Name: Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę I-GONAD do generowania myszy knockout za pomocą elektroporacji in vivo, która redukuje liczbę zwierząt laboratoryjnych przy zachowaniu wysokiej efektywności edycji genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Uniwersytetowi Badawczemu w Peterburgu, Centrum Technologii Molekularnych i Komórkowych. Sekwencjonowanie przeprowadzono za pomocą analizatora genetycznego ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, USA) w Centrum Zasobów Technologii Molekularnych i Komórkowych, Parku Naukowego Uniwersytetu Państwowego w Petersburgu. Autorzy są wdzięczni Marii Rubel za pomoc w redagowaniu i przesyłaniu dokumentów. Badania te zostały sfinansowane przez Uniwersytet Państwowy Petersburski, projekt badawczy ID: 129658320, a Luibov Shkodenko był wspierany przez Rosyjską Fundację Naukową (projekt 25-26-00247).

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Zwierząt Uniwersytetu Państwowego w Petersburgu (Zatwierdzenie nr 131-03-5, 11 października 2022). Wszystkie procedury ściśle przestrzegały wytycznych określonych w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Powszechne laboratoryjnie wyprodukowane myszy CD1 pozyskano w Centrum Zbiorowego Użycia Instytutu Związków Fizjologicznie Aktywnych Rosyjskiej Akademii Nauk (IPAC RAS). Samice myszy CD1 w wieku 2-3 miesięcy (średnia waga 27-30 g) były wykorzystywane do kopulacji z samcami myszy CD1 w wieku 2,5-4 miesiące (średnia waga 35-37 g). Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Projekt pojedynczego RNA (sgRNA) i jego przygotowanie do transfekcji
<ol>
	<li>Wykorzystaj narzędzia analizy obliczeniowej, takie jak CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design czy CRISPOR, aby zidentyfikować potencjalne sekwencje sgRNA skierowane do wybranego genu. UWAGA: Oprogramowanie potrafi identyfikować potencjalne sekwencje sgRNA w całym genie i sugeruje wiele wariantów na wyjściu. Narzędzia te zasugerują najbardziej optymalne opcje sgRNA i pozwolą użytkownikowi wybrać spośród wszystkich zidentyfikowanych wariantów, jeśli zajdzie taka potrzeba. Przy wyborze należy wziąć pod uwagę następujące kryteria:<ol>
		<li>Bliskość egzonów: Wybierz sekwencje znajdujące się w egzonach jak najbliżej pożądanego punktu mutacji. Aby uzyskać lepsze wyniki, rozważ alternatywne izoformy splicowania i wybierz docelową sekwencję obecną w największej liczbie izoform. Rozważ przeglądarki genomu (np. Ensembl) dla dokładnego wyboru eksonów.</li>
		<li>Rozważania poza celem: Analizuj potencjalne efekty poza celem za pomocą systemu punktacji narzędzia, wybierając sekwencje wykazujące najniższą przewidywaną aktywność poza celem. UWAGA: Narzędzia obliczeniowe, takie jak CHOPCHOP czy Synthego, są bardzo skuteczne w ocenie bliskości eksonów i efektów poza celem, pomagając identyfikować optymalne sekwencje sgRNA do precyzyjnej edycji genomu. Projektując RNA przewodnika, ważne jest uwzględnienie konkretnej sekwencji genu zainteresowanego w stosowanym szczepie myszy. Dla niektórych szczepów myszy (np. C57Bl, CBA, C3H) dostępna jest pełna sekwencja genomowa. Jeśli takie dane są niedostępne, może być wskazane przeprowadzenie wstępnego sekwencjonowania docelowego genu w planowanym obszarze edycji. Pojedyncze niedopasowania w przewodniku RNA, spowodowane polimorfizmami, mogą obniżać efektywność edycji. Locus genomu myszy ROSA 26 został wycelowany sekwencją sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamów zestaw starterów do amplifikacji PCR szablonu sgRNA, zgodnie z Tabelą 1. UWAGA: gRNA może być uporządkowane gdzie indziej, zarówno jako sgRNA, jak i jako crRNA:tracrRNA duplex.</li>
	<li>Stwórz liniowy szablon dsDNA.<ol>
		<li>Przygotuj miks master zgodnie z Tabelą 1. Na końcu dodaj polimerazę i trzymaj mieszankę główną na lodzie, aby zachować stabilność.</li>
		<li>Przeprowadzić badanie PCR w następujących warunkach: początkowa denaturacja: 30 s przy 95 °C; 30 cykli: 20 s przy 95 °C (denaturacja), 20 s przy 55 °C (wyżarzanie), 15 s przy 72 °C (wydłużenie); Końcowe wydłużenie: 2 minuty przy 72 °C; Utrzymuj temperaturę 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosuj mieszaninę reakcji PCR w dalszej reakcji transkrypcji in vitro (IVT).<ol>
		<li>Przygotuj mieszankę główną IVT zgodnie z Tabelą 2 i inkubuj przez 1,5 godziny w 37 °C. Użyj termocyklera do stałej kontroli temperatury.</li>
		<li>Dodaj 2 μL DNazy I i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć matrycę DNA.</li>
		<li>Inaktywuj DNazę I poprzez inkubację mieszaniny reakcji w 75 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Oczyszczaj RNA za pomocą odczynnika TRIZOL zgodnie z protokołem producenta. UWAGA: Utylizacja odczynnika TRIZOL oraz DNAse1, jego roztworów lub jakichkolwiek produktów ubocznych powinna być umieszczana w wyznaczonych pojemnikach na odpady chemiczne.</li>
		<li>Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (typowa wydajność jednej reakcji wynosi 3-5 μg). Sprawdź przełożenia A260/A280 oraz A260/A230. A260/A280 powinien mieć co najmniej 2,0, a stosunek A260/A230 również powinien być co najmniej 2,0 (czyli nie ma zanieczyszczenia białkami ani rozpuszczalnikami organicznymi). Przechowuj sgRNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę RNP do transfekcji<ol>
		<li>Mieszanka transfekcyjna składa się z kompleksu RNP, który jest mieszaniną białka Cas9 i sgRNA. Postępuj zgodnie z tymi krokami, aby przygotować miks RNP:</li>
		<li>Rozcieńcz bufor 1 M Tris-HCl (pH 7,5) do 100 mM wodą wolną od nukleazy i filtruj filtrem strzykawkowym o porze 0,022 μM, podaj w porach po 10 μL i przechowuj w 4 °C do czasu użycia.</li>
		<li>W probówce wolnej od nukleazy przygotuj mieszankę transfekcyjną następujących składników w końcowych stężeniach: nukleaza spCas9 500 ng/μL, sgRNA 80 ng/μL, 10 mM Tris-HCl rozcieńczona wodą poddawaną DEPC. UWAGA: Wymagane są wysokie stężenia składników mieszanki RNP, aby zapewnić właściwą efektywność protokołu.</li>
		<li>Inkubuj mieszankę transfekcyjną w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić powstanie kompleksu RNP.</li>
		<li>Aliquotuj mieszankę na małe objętości (2 μL) odpowiednie na jedną sesję I-GONAD.</li>
		<li>Utrzymuj alikwoty na poziomie 4 °C podczas sesji I-GONAD. Miksie przygotowuje się na świeżo do każdej sesji elektroporacji I-GNANO, aby zachować stabilność. UWAGA: Mieszanka RNP powinna być przygotowywana świeżo na każdą sesję I-GONAD, aby zapewnić optymalną aktywność i efektywność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie samic myszy do edycji genomu poprzez dostarczanie kwasów nukleinowych do jajowódu
<ol>
	<li>Kopulacja i selekcja samic myszy: Łącz samice myszy CD1 z samcami CD1 w nocy w jednym miejscu. Rano sprawdź, czy u samic myszy nie ma korków do kopulacji. Wybieraj samice z korkami do kopulacji i przenosi je do nowej klatki na dalsze zabiegi. UWAGA: Aby zminimalizować mozaicizm genetyczny, optymalny czas na dostarczenie konstrukcji genetycznej to 0,7 dnia po kopulacji na etapie pojedynczokomórkowym (zygota)10. Odpowiada to mniej więcej godzinie 16:00 w dniu, w którym wykryto korek kopulacyjny. Na tym etapie rozwarstwienie przewodu jajowego ujawnia, że zygoty mają mniej komórek kumulusowych, choć pozostają one w ampeli. Co istotne, komórki kumulusowe mogą również pobierać egzogenne kwasy nukleinowe lub białka podczas elektroporacji. Jeśli zabieg zostanie wykonany wcześniej, na przykład 10 godzin po kopulacji, komórki kumulusowe nadal ściśle otaczają zygoty, co może utrudniać efektywne dostarczanie kwasów nukleinowych elektroforetycznym do zygot. Nie używaj myszy pobudzonych hormonalnie, ponieważ mogą one produkować zbyt wiele oocytów, co może prowadzić do poronienia.</li>
	<li>Przygotowanie narzędzi chirurgicznych: Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne ze stali nierdzewnej, aby zapewnić bezpłodność. Wszystkie przedmioty nieze stali nierdzewnej, które mają kontakt z narządami wewnętrznymi myszy, powinny być dostarczane jako produkty sterylne lub jednorazowe.</li>
	<li>Znieczulenie, znieczulenie i przygotowanie myszy: Zważ wybrane samice myszy i nałóż roztwór meloksykamu (5 mg/kg, s.c.) 15 minut przed indukcją znieczulenia. Znieczulanie myszy za pomocą iniekcji dootrzewnowej z mieszanką ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).<ol>
		<li>Monitoruj myszy pod kątem utraty odruchu szczypania palców, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie. Umieść znieczuloną mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu. Chroń oczy myszy przed suchością podczas znieczulenia, nakładając maść weterynaryjną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Usuń włosy z miejsca operacji i zdezynfekuj skórę peelingiem lub roztworem z chlorheksydyną lub betadyną, a następnie nałóż 70% etanolu w trzech naprzemiennych przejściach.</li>
	<li>Zrób 0,7 cm podłużnego nacięcia skórnego w dolnej części pleców...</li>
	<li>Przedłuż nacięcie do 1,3 cm, pchając bocznie lekko rozchylonymi końcówkami nożyczek.</li>
	<li>Ostrożnie wykonaj małe nacięcie (0,7 cm) w otrzewnej, aby dostać się do jamy brzusznej.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie do 1,1 cm, przesuwając bocznie lekko otwartymi końcówkami nożyc.</li>
	<li>Zlokalizuj poduszkę tłuszczową przymocowaną do jajnika i delikatnie ją wyciągnij za pomocą kleszczy, aż jajnik, jajowód i macica będą wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Przymocuj tłuszczową poduszkę na miejscu za pomocą zacisku naczyniowego.</li>
	<li>Wizualizuj jajowód pod mikroskopem stereoskopowym dla precyzyjnej manipulacji (Rysunek 1).</li>
	<li>Załaduj 2 μL mieszanki do wtrysku do sterylnej płytki włosowatej plastikowej za pomocą pipetora stripper. UWAGA: Pipettor Stripper z jałowymi naczyniami włosowatymi z tworzywa sztucznego, pierwotnie zaprojektowany do manipulacji zarodkami w klinikach IVF, może wspierać wiele zastosowań, w tym transfer zarodków oraz dostarczanie konstrukcji CRISPR/Cas9 w procedurach I-GONAD. Pipettor pełni funkcję precyzyjnego dozownika cieczy; W połączeniu ze sterylnymi, jednorazowymi, elastycznymi kapilarami umożliwia sterylność i zapobiega krzyżowemu zanieczyszczeniu. Krewne naczynia włosowate są lepsze niż szkło do wstrzykiwania mieszanki RNP do transfekcji do jajowódu, ponieważ są mniej urazowe dla delikatnych tkanek. W przeciwieństwie do szklanych kapilar, jednorazowe plastikowe nie wymagają polerowania ogniem, aby wygładzić ostre krawędzie przed włożeniem, co skraca czas przygotowania i ryzyko uszkodzenia.</li>
	<li>Za pomocą mikronożyczek wykonaj małe nacięcie (0,2 cm) w ścianie przewodu jajowego kilka milimetrów powyżej ampuły.</li>
	<li>Ostrożnie włóż pipettor Stripper z plastikową kapilarą do nacięcia i wypchnij mieszankę do jajowódu. UWAGA: Upewnij się, że powietrze nie dostaje się do jajowódu, ponieważ może to wpływać na efektywność elektroporacji. Aby temu zapobiec, napełnij naczyń z plastikiem do zastrzyków większą ilością mieszanki do wstrzykiwania niż to konieczne i unikaj całkowitego wstrzykiwania. Płytki włosowate tworzywne nadają się zarówno do przenoszenia zabłonka do zapłodnienia, jak i do bezpośredniej sekcji ściany jajowodu pomiędzy zapłodnikiem a ampułką. Metoda bezpośredniego rozcinania ściany jajowodu może być mniej traumatyczna niż transfer z infundibulum, ponieważ ten drugi wymaga początkowego nacięcia przez cienką błonę kaletki pokrywającą jajowód i infundibulum. U myszy CD1 błona ta jest silnie unaczyniona, a jej przecięcie może powodować niewielkie krwawienie, co może utrudnić widoczność i utrudnić mikroiniekcję mieszanki RNP.</li>
	<li>Delikatnie usuń plastikową kapilarę z jajowódu.</li>
</ol>
4. Elektroporacja i szycie
<ol>
	<li>Włącz elektroporatora, naciskając przełącznik na przednim panelu.</li>
	<li>Ustaw parametry elektroporacji: Impuls poracyjny: Napięcie: 50 V, Długość impulsu: 5 m, Interwał impulsów: 50 ms, Liczba impulsów: 3, Szybkość zaniku - 10%, Polaryzacja: +/-; Impuls transferowy: Napięcie: 10 V, Długość impulsu: 50 ms, Interwał impulsów: 50 ms, Liczba impulsów: 3, Szybkość zaniku - 40%, polaryzacja: +/-; Limit obecny: in vivo.</li>
	<li>Za pomocą elektrod typu pęsetowego ostrożnie chwyć jajowód i sprawdź wartość rezystancji, naciskając przycisk kΩ na elektroporatorze. Upewnij się, że elektrody są wystarczająco sprężone, aby rezystancja pozostawała w optymalnym zakresie 350-400 Ω. UWAGA: Można to osiągnąć, regulując odległość między dwoma elektrodami, gdy nienaruszony jajowód jest umieszczony między nimi.<ol>
		<li>Bezpośrednio po zmierzeniu oporu naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację. Ten krok jest kluczowy dla zapewnienia efektywnego dostarczania składników CRISPR-Cas do zygot4. Poczekaj, aż przycisk Ω wyświetli sygnał "zakończenie". Zapisz wartości pokazane w ramce Pomiarów. UWAGA: Wartość impedancji powinna wynosić około 250-400 Ω/150-250 mA wartości napięcia, aby zapewnić optymalną równowagę między żywotnością a efektywnością transferu. Aby utrzymać tę równowagę, należy unikać pokrywania obszarów jajowodów kawałkiem mokrego papieru nasączonym zmodyfikowaną solą fosforanową (DPBS) Dulbecco, zalecaną w niektórych protokołach, ponieważ ten krok może znacząco zmniejszyć opór powyżej optymalnego zakresu. Zmniejszona rezystancja może podnieść napięcie do ponad 250 mA, prowadząc do śmierci komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu elektroporacji jednego jajowodu ostrożnie umieść drogi rozrodcze z powrotem w jamie brzusznej. Zszyj nacięcie za pomocą chirurgicznego szwu z kwasem poliglikolowym 4-0.</li>
	<li>Powtórz operację i elektroporację na drugim jajowodzie. Po zakończeniu przywróć drogi rozrodcze do jamy brzusznej i zszyj nacięcie zgodnie z opisanym powyżej.</li>
	<li>Monitorowanie po zabiegu: Umieść mysz w ciepłej (37 °C), wyczyść klatkę na czas rekonwalescencji i monitoruj, aż całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu. UWAGA: Po operacji trzymaj myszy w klatkach zawierających po dwie myszy w każdej klatce. Jeśli tylko jedna mysz przeszła operację, zapewnij jej towarzyszkę. Ta praktyka pomaga zmniejszyć niepotrzebny stres u myszy chirurgicznej i sprzyja bardziej naturalnemu środowisku społecznemu. Po 12 godzinach wykonaj drugi zastrzyk środka przeciwbólowego (meloksykam, 5 mg/kg, s.c.).</li>
</ol>
5. Genotypowanie
<ol>
	<li>Konstrukcja spłonka<ol>
		<li>Do genotypowania projektuj startery wzmacniające produkt PCR o długości od 300 do 600 bp. Startery powinny mieć długość 18-21 nukleotydów i temperaturę topnienia (Tm) około 60 °C.</li>
		<li>Unikaj sekwencji tworzących struktury wtórne lub dimery podkładowe. Korzystaj z narzędzi programowych takich jak PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 lub podobnych, aby zapewnić jakość podkładu.</li>
		<li>Wykonaj wyszukiwanie BLAST w bazie genomu myszy, aby potwierdzić specyficzność starterów i uniknąć niespecyficznego amplifikowania11. UWAGA: Następujące zapalniki zostały zaprojektowane do genotypowania sekwencji docelowej: Zapalnik przedni: 5'-CTCTCCCAAGTCGCTCTGA-3'; Odwrotny zapalnik: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', oczekiwana długość produktu PCR: 320 bp, Tm 62°C. Do sekwencjonowania Sangera zaprojektuj podkład sekwencjonowy, który wyżarza 150-200 bp od miejsca cięcia Cas9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję DNA. Do szybkiej ekstrakcji DNA najprostszy jest protokół izolacji Hotshot12 .<ol>
		<li>Za pomocą ciosuka do ucha pobierz mały fragment tkanki (około 2 mm) z ucha myszy.</li>
		<li>Dodaj 100 μL buforu lizy (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12).</li>
		<li>Inkubuj w 95 °C przez 60 minut, wirując mieszankę co 20 minut.</li>
		<li>Dodaj 100 μL buforu neutralizującego (40 mM Tris-HCl, pH = 5) i dokładnie przeszukaj wiry.</li>
		<li>Użyj 1-5 μL końcowego przygotowania do PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmacnianie i sekwencjonowanie PCR. Przygotuj mieszankę PCR zgodnie z Tabelą 3. Użyj polimerazy DNA do korekty, aby zapewnić wysoką wierność. Aliquot master miesza w wymaganej liczbie probówek i dodaje DNA genomowe. UWAGA: Zawsze uwzględniaj próbkę DNA typu dzikiego jako kontrolę do analizy sekwencjonowania.</li>
