Wzmacnianie technologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych receptora antygenu chimerycznego (CAR-EV): przyszłość terapii nowotworów

Nasze badania koncentrują się na rozwoju diagnostyki i terapii opartej na egzosomach. Celem jest opracowanie terapii opartych na egzosomach chimerycznych receptorów antygenowych, które są bezpieczniejsze, skuteczniejsze i bardziej dostępne niż terapie komórkowe, w leczeniu nowotworów bocznych. Nasze platformy EXO-NET i EXO-ACE umożliwiają skalowalną, powtarzalną i zgodną z GMP izolację egzosomów o wysokiej wydajności i czystości, rozwiązując ograniczenia tradycyjnych metod badawczych i terapeutycznych.

EXO_NET net i EXO-ACE umożliwiają szybką, skalowalną i zgodną z GMP izolację pojazdów elektrycznych, o doskonałej czystości i odtwarzalności, przewyższając wirowanie i wytrącanie w zastosowaniach badawczych, diagnostycznych i terapeutycznych. Opracowaliśmy szybką, skalowalną i zweryfikowaną metodę projektowania pojazdów autonomicznych i dostarczania celowanych terapii nowej generacji, bezkomórkowych. Zapewnia to solidny przepływ pracy, który można zastosować do innych stanów chorobowych, w których istnieje potrzeba kliniczna.

Naszym kolejnym celem jest wykorzystanie opracowanych i zwalidowanych przez nas metod do generowania CAR-EV do dostarczania terapii RNA do leczenia guzów litych i innych chorób zapalnych. Na początek doprowadź kolumnę jonowymienną do temperatury pokojowej, pozwalając jej stać pionowo przez 15 minut. Za pomocą pipety dodać 10 objętości kolumn buforu regeneracyjnego, a następnie 10 objętości kolumn buforu równoważącego.

Przepuścić pożywkę kondycjonowaną przez THOD przez filtr polieterosulfonowy o średnicy 0,22 mikrometra. Teraz dodaj do 31,2 objętości kolumny przefiltrowanej próbki do kolumny zrównoważonej. Następnie dodać 10 objętości kolumn buforu płuczącego, a następnie 2,5 objętości kolumny buforu elucyjnego.

Zbierz przepływ zawierający wzbogacone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Używając filtrów odśrodkowych do ultrafiltracji o mocy 30 kilodaltonów i rozcieńczalnika, należy przeprowadzić wymianę buforu na eluowanym pęcherzyku zewnątrzkomórkowym, zapewniając co najmniej 100-krotne rozcieńczenie. Dostosuj końcową objętość wymienianego roztworu w oparciu o potrzeby eksperymentalne.

Przełóż wzbogaconą próbkę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez filtr 0,22 mikrometra, aby wysterylizować ją do testów in vitro. Określ rozkład wielkości, stężenie i wydajność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych CAR za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. W celu uzyskania wysokoprzepustowej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pan-egzosomu włącz i zaloguj się do urządzenia.

Skonfiguruj ustawienia, aby ustanowić protokół izolacji białka HT EV. Przygotuj płytkę grzebieniową z końcówką, umieszczając grzebień z końcówką w 96-dołkowej płytce z głęboką studzienką. Dodaj jeden mililitr PBS do każdej studzienki, aby przygotować trzy płytki myjące.

Teraz przygotuj płytkę elucyjną, pipetując 35 mikrolitrów 1% buforu SDS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie przygotuj płytkę wiążącą, dodając jeden mililitr kondycjonowanej pożywki. W automatycznym systemie izolacji rozpocznij protokół, wybierając program HT EV Protein Isolation Protocol, a następnie wybierz przycisk odtwarzania.

Otwórz instrument, aby rozpocząć ładowanie płyt. Postępuj zgodnie z instrukcjami instrumentu i załaduj przygotowane płytki elucyjne, a następnie płytki z trzema głębokimi płuczkami do instrumentu. Tuż przed załadowaniem płytki wiążącej dodaj 30 mikrolitrów kulek wychwytujących pan-egzosomy do każdej studzienki.

Załaduj płytkę wiążącą do instrumentu, a następnie załaduj płytkę grzebieniową końcówki i zamknij instrument, aby rozpocząć wiązanie. System będzie mieszał kondycjonowaną pożywkę próbkę i kulki magnetyczne w sposób ciągły z niską prędkością przez 30 minut, ułatwiając skuteczne wychwytywