Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Zakres naszych badań polega na uproszczeniu generowania myszy knockoutowych poprzez zastosowanie elektroporacji in ulot, dostarczając komponenty edycji genomu bezpośrednio do przewodów jajowych u ciężarnych samic. Mikrozastrzyki w zygoty wymagają utrzymania dużej liczby zwierząt, w tym samic dawców i biorców oraz samców poddanych wazektomii. Dlatego preferowane są protokoły minimalizujące korzystanie ze zwierząt.

Zastosowanie systemu Nepa21 do elektroporacji zygot daje unikalną możliwość wygenerowania ukierunkowanych myszy z nokautem genu w jednym kroku, z efektywnością porównywalną ze standardowymi technikami opartymi na zastrzykach jądrowych. Na początek użyj narzędzi analizy obliczeniowej do identyfikacji potencjalnych sekwencji RNA prowadzących skierowanych do wybranego genu. Wybierz sekwencje znajdujące się w egzonach tak blisko, jak to możliwe, do pożądanego miejsca mutacji. Użyj przeglądarki genomów do porównania struktury egzomu i priorytetyzacji sekwencji obecnych w większości izoform splicingu.

Analizuj przewidywaną aktywność poza celem każdej sekwencji przewodnika, korzystając z zintegrowanego systemu punktacji narzędzia. Wybierz sekwencje, które wykazują najmniejsze prawdopodobieństwo niecelowego wiązania. Aby uzyskać liniowy dwuniciowy szablon DNA, przygotuj główną mieszankę PCR z wykorzystaniem składników określonych w danej tabeli.

Dodaj polimerazę na końcu i utrzymuj mieszankę główną na lodzie, aby zachować stabilność enzymatyczną. Następnie przeprowadź PCR w następujących warunkach cyklu termicznego. Następnie przygotuj mieszankę master do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem podanych składników i inkubuj reakcję przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą termocyklera dla stałej kontroli temperatury.

Następnie do reakcji dodaj dwa mikrolitry DNazy I. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut, aby strawić szablon DNA, a następnie inaktywuj enzym w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po oczyszczeniu RNA TRIzol należy zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i sprawdzić stosunki A260 do A280 oraz A260 do A230.

Aby przygotować kompleks rybonukleoproteinowy do transfekcji, rozcieńcz bufor Tris-HCl z jednego molu do stężenia 100 milimolowych za pomocą wody wolnej od nukleazy. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,022 mikrometra. Rozdzielić porcje po 10 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.

Następnie przygotuj mieszankę transfekcyjną z użyciem nukleazy spCas9, pojedynczego RNA prowadzącego oraz Tris-HCl rozcieńczonej wodą DEPC w rurce wolnej od nukleazy. Inkubuj mieszankę transfekcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby umożliwić powstanie kompleksu rybonukleoproteinowego. Następnie aliquot przekształca mieszankę transfekcyjną w małe objętości odpowiednie do pojedynczych sesji I-GONAD i utrzymuj ją przy czterech stopniach Celsjusza, aby zachować aktywność odczynnikową.

Po kopulacji samic myszy CD1 z samcami CD1 w jednej nocy sprawdź każdą samicę pod kątem obecności koreka kopulacyjnego. Przenosi się tylko samice z widocznymi korkami do nowej klatki na dalsze eksperymentalne zabiegi. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne ze stali nierdzewnej, aby zapewnić sterylność przed użyciem.

Następnie zważ wybrane wtyczki=dodatnie samice myszy na wadze elektronicznej przed znieczuleniem. Monitoruj znieczulone myszy pod kątem utraty odruchu szczypania palców, aby potwierdzić odpowiednią znieczulenie. Połóż mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu.

Następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec suchości. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj podłużne nacięcie o szerokości 0,7 centymetra w skórze dolnej części pleców. Następnie rozchyl bocznie lekko otwarte końcówki nożyczek, aby delikatnie przedłużyć nacięcie skórne do około 1,3 centymetra.

Następnie ostrożnie wykonaj nacięcie o średnicy 0,7 centymetra w otrzewnej, aby odsłonić jamę brzuszną. Przedłuż nacięcie otrzewne do 1,1 centymetra, przepychając się obustronnie lekko otwartymi końcówkami nożyczek. Znajdź poduszkę tłuszczową połączoną z jajnikiem i delikatnie ją wyciągnij na zewnątrz za pomocą kleszczy, aż odsłonię jajnik, jajowód i macicę.

Za pomocą zacisku naczyniowego zabezpiecz poduszkę tłuszczową, aby ustabilizować struktury rozrodcze. Następnie załaduj dwa mikrolitry mieszanki do wstrzykiwania rybonukleoproteiny do jednorazowej plastikowej kapilary za pomocą pipetera do stripera. Za pomocą mikronożyczek wykonaj nacięcie o średnicy 0,2 centymetra w ścianie przewodu jajowego kilka milimetrów powyżej ampuły.

Włóż plastikową kapilarę przymocowaną do pipetera do nacięcia w jajowódzie i ostrożnie wydłuż mieszankę do wstrzykiwania, nie wprowadzając powietrza. Delikatnie wyjmij naczyń z jajowodu plastikowego, aby zakończyć wstrzyknięcie. Włącz elektroporator, naciskając przycisk zasilania na przednim panelu.

Ustaw parametry elektroporacji na urządzeniu zgodnie z ekranem. Za pomocą elektrod typu pęsetowego delikatnie chwyć jajowód i naciśnij przycisk Kiloohma, aby zmierzyć opór. Bezpośrednio po pomiarze rezystancji naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację i poczekać na pojawienie się sygnału końcowego na przycisku Ohm.

Po elektroporacji pierwszego jajowodu delikatnie przywróć drogi rozrodcze do jamy brzusznej. Zamknąć nacięcie za pomocą chirurgicznego szwu z kwasem poliglikolowym 4-0. Do genotypowania zaprojektuj od 18 do 21 długich starterów nukleotydowych o temperaturze topnienia blisko 60 stopni Celsjusza, aby uzyskać produkt PCR par zasad o długości 300–600 par.

Aby potwierdzić specyficzność każdego startera, wykonaj wyszukiwanie BLAST w bazie genomu myszy, aby wyeliminować ryzyko niespecyficznego amplifikowania. Następnie, podczas ekstrakcji DNA, za pomocą ciopatki do uszu, pobierz małą próbkę tkanki o wielkości około dwóch milimetrów z ucha myszy. Dodaj 100 mikrolitrów buforu lizy.

Inkubuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 60 minut, wykonując wiry co 20 minut, aby zapewnić skuteczną lizę. Po wykonaniu sekwencjonowania Sangera przeanalizuj wyniki, aby ocenić wyniki edycji genomu. Aby użyć analizy ICE, należy przesłać oba pliki sekwencjonowania Sangera, wpisać sekwencję przewodnika RNA i wybrać odpowiednią nukleazę użytą w eksperymencie CRISPR.

Następnie, aby użyć TIDE, należy przesłać pliki sterujące i sekwencjonowania eksperymentalne w formacie AB1 i wpisać sekwencję przewodnika RNA. Analiza ICE wykryła trzy różne warianty indel w miejscu cięcia Cas9: usunięcie jednej pary zasad w 42% sekwencji, usunięcie trzech par zasad w 25% sekwencji oraz usunięcie 23 par zasad w 27% sekwencji. Wartość dopasowania modelu wyniosła 0,94, a wynik nokautowy 69, co wskazuje na silną przewidywaną korelację i prawdopodobny nokaut genu.

Chromatogramy sekwencyjne potwierdziły zaburzenia w miejscu cięcia Cas9 w edytowanej próbce, podczas gdy chromatogram kontrolny wykazał nienaruszoną sekwencję w tym samym miejscu. Spośród sześciu elektroporanych myszy tylko cztery wydały młode z mutacjami, co daje 60% ogólnej efektywności edycji. Wszystkie mioty wśród sześciu elektroporowanych myszy wykazywały zmniejszoną liczbę szczeniąt, zaledwie trzy do czterech na mysz.