Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Badamy oddziaływania białko-białko i białko-glikan, koncentrując się na kompleksie integryna-dezintegryna. Nasz model bada dynamikę strukturalną i podkreśla rolę siły powierzchniowej w pośredniczeniu w tworzeniu kompleksów i stabilności interakcji. Nasza grupa zajmuje się badaniem roli sił powierzchniowych w molekularnym rozpoznawaniu i ewolucji miejsc wiązania poprzez badanie powierzchniowych klastrów hydrofobowych obecnych w białkach.

Rozwiązanie NMR umożliwia detekcję oddziaływań białkowych. Chociaż słabe interakcje są niezbędne do życia, istnieje tendencja do kompleksów o wysokim powinowactwie, mimo że są one obecne w wielu ważnych funkcjach biologicznych. Nasza grupa koncentruje się na wykorzystaniu podejść integracyjnej biologii strukturalnej do badania dużych kompleksów białkowych.

Używamy NMR jako głównego narzędzia do badania dynamiki i aspektów funkcjonalnych. Na początek przygotuj czteromilimolowy roztwór D-mannozy w buforze fosforanu sodu o pH 7,4 z 50-milimolowym chlorkiem sodu i 5% tlenkiem deuteru. Podzielić roztwór na dwie próbki, z których jedna zawiera 80 mikromolowych CVN, a druga bez.

Aby zmapować wiązanie liganda poprzez perturbację przesunięcia chemicznego na spektrometrze NMR, należy ustawić sekwencję impulsów HSQCTOPSI dla akwizycji H1C13 HSQC. Skonfiguruj dziedzinę czasu, szerokość spektralną, częstotliwość nośnej i liczbę skanów. Oblicz perturbację przesunięcia chemicznego, korzystając z podanego równania.

Aby zmapować wiązanie liganda za pomocą różnicy transferu nasycenia, najpierw utwórz nowy zestaw danych. Skonfiguruj parametry eksperymentów STD NMR, przesiewając różne częstotliwości nasycenia lub ustalając częstotliwość, zmieniając czasy nasycenia, aby ocenić nagromadzenie. Skonfiguruj eksperymenty 1D H1 NMR przy użyciu sekwencji impulsów ZGPR.

Dostrój spektrometr do H1, wykonaj podkładkowanie i zmierz twardy impuls 90 stopni. Wyśrodkuj częstotliwość nośną w przybliżeniu na 4,7 części na milion, co odpowiada sygnałowi wody, a następnie wybierz STDDIFFESGP. 3 sekwencje impulsów i ustaw parametry akwizycji.

Ustaw szerokość widmową zgodnie z wymaganiami, opóźnienie międzyskanowania D1 na cztery sekundy i zdefiniuj czas nasycenia D20, zgodnie z celami eksperymentu. Załaduj listę FQ2 z częstotliwością off-rezonansową na poziomie minus 40 części na milion i częstotliwościami rezonansowymi, aby nasycić białko. Przetestuj częstotliwości rezonansowe minus 0,59, 0,73 i 8,1 części na milion, aby określić optymalne warunki.

Użyj optymalnej częstotliwości, aby uzyskać widma chorób przenoszonych drogą płciową w czasach nasycenia 0,5, jeden, 1,5, dwie, 2,5, trzy i cztery sekundy. Wykreślić odpowiednie wartości ASTD w funkcji czasu nasycenia. Teraz ustaw liczbę skanów na 64 i uśrednij pętlę eksperymentu cztery razy.

Następnie oblicz łączną liczbę skanów. Ustaw opóźnienie między skanami na cztery sekundy, a czas akwizycji na 2,7262976 sekundy. Skonfiguruj impuls nasycenia, ustawiając czas trwania na 50 milisekund i sterując kształtem Gaussa za pomocą programu kształtowego 9SP9.

Zastosuj filtr rzędowy T1 w wariancie STD NMR, a następnie ustaw czas blokady wirowania D29 w oparciu o wielkość białka. Aby odwzorować wiązanie liganda H1 R2, najpierw wybierz program impulsowy CPMG_ESGP2D ze standardowej biblioteki Bruker. Ustaw eksperyment jako akwizycję 2D.

Skonfiguruj parametry akwizycji, jak pokazano. Następnie uruchom eksperyment dla 200 cykli po osiem skanów każdy. Dostosuj listę liczników zmiennych zgodnie z żądanym całkowitym czasem cyklu CPMG.

