Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu
30 grudnia 2025
Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.
Nasze badania koncentrują się na odpowiedziach limfocytów T na neoantygeny i tkanki obwodowe, a te odpowiedzi są silnie zależne od primingu, dlatego skupiamy się głównie na miejscach, gdzie te zdarzenia zachodzą. Obecnie jedynymi szeroko stosowanymi opcjami blokującymi transport między węzłami chłonnymi a tkankami są metodyki systemowe, takie jak agoniści receptorów S1P oraz blokada integriny. Jednak to szerokie hamowanie uniemożliwia nam badanie wpływu konkretnych lokalnych węzłów chłonnych.
Nasz protokół zawiera szczegółowy opis wysoce selektywnych limfadenektomii na każdym z czterech głównych stacji węzłów chłonnych krezki, a ponieważ węzły te są dość wyspecjalizowane w odprowadzanym przez siebie segmencie jelitowym, ta dobrze tolerowana procedura przetrwania pozwala nam zakłócić konkretne segmenty osi limfatycznej jelita, pozostawiając pozostałe nienaruszone. Po potwierdzeniu odpowiedniej głębokości znieczulenia za pomocą uszczypnięcia tylnej stopy, użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie o średnicy środkowej linii skóry o grubości 0,5 do 1 centymetra w znieczulonej myszy. Używając sterylnych kleszczy, rozciń skórę z dala od ściany brzucha i zidentyfikuj linię albę.
Następnie wykonaj kolejne nacięcie o średnicy 0,5 do 1 centymetra przez linię albę, aby dostać się do jamy otrzewnej. Za pomocą igły gavage z tępym końcem wprowadź jeden mililitr sterylnej soli fizjologicznej w temperaturze ciała do jamy otrzewnej. Zwilż sterylne zasłony, aby przygotować się do ustawienia jelit.
Aby usunąć pierwszą stację węzła chłonnego, należy ukierunkować zewnętrzne jelito na wilgotne zasłony, z cekum ułożonym w dóle, okrężnicą bliższą górną, a kończyną jelita mocnej w stronę chirurga. Zidentyfikuj łańcuch węzłów chłonnych krezki, który biegnie wzdłuż jelita grubego. Używając skośnych, cienko zakończonych kleszczy, tępo rozcinaj pierwszą stację węzłów chłonnych z dala od naczyń ileokolowych, umieszczając zamknięte kleszcze między tymi strukturami i delikatnie je otwierając.
Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko przepływu bocznego do pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych, jednym milimetrowym i jednym milimetrowym bliskim od pierwszego stanowiska węzła chłonnego, używając szwu nylonowego monofilamentu i cienko zakończonych kleszczy. Delikatnie cofnij stację węzła chłonnego spod kaudalnego, a następnie za pomocą nożyczek cienkich wyciąć docelową stację węzła chłonnego od głowicy do ogonowej. Obserwuj dalsze gałęzie naczyń kościowo-kościowych, naczyń jelietowych i czczowych, aby potwierdzić, że ukrwienie pozostaje nienaruszone.
Aby wyciąć drugie stanowisko węzła chłonnego, delikatnie rozciąć jelito cienkie i ukierunkować zewnętrzne jelito na wilgotne zasłony, z cekum ułożonym dolnie, okrężnym jelitem górnym, a jelitem cienkim po prawej stronie chirurga. Następnie zidentyfikowaj drugą stację węzłów chłonnych, która biegnie wzdłuż jelita grubego i zaczyna się na zbiegu naczyń jelita brzęgowego i czego. Używając skośnych, cienko zakończonych szczypiec, tępo rozciąć drugie stanowisko węzła chłonnego z dala od naczyń jelitowca.
Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko przepływu bocznego do pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych, jednym milimetrowym i jednym milimetrowym bliskim do drugiego stanowiska węzła chłonnego, używając szwu nylonowego monofilamentu i cienko zakończonych kleszczy. Delikatnie cofnij stację węzła chłonnego do skałki, a następnie za pomocą nożyczek cienkich wyciąć drugą stację węzła chłonnego od głowicy do ogona. Sprawdź pole operacyjne, aby upewnić się nad hemostazą.
Aby wyciąć czwartą stację węzła chłonnego, delikatnie rozciąć całe jelito cienkie aż do tylnego punktu umocowania. Ułóż jelito na wilgotnych zasłonach tak, że cekum skierowano od dołu, jelito bliższe ku górze, a jelito cienkie po prawej stronie chirurga. Zidentyfikuj czwartą stację węzłów chłonnych, która znajduje się tuż przyśrodkowo od dalszego jelita grubego i bocznie od trzeciej stacji.