	<li>Zrób PCR do genotypowania ROSA26 . Zastosowano następujące warunki: początkowa denaturacja: 30 s przy 95 °C; 28 cykli: 20 s przy 95 °C (denaturacja), 20 s przy 62 °C (wyżarzanie), 20 s przy 72 °C (wydłużenie); Końcowe wydłużenie: 2 minuty przy 72 °C; Utrzymuj temperaturę 4 °C. UWAGA: Dostarczony protokół jest dokładny dla amplifikacji fragmentu locus ROSA26 (szacowany rozmiar 320 bp) przy użyciu starterów z kroku 1.1.2. Aby uzyskać bardziej precyzyjne i dokładne wzmocnienie, ogranicz liczbę cykli wzmacniania do 28-30.</li>
	<li>Sekwencjonowanie i analiza<ol>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie Sangera uzyskanych fragmentów PCR (krok 5.4).</li>
		<li>Analiza wyników sekwencjonowania UWAGA: Udana transfekcja skutkuje powstaniem mozaikowych zwierząt, rozpoznawalnych po pojawieniu się dodatkowych sekwencji DNA w pobliżu miejsca przecięcia nukleazy w chromatogramie sekwencjonującym. Korzystaj z narzędzi obliczeniowych, takich jak EditCo ICE Analysis czy TIDE13 , aby zidentyfikować i ilościowo określić indele w genomie.<ol>
			<li>Aby użyć analizy ICE, wystarczy przesłać uzyskane pliki sekwencjonowania Sangera (plik kontrolny .ab1 dla sekwencji produktu PCR myszy bez edycji oraz plik .ab1 eksperymentu dla sekwencji produktu PCR z myszy eksperymentu), wpisać sekwencję RNA prowadzącą i wybrać nukleazę użytą w eksperymencie CRISPR. UWAGA: Narzędzie ICE Analysis oblicza ogólną efektywność edycji oraz określa profile i względne liczebności wszystkich różnych typów edycji obecnych w próbce.</li>
			<li>Aby użyć TIDE, wprowadź sekwencję RNA prowadzącą, prześlij uzyskane pliki sekwencjonowania Sangera (plik .ab1 dla sekwencji produktu PCR wt mouse bez edycji oraz plik eksperymentalny .ab1 dla sekwencji produktu PCR eksperymentalnej) i sprawdź parametry (w niektórych przypadkach zaawansowane ustawienia pomagają znaleźć indele większe niż 10 bp).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Efektywność generowania myszy nokautujących metodą I-GONAD jest porównywalna z tradycyjną techniką mikroiniekcji. Tradycyjne metody polegają jednak na izolowaniu zygot od samic dawcy, wykonywaniu mikrozastrzyków oraz przeszczepianiu zarodków do jajowódów pseudo-ciężarnych samic. Dla kontrastu, metoda I-GONAD upraszcza ten proces, dostarczając komponenty edytujące genom bezpośrednio do jajowódów u ciężarnych samic, eliminując potrzebę izolacji i przeszczepu zygot. Przedstawiony protokół podkreśla skuteczność metody I-GONA...

Zrozumienie genetycznych podstaw chorób jest kluczowe dla identyfikacji molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ich etiologii i patogenezy. Kluczowym etapem tych badań jest opracowanie modeli zwierzęcych z celowanymi knockoutami genowymi, które symulują ludzkie choroby. Myszy są szczególnie cenne w tych badaniach ze względu na ogólne podobieństwo genomowe do ludzi, niewielki rozmiar, krótką długość życia i wysoką płodność. Modele myszy są ważne zarówno dla badań podstawowych, jak i testów przedklinicznych:1.
Aby stworzyć mysz nokautową za pomocą systemu CRISPR-Cas9, badacze zazwyczaj wstrzykują kompleks przewodnika RNA i nukleazy Cas9 do zygoty, powodując podwójne pęknięcie w docelowym DNA i tym samym aktywując system naprawczy komórki, powodując mutację w miejscu pęknięcia 1,2. Mikrowstrzykiwanie do zygot pozostaje złotym standardem w tym celu. Jednak ta metoda wymaga kilku kroków: izolowania zarodków od samic dawcy, mikrozastrzyków konstrukcji genetycznych w zygoty oraz chirurgicznego przeniesienia ich do jajowódów u kobiet będących pseudo-ciężarną. W związku z tym konieczne jest utrzymanie dużej liczby zwierząt, w tym samic dawców, samców poddanych wazektomii oraz samic w rodzaju pseudo-ciężarnych. Dodatkowo, izolacja zygot wymaga eutanazji samic dawcy. Dlatego preferowane są protokoły minimalizujące wykorzystanie zwierząt, zgodne z zasadami 3R (Zastępowanie, Redukcja, Udoskonalanie)3.
Postępy w technologii elektroporacji, takie jak zastosowanie systemu Nepa21, dają wyjątkową możliwość generowania ukierunkowanych myszy z eliminacją genu w jednym kroku, stosując technikę znaną jako ulepszona edycja genomu za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych (I-GONAD)4. Super Electroporator NEPA21 Type II wykorzystuje 4-stopniowy wieloimpulsowy system elektroporacji, zapewniający wysoką wydajność elektroporacji przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności zarodków. I-GONAD polega na mikrowstrzyknięciu składników CRISPR-Cas (białka Cas9 (500-600 ng/μl) i przewodnika RNA (80-100 ng/μl)) do jajowódów ciężarnych myszy 0,7 dnia po poczęciu, a następnie elektroporacji in vivo, aby dostarczyć te składniki bezpośrednio do zygot5. Po zabiegu I-GONAD ciężarna mysz rodzi młode z celowanym genem knockoutem 6,7,8. Skuteczność tej metody różni się w zależności od pożądanego celu, ale jest porównywalna ze standardowymi technikami mikroiniekcyjnymi (około 50%)9,10. Dodatkowo, I-GONAD mógłby potencjalnie zostać przystosowany do edycji genomu u innych gatunków.
W tym artykule przedstawiono krok po kroku protokół wdrażania metody I-GONAD do generowania myszy knockout. Na przykład jego skuteczność wykazano poprzez celowanie w locus genomu ROSA26 na chromosomie myszy 6. To miejsce zostało wybrane, ponieważ podlega transkrypcji konstytutywnej bez dalszej translacji. Dlatego wprowadzenie mutacji w tym miejscu raczej nie wpłynie negatywnie na zdrowie powstałych młodych.

<table><tbody><tr><td>0,5 i zarytka; 5 uL pipetek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>Rurka 1,5 mL</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 uL pipetki&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Lampa 200 uL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 uL pipetki&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 uL pipetki&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x żelowy barwnik do ładowania</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I, wolna od RNazy (1 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dNTP, rozwiązanie 100 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA DreamTaq Green (5 U/&mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana sól fizjologiczna z buforem fosforanowym</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Analiza ICE w EditCo</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>dostęp 04.06.2025</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA 0,5M, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892,0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>dostęp 09.06.2025</td></tr><tr><td>Bromek etidy</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>Krople żelowe do oczu" Oftagel"</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>System dokumentowania żelu ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>In-Silico PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&nbsp; dostęp 09.06.2025</td></tr><tr><td>Zintegrowane technologie DNA&nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>dostęp 09.06.2025</td></tr><tr><td>Nożyczki mikrochirurgiczne</td><td>Medin URAL</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator NEPA21</td><td>Nepa Gene</td><td>NEPA21</td><td>Z elektrodą CUY652P2,5X4</td></tr><tr><td>Zestaw NTP, rozwiązanie 100 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Evrogen</td><td></td><td>Bezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie odsalania</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane Medium Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>Wersja 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion Wysokowierna polimeraza DNA (2 U/&mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipette 10 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipette 1000 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki Pipette 200 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz " Elf-4"</td><td>Technologia DNA</td><td>PS-400 NOWY</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAse/DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy horyzontalnej SE-1</td><td>Helikon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA Step100</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeter ze stripperem</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do strippera</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>Igła chirurgiczna&nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6& razy; 20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze szawcze</td><td>Medin URAL</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze szawcze</td><td>Medin URAL</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>Nić szycia POLYCON N<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="margin: auto; "/>0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>SYNTHEGO Knockout Guide Design&nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>dostęp 09.06.2025</td></tr><tr><td>Wzmacniacz T100</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T7&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE 10x</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>dostęp 04.06.2025 oraz nbsp;</td></tr><tr><td>Tris chlorowodorek</td><td>Suzhou Yacoo Science</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku trizmy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Białko TrueCut Cas9</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki uniwersalne</td><td>Medin URAL</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Laboratorium Virbac</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Metody tworzenia myszy knockout zazwyczaj obejmują trzy główne etapy: (1) zbieranie zarodków od samic dawców, (2) mikroiniekcje konstruktów genetycznych do zygot ex vivo oraz (3) chirurgiczne przeniesienie ich do jajowodu pseudo-ciężarnych samic. Proces ten wymaga znacznej liczby zwierząt, ponieważ obejmuje nie tylko samice dawcy, ale także samce poddane wazektomii oraz kobiety będące pseudo-ciężarnymi. Ponadto mikroiniekcje do cytoplazmy lub jądra zygot myszy stwarzają wyzwania takie jak zatykanie igieł, problemy z przepuszczalnością błon spowodowane wysoką elastycznością oraz potencjalna śmierć zarodka. Rozwój zaawansowanych elektroporatorów, takich jak Nepa21, daje wyjątkową możliwość generowania myszy z celowanymi knockoutami genowymi w jednym kroku poprzez metodę znaną jako Improved Genome Editing via via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD). Technika ta polega na mikrowstrzyknięciu składników CRISPR-Cas (białka Cas9 i przewodnika RNA) do jajowódów ciężarnych kobiet 0,7 dnia po poczęciu, a następnie elektroporacji in vivo w celu dostarczenia tych składników bezpośrednio do zygot. Po zabiegu I-GONAD ciężarna mysz nosi i rodzi młode z wycelowanym genem. Ten artykuł przedstawia szczegółowy, krok po kroku protokół wdrażania metody I-GONAD u myszy, oferując bardziej efektywną i dostępną alternatywę dla tradycyjnych technik generowania myszy knockout.

Jeśli elektroporacja zakończyła się sukcesem, eksperymentalne myszy: (1) urodziły garstkę młodych, a (2) niektóre zwierzęta będą miały inne indele w genomie. Jeśli startery genotypizujące są dobrze zaprojektowane, a program PCR optymalny, produkt PCR będzie obecny na żelu agarozowym jako jeden przezroczysty pas o pożądanym rozmiarze. Jeśli nukleaza skutecznie przecina docelowe DNA, uzyskane zwierzęta prawdopodobnie będą mozaikowe i będą miały szereg indelów w genomie. Do znalezienia dokładnych indelów w genomie użyto nar...

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

Zakres naszych badań polega na uproszczeniu generowania myszy knockoutowych poprzez zastosowanie elektroporacji in ulot, dostarczając komponenty edycji genomu bezpośrednio do przewodów jajowych u ciężarnych samic. Mikrozastrzyki w zygoty wymagają utrzymania dużej liczby zwierząt, w tym samic dawców i biorców oraz samców poddanych wazektomii. Dlatego preferowane są protokoły minimalizujące korzystanie ze zwierząt.Zastosowanie systemu Nepa21 do elektroporacji zygot daje unikalną możliwość wygenerowania ukierunkowanych myszy z nokautem genu w jednym kroku, z efektywnością porównywalną ze standardowymi technikami opartymi na zastrzykach jądrowych. Na początek użyj narzędzi analizy obliczeniowej do identyfikacji potencjalnych sekwencji RNA prowadzących skierowanych do wybranego genu. Wybierz sekwencje znajdujące się w egzonach tak blisko, jak to możliwe, do pożądanego miejsca mutacji. Użyj przeglądarki genomów do porównania struktury egzomu i priorytetyzacji sekwencji obecnych w większości izoform splicingu.Analizuj przewidywaną aktywność poza celem każdej sekwencji przewodnika, korzystając z zintegrowanego systemu punktacji narzędzia. Wybierz sekwencje, które wykazują najmniejsze prawdopodobieństwo niecelowego wiązania. Aby uzyskać liniowy dwuniciowy szablon DNA, przygotuj główną mieszankę PCR z wykorzystaniem składników określonych w danej tabeli.Dodaj polimerazę na końcu i utrzymuj mieszankę główną na lodzie, aby zachować stabilność enzymatyczną. Następnie przeprowadź PCR w następujących warunkach cyklu termicznego. Następnie przygotuj mieszankę master do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem podanych składników i inkubuj reakcję przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą termocyklera dla stałej kontroli temperatury.Następnie do reakcji dodaj dwa mikrolitry DNazy I. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut, aby strawić szablon DNA, a następnie inaktywuj enzym w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po oczyszczeniu RNA TRIzol należy zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i sprawdzić stosunki A260 do A280 oraz A260 do A230.Aby przygotować kompleks rybonukleoproteinowy do transfekcji, rozcieńcz bufor Tris-HCl z jednego molu do stężenia 100 milimolowych za pomocą wody wolnej od nukleazy. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,022 mikrometra. Rozdzielić porcje po 10 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.Następnie przygotuj mieszankę transfekcyjną z użyciem nukleazy spCas9, pojedynczego RNA prowadzącego oraz Tris-HCl rozcieńczonej wodą DEPC w rurce wolnej od nukleazy. Inkubuj mieszankę transfekcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby umożliwić powstanie kompleksu rybonukleoproteinowego. Następnie aliquot przekształca mieszankę transfekcyjną w małe objętości odpowiednie do pojedynczych sesji I-GONAD i utrzymuj ją przy czterech stopniach Celsjusza, aby zachować aktywność odczynnikową.Po kopulacji samic myszy CD1 z samcami CD1 w jednej nocy sprawdź każdą samicę pod kątem obecności koreka kopulacyjnego. Przenosi się tylko samice z widocznymi korkami do nowej klatki na dalsze eksperymentalne zabiegi. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne ze stali nierdzewnej, aby zapewnić sterylność przed użyciem.Następnie zważ wybrane wtyczki=dodatnie samice myszy na wadze elektronicznej przed znieczuleniem. Monitoruj znieczulone myszy pod kątem utraty odruchu szczypania palców, aby potwierdzić odpowiednią znieczulenie. Połóż mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu.Następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec suchości. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj podłużne nacięcie o szerokości 0,7 centymetra w skórze dolnej części pleców. Następnie rozchyl bocznie lekko otwarte końcówki nożyczek, aby delikatnie przedłużyć nacięcie skórne do około 1,3 centymetra.Następnie ostrożnie wykonaj nacięcie o średnicy 0,7 centymetra w otrzewnej, aby odsłonić jamę brzuszną. Przedłuż nacięcie otrzewne do 1,1 centymetra, przepychając się obustronnie lekko otwartymi końcówkami nożyczek. Znajdź poduszkę tłuszczową połączoną z jajnikiem i delikatnie ją wyciągnij na zewnątrz za pomocą kleszczy, aż odsłonię jajnik, jajowód i macicę.Za pomocą zacisku naczyniowego zabezpiecz poduszkę tłuszczową, aby ustabilizować struktury rozrodcze. Następnie załaduj dwa mikrolitry mieszanki do wstrzykiwania rybonukleoproteiny do jednorazowej plastikowej kapilary za pomocą pipetera do stripera. Za pomocą mikronożyczek wykonaj nacięcie o średnicy 0,2 centymetra w ścianie przewodu jajowego kilka milimetrów powyżej ampuły.Włóż plastikową kapilarę przymocowaną do pipetera do nacięcia w jajowódzie i ostrożnie wydłuż mieszankę do wstrzykiwania, nie wprowadzając powietrza. Delikatnie wyjmij naczyń z jajowodu plastikowego, aby zakończyć wstrzyknięcie. Włącz elektroporator, naciskając przycisk zasilania na przednim panelu.Ustaw parametry elektroporacji na urządzeniu zgodnie z ekranem. Za pomocą elektrod typu pęsetowego delikatnie chwyć jajowód i naciśnij przycisk Kiloohma, aby zmierzyć opór. Bezpośrednio po pomiarze rezystancji naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację i poczekać na pojawienie się sygnału końcowego na przycisku Ohm.Po elektroporacji pierwszego jajowodu delikatnie przywróć drogi rozrodcze do jamy brzusznej. Zamknąć nacięcie za pomocą chirurgicznego szwu z kwasem poliglikolowym 4-0. Do genotypowania zaprojektuj od 18 do 21 długich starterów nukleotydowych o temperaturze topnienia blisko 60 stopni Celsjusza, aby uzyskać produkt PCR par zasad o długości 300–600 par.Aby potwierdzić specyficzność każdego startera, wykonaj wyszukiwanie BLAST w bazie genomu myszy, aby wyeliminować ryzyko niespecyficznego amplifikowania. Następnie, podczas ekstrakcji DNA, za pomocą ciopatki do uszu, pobierz małą próbkę tkanki o wielkości około dwóch milimetrów z ucha myszy. Dodaj 100 mikrolitrów buforu lizy.Inkubuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 60 minut, wykonując wiry co 20 minut, aby zapewnić skuteczną lizę. Po wykonaniu sekwencjonowania Sangera przeanalizuj wyniki, aby ocenić wyniki edycji genomu. Aby użyć analizy ICE, należy przesłać oba pliki sekwencjonowania Sangera, wpisać sekwencję przewodnika RNA i wybrać odpowiednią nukleazę użytą w eksperymencie CRISPR.Następnie, aby użyć TIDE, należy przesłać pliki sterujące i sekwencjonowania eksperymentalne w formacie AB1 i wpisać sekwencję przewodnika RNA. Analiza ICE wykryła trzy różne warianty indel w miejscu cięcia Cas9: usunięcie jednej pary zasad w 42% sekwencji, usunięcie trzech par zasad w 25% sekwencji oraz usunięcie 23 par zasad w 27% sekwencji. Wartość dopasowania modelu wyniosła 0,94, a wynik nokautowy 69, co wskazuje na silną przewidywaną korelację i prawdopodobny nokaut genu.Chromatogramy sekwencyjne potwierdziły zaburzenia w miejscu cięcia Cas9 w edytowanej próbce, podczas gdy chromatogram kontrolny wykazał nienaruszoną sekwencję w tym samym miejscu. Spośród sześciu elektroporanych myszy tylko cztery wydały młode z mutacjami, co daje 60% ogólnej efektywności edycji. Wszystkie mioty wśród sześciu elektroporowanych myszy wykazywały zmniejszoną liczbę szczeniąt, zaledwie trzy do czterech na mysz.

improved-genome-editing-via-oviductal-nucleic-acids-delivery-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę I-GONAD do generowania myszy knockout za pomocą elektroporacji in vivo, która redukuje liczbę zwierząt laboratoryjnych przy zachowaniu wysokiej efektywności edycji genomu.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Przeglądaj więcej filmów