Przeprowadź dwa eksperymenty, jeden dla próbki z białkiem i jeden dla próbki zawierającej tylko ligand. Wykreśl widma H1 dla każdego TCPMG za pomocą polecenia EFP lub sinus M, a następnie FP, a następnie dostosuj funkcję okna zgodnie z najlepszą strategią przetwarzania. Oblicz iloraz CPMG Q za pomocą równania.

Uzyskaj widma CVN znakowane H1N15HSQC N15 o temperaturze 298 kelwinów. Miareczkować D-mannozą, aby osiągnąć końcowe stężenia zera, jednego, dwóch, pięciu, 10, 20, 40 i 60 milimoli. Użyj czułej na fazę FHSQCF3GPPH szybkiej sekwencji impulsów HSQC ze standardowej biblioteki Bruker.

Następnie oblicz perturbację przesunięcia chemicznego za pomocą wzoru. Wykreślić wartości CSP dla każdej pozostałości w funkcji stężenia D-mannozy, aby wyznaczyć stałą dysocjacji KD za pomocą równania piątego. Następnie dopasuj wynikowe dane do pojedynczej izotermy wiązania za pomocą wzoru.

Użyj wrażliwej na fazę sekwencji impulsów HSQCT2ETF3GPSI3D i skonfiguruj parametry, jak pokazano, aby zmierzyć wartości N15 R2 poszczególnych pozostałości reszt CVN przy braku i obecności 60-milimolowej D-mannozy o temperaturze 298 kelwinów. Przetwarzaj widma pseudotrójwymiarowe za pomocą NMRPipe do generowania widm podobnych do HSQC dla każdego opóźnienia relaksacji. Zaimportuj przetworzone widma do platformy analitycznej.

Następnie zaznacz wszystkie widma i zastosuj narzędzie do śledzenia zmian intensywności. Wykreślić intensywność każdego piku krzyżowego w funkcji relaksu T i dopasować rozpad do funkcji monowykładniczej, aby wyodrębnić wartości N15 R2 dla każdej reszty. Oblicz błąd eksperymentalny na podstawie stosunku sygnału do szumu widm podobnych do HSQC przy 67,84 milisekundach.

Przetwarzaj obszar widma zawierający tylko szum i konwertuj go na plik tekstowy za pomocą podanego polecenia. Następnie określ odchylenie standardowe obszaru hałasu lub natężenia hałasu za pomocą oprogramowania statystycznego. Oblicz błąd eksperymentalny, używając podanego równania.

Zaburzenia przesunięcia chemicznego zaobserwowano dla obu anomerycznych form D-mannozy w obecności CVN, przy czym większe przesunięcia zaobserwowano w beta-D-mannozie, co wskazuje na preferencyjne wiązanie. Dla większości wodorów D-mannozy zaobserwowano dwa wyraźne piki w obecności CVN, odpowiadające stanom wolnym i związanym. Jądra wodoru wykazujące najwyższe wartości ASTD były związane z beta-D-mannozą, co jest zgodne z silnymi oddziaływaniami dwubiegunowymi z CVN.

W analizie szybkości relaksacji poprzecznej, H beta cztery był jedynym protonem, który wykazywał zauważalny wzrost relaksacji po związaniu się z CVN. Zaburzenia przesunięcia chemicznego H1 i N15 wywołane dodaniem liganda były najwyższe przy stężeniu do 10 milimolowców. Reszty I40, E41, N42, V43, D44 i G45 w obrębie nici beta wykazywały znaczące perturbacje przesunięć chemicznych, identyfikując je jako miejsce wiązania D-mannozy o wysokim powinowactwie.

Izotermy wiązania wykazały, że reszta D44 miała najwyższe powinowactwo wśród reszt nici beta, ze stałą dysocjacji wynoszącą około jednego milimola. Pomiar szybkości relaksacji N15 R2 wykazał zarówno wzrosty, jak i spadki wartości delta R2 po związaniu D-mannozy, co sugeruje mieszankę procesów stabilizacji konformacyjnej i wymiany. Reszty C58, R59, K74 i R76 wykazały podwyższone wartości delta R2, potwierdzając ich udział w miejscu wiązania o wysokim powinowactwie, podczas gdy reszty F4, C8, R24 i G27 reprezentowały region o niskim powinowactwie.