Używając skośnych, cienko zakończonych kleszczy lub nożyczek o bardzo cienkim końcu, tępo rozciń czwartą stację węzła chłonnego z dala od naczyń jelita grubego i otaczającej tkanki tłuszczowej. Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko przepływu bocznego do pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami przy każdym rozpoznawalnym węźle chłonnym, zwykle jeden milimetr od węzła, przy użyciu szwów nylonowych monofilamentowych i cienko zakończonych kłębków. Następnie delikatnie cofnij czwartą stację węzłów chłonnych cephalad.
Za pomocą nożyczek cienkich lub bardzo cienkich punktów wycinam stacje węzłów chłonnych od ogonowego do cefaladu. Powtórz procedurę dla drugiego węzła w czwartej stacji węzłów chłonnych. Ostrożnie rozciń węzeł, wykonaj ligację szwów w razie potrzeby i wyciąj go.
Sprawdź pole operacyjne, aby potwierdzić hemostazę. Po sprowadzeniu zawartości jamy brzusznej do jamy otrzewnej należy wprowadzić do jamy brzusznej jeden mililitr sterylnej soli fizjologicznej o temperaturze ciała, aby zrekompensować utratę płynu odparowującego. Zamknąć brzuch w dwóch warstwach: najpierw ścianę brzucha, potem skórę za pomocą szwu z monofilamentu polipropylenowego 6-0 w układzie bieganym.
Tkanka pobierana metodą limfadenektomii krezkowej konsekwentnie skutkowała próbkami o niskiej zawartości tłuszczu, co potwierdza natychmiastowe zapadnięcie PBS. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła pomyślną ekstrakcji węzłów chłonnych, przy czym ponad 95% komórek w próbkach pochodzących z krezki limfadenektomii zostało zidentyfikowanych jako CD45 pozytywnych, w porównaniu do jedynie 7% w kontrolnej grupie tkanki tłuszczowej trzewnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół selektywnej limfadenektomii krezkowej u myszy, umożliwiający celowe usunięcie konkretnych grup węzłów chłonnych krezkowych. Technika ta pozwala badaczom na przerwanie komunikacji limfatycznej z określonymi segmentami jelit, co ułatwia badania nad odmiennymi rolami lokalnych i systemowych węzłów chłonnych w primingu limfocytów T oraz immunologii jelit. Procedura została opracowana w celu zapewnienia wysokiego wskaźnika przeżywalności oraz umożliwienia natychmiastowego przetworzenia tkanek w kolejnych etapach analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Gastrologia
- Techniki chirurgiczne w modelach zwierzęcych
Wstęp
- Immunonadzór i tolerancja antygenowa w jelitach zależą od równowagi w lokalnym mikrośrodowisku.
- Aktywacja krążących limfocytów T w węzłach chłonnych jest dobrze udokumentowana, jednak niekrążące limfocyty T w drenujących węzłach chłonnych mogą pełnić unikalne, nieredundantne role.
- Drenaż limfatyczny jelit jest ściśle specyficzny dla danego segmentu, co wymaga precyzyjnych podejść eksperymentalnych.
- Istniejące systemowe metody blokowania transportu między węzłami chłonnymi a tkankami wykazują brak specyficzności względem lokalnych węzłów chłonnych.
Cel badania
- Zapewnienie powtarzalnego, chirurgicznego protokołu przeżywalnościowego do selektywnego usuwania stacji węzłów chłonnych krezkowych u myszy.
- Umożliwienie ukierunkowanej przerwy w drenażu limfatycznym z dystalnej części okrężnicy, proksymalnej części okrężnicy i/lub jelita cienkiego.
- Ułatwienie badań rozróżniających wkład lokalnych i systemowych węzłów chłonnych w odpowiedzi immunologiczne jelit.
Zastosowane metody
- Operacja przeżywalności w znieczuleniu z nacięciami brzucha w linii pośrodkowej.
- Identyfikacja i tępa dyssekcja konkretnych stacji węzłów chłonnych krezkowych przy użyciu pęsety z cienkimi końcówkami i nożyczek.
- Opcjonalne podwiązanie szwem w celu zminimalizowania odpływu chłonnego przez naczynia oboczne.
- Staranna resekcja stacji węzłów chłonnych z zachowaniem ukrwienia i hemostazą.
- Pooperacyjne zamknięcie rany w dwóch warstwach i uzupełnienie płynów.
- Walidacja ekstrakcji węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej (wzbogacenie komórek CD45+) oraz testu wyporności tkanki w PBS.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie próbek węzłów chłonnych z minimalnym zanieczyszczeniem tkanką tłuszczową, co potwierdza natychmiastowe opadanie próbek w PBS.
- Cytometria przepływowa wykazuje ponad 95% komórek CD45+ w próbkach pochodzących z limfadenektomii, w porównaniu do zaledwie 7% w kontrolnych próbkach trzewnej tkanki tłuszczowej.
- Procedura jest dobrze tolerowana i można ją dostosować do selektywnego przerwania drenażu limfatycznego z konkretnych odcinków jelit.
- Szczegółowe rozwiązywanie problemów oraz pomoce wizualne poprawiają powtarzalność i wskaźniki przeżywalności.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne, segmentowe przerwanie drenażu limfatycznego jelit w modelach mysich.
- Wspiera on badania nad odmiennymi rolami lokalnych i systemowych węzłów chłonnych w regulacji odporności jelit.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej jakości próbek węzłów chłonnych, odpowiednich do dalszych analiz immunologicznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Selektywna limfadenektomia krezkowa u myszy umożliwia precyzyjne przerwanie komunikacji limfatycznej z konkretnymi segmentami jelit, co bezpośrednio wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w procesach badawczych ukierunkowanych na immunologię. Możliwość ta pozwala zespołom biofarmaceutycznym na badanie unikalnych ról lokalnych i systemowych węzłów chłonnych w aktywacji limfocytów T oraz regulacji odporności jelitowej, co dostarcza informacji kluczowych dla walidacji celów terapeutycznych i strategii biomarkerów translacyjnych. Powtarzalność i adaptowalność opisanego protokołu sprawiają, że stanowi on uniwersalną platformę dla przedklinicznych badań nad immunologią i chorobami jelit.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę wkładu lokalnych i systemowych węzłów chłonnych w odpowiedzi immunologiczne.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację regionowo specyficznych szlaków limfatycznych w modelach jelitowych.
- Ułatwia prowadzenie badań opartych na hipotezach dotyczących primingu limfocytów T i immunosurweilancji w określonych segmentach jelit.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane próbki węzłów chłonnych o niskiej zawartości tłuszczu do dalszych analiz immunologicznych.
- Standaryzuje ekstrakcję tkanek w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych, takich jak cytometria przepływowa.
- Przygotowuje systemy biologiczne do rzetelnej oceny związków immunomodulujących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do specyfiki segmentu jelita istotnej dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie lokalnych mechanizmów odpornościowych.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez izolację regionalnie odmiennych populacji komórek odpornościowych i limfatycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w ciąg procesów od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając selektywne przerwanie ciągłości naczyń limfatycznych, co wspiera zarówno badania mechanistyczne, jak i rozwój modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących lokalnej regulacji odpornościowej i specyfiki szlaków w jelitach.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, wysokiej czystości próbki węzłów chłonnych do ilościowych odczytów immunologicznych.
- Analityka: Wspiera cytometrię przepływową i inne analizy komórkowe w celu porównania populacji komórek odpornościowych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z modelami przedklinicznymi poprzez specyficzną dla regionu manipulację limfatyczną.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy zestandaryzowaną, adaptacyjną platformę dla różnorodnych badań z zakresu immunologii jelit.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad mechanizmami odpornościowymi i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację ekstrakcji węzłów chłonnych oraz dalszych analiz.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie wkładu odporności miejscowej w stosunku do systemowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów immunologicznych ukierunkowanych na jelita z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach chirurgicznych u myszy oraz w procedurach sterylnych.
- Niezbędny jest dostęp do precyzyjnych instrumentów chirurgicznych oraz infrastruktury do cytometrii przepływowej w celu walidacji.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa dla zapewnienia spójnej jakości próbek i powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych segmentach jelita, lecz ograniczona do opisanych modeli mysich.
- Potencjał bocznego przepływu limfatycznego wymaga opcjonalnego podwiązania szwem w celu uzyskania maksymalnej swoistości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:02
Mesenteric Lymphadenectomy and Excision of the First Lymph Node Station (Proximal Colon Drainage)
3:13
Excision of the Second Lymph Node Station (Mid-Distal Small Intestine Drainage)
4:39
Excision of the Fourth Lymph Node Station (Distal Colon Drainage)
6:16
Mesenteric Lymphadenectomy Completion
6:45
Results
