownie i sprawdź, czy nie ma syczących dźwięków, aby upewnić się, że szczelność jest stabilna. Podłącz białą linię czujnika ciśnienia, czerwoną linię ciśnienia powietrza oraz niebieską linię próżniową między materiałem zużywalnym a stacją bazową lub kapsułą.
Potwierdź, że boczny port wtryskowy jest zacisnięty białą klemą w kształcie łez, zanim rozpoczniesz nowy eksperyment. Kliknij ikonę Flush Bottles w interfejsie oprogramowania. Włącz przycisk radiowy dla butelki L, wybierz Output to Waste, a następnie kliknij Start Flush MSCserum.
W oknie Zawartość butelki wskaz, że MSCserum znajduje się w butelce R, która zawiera PBS. Następnie przejdź do Manual Ops i wykonaj trzy cykle Eject Wash na butelce na odpady. W oknie Zawartość butelki wskazuje, że MSCserum znajduje się teraz w butelce RR, która zawiera roztwór antyadherencyjny.
Wróć do Manual Ops i wykonaj jeden cykl Eject Wash na butelce na odpady. Po 30 minutach spłukaj produkt spożywczy PBS. Opróżnić reaktor, aby oczekiwać na wtrysk komórki i mikronośników.
W panelu Manual Ops kliknij Reinoculate. Zostaw system wstrzymany na etapie, gdy na pulpicie pojawia się podpowiadanie o zaszczepieniu reaktora. Następnie pipetować obliczoną objętość komórek zawieszonych w stożkowatej rurce o pojemności 15 mililitrów zawierającej mikronośniki dla każdego schorzenia.
Uzupełnij każdą probówkę do 2,2 do 2,5 mililitra świeżym, ciepłym ośrodkiem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Pracując z jednym lub dwoma materiałami eksploatacyjnymi naraz, wyjmij je ze stacji bazowej i włóż do szafy zabezpieczeń biologicznych. Należy włożyć mieszankę komórki i mikronośnika do strzykawki pięciomililitrowej za pomocą zielonej igły o średnicy czterech cali.
Wtryskuj mieszankę do reaktora. Chwyć linię portu wtryskowego blisko podstawy kasety, ostrożnie, aby jej nie odłączać. Używając ruchu rolkowego między kciukiem a palcem wskazującym, skręć linię portu wtryskowego przez dwa pełne obroty, tworząc zacięty zaginek w żyłce.
Wsuń węzeł w wycięcie blisko podstawy portu wtryskowego i zabezpiecz go małym kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie zwróć materiał zużywalny do stacji bazowej. Po powtórzeniu wstrzyknięcia dla wszystkich materiałów zużywalnych, przejdź przez interfejs oprogramowania, aby poinformować, że szczepienie zostało zakończone.
Gdy oprogramowanie wróci na stronę główną, usuń biały zacisk z linii wyjściowych materiałów zużywalnych. Wejdź w Manual Ops i wykonaj funkcję Eject Excess z portem wyjściowym ustawionym na P dla perfuzji. Włącz tryb statycznego miksowania przy użyciu cyklu 1, 680 sekund włączonego i 120 sekund przerwy, a częstotliwość miksowania ustaw na pięć herców.
Aby rozpocząć pobieranie komórek, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby pobrać 200 mikrolitrów Pronazy oraz około 300 do 400 mikrolitrów powietrza. Odkręć korek bocznej linii wtryskowej i spryskaj złącze zaworu bezigłowego 70% etanolem. Zdejmij taśmę z zawiązanej bocznej linii wtryskowej, rozwiąż węzeł i odciśnij białą zacisk w kropli łez.
Teraz podłącz strzykawkę o średnicy jednego mililitra i delikatnie wstrzyknij Pronazę do reaktora. Ścigać ciecz powietrzem, aby zapewnić pełną dostawę. Ponownie załącz zacisk w kropli i zakręć linię wtryskową.
Następnie zwróć materiał do kapsuły, podłącz wszystkie przewody, zdejmij biały zacisk C i wznowij mieszanie. Połóż butelkę na odpady i butelkę z nośnikiem na lodzie. Uruchom pięciominutowy timer i pozwól Pronaze trawić mikronośniki w reaktorze.
Po pięciu minutach sprawdź, czy mikronośniki się zdegradowały, sprawdzając ich brak w reaktorze. Zbieraj komórki, wchodząc w Manual Ops, ustaw liczbę cykli na trzy, wybierz Port wyjściowy W dla odpadów i kliknij Eject Wash. Po zakończeniu cykli wyrzucania przenieś materiał zużywalny do szafy zabezpieczeń biologicznych.
Następnie wyjmij zawartość butelki odpadów za pomocą strzykawki o pojemności 10 lub 20 mililitrów. Zawartość butelki odpadów należy wydać do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów. Wiruj ogniwa przy 300g przez pięć minut.
Aspiruj supernatant i oceń rozmiar pelletu komórkowego. Warunki środowiskowe, takie jak pH, temperatura, rozpuszczony tlen i dwutlenek węgla, były stabilnie utrzymywane przez cały 10-dniowy okres hodowli w systemie mikrobioreaktora. Wahania pH były znacząco niższe w mikrobioreaktorze w porównaniu do warunków kolby polistyrenowej w hodowli tkankowej.
Wydajność komórek była wyższa w mikrobioreaktorze niż w kolbie T25, przy zachowaniu podobnej żywotności komórek. Spośród 14 zmierzonych cech krytycznych związanych z mocą mocy, dziewięć wykazało istotnie wyższą ekspresję mRNA w warunkach mikrobioreaktora w porównaniu do kolby T75.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę produkcji komórek uzależnionych od podłoża, takich jak komórki mezenchymalne komórek stromalnych (MSCs), w warunkach mikrobioreaktora. Jego celem jest rozwiązanie wyzwań związanych z przełożeniem klinicznym poprzez zwiększenie wydajności komórek i ich spójności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapie oparte na komórkach
- Technologia mikronośników
- Systemy bioreaktorów
Tło
- Komórki uzależnione od podłoża są kluczowe dla różnych terapii.
- Różnorodność populacji komórek może wpłynąć na spójność i działanie produktu.
- Zatwierdzenie regulacyjne może być wpłynięte przez wyzwania produkcyjne.
- Wysokodensyjna produkcja komórek jest istotna dla zastosowań terapeutycznych.
Cel badania
- Rozwój skalowalnej metody produkcji MSC.
- Poprawa kontroli środowiska podczas hodowli komórek.
- Ułatwienie monitorowania on-line warunków wzrostu komórek.
Stosowane metody
- System mikronośnik-mikrobioreaktor do hodowli komórek.
- Techniki monitorowania środowiska zintegrowane w procesie.
- Porównanie wydajności komórek i ekspresji genów z tradycyjnymi metodami.
- Zastosowanie jako przypadek użycia do ostrego zespołu ostrej niewydolności oddechowej.
Główne wyniki
- Porównywalna wydajność komórek do procesów opartych na kolbach.
- Obserwowano korzystne profile ekspresji genów.
- Protokół można rozszerzyć na inne komórki uzależnione od podłoża.
- Osiągnięto wysoki poziom kontroli nad warunkami hodowli.
Wnioski
- Ten protokół oferuje efektywne rozwiązanie do produkcji MSC.
- Rozwiązuje kluczowe bariery w klinicznym zastosowaniu terapii opartych na komórkach.
- Może poprawić zgodność z przepisami poprzez lepszą spójność.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microbioreactor-based expansion of anchorage-dependent mesenchymal stromal cells (MSCs) addresses critical bottlenecks in cell therapy manufacturing by enabling high-yield, quality-controlled production at benchtop scale. This approach enhances predictive confidence in cell product consistency and potency, supporting translational continuity for acute respiratory distress syndrome and other indications. The method's tight environmental control and scalability position it as a strategic asset for early process development and portfolio triage in cell-based therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-environment interactions relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of MSCs by maintaining critical quality attributes during expansion.
- Facilitates biological de-risking through controlled, reproducible culture conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated MSC populations for downstream potency and quality assays.
- Standardizes expansion conditions to improve reproducibility and quantitative comparability.
- Delivers scalable, high-yield cell outputs suitable for screening and process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell manufacturing with disease-relevant models for acute respiratory distress syndrome.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell phenotype and potency.
- Reduces risk of late-stage failure by supporting robust, quality-by-design manufacturing principles.
Pipeline & Workflow Integration
This microbioreactor protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling rapid process development, early quality assessment, and scalable transition to larger manufacturing platforms.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven testing of MSC function and environmental response.
- Screening: Ensures assay-ready, reproducible cell populations with quantitative output metrics.
- Analytics: Supports inline monitoring of pH, dissolved gases, and critical quality attributes for data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges benchtop process development with disease-relevant preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse anchorage-dependent cell types and indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell product quality and potency.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible cell expansion with tight environmental control.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces risk of late-stage biological failure.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioreactor operation and anchorage-dependent cell culture.
- Demands access to microbioreactor instrumentation and inline environmental monitoring systems.
- Necessitates cross-team standardization of process parameters and quality metrics.
- Adaptable to various cell sources with process-specific optimization.
- Physical scale and throughput may limit direct translation to large-scale manufacturing without further scale-up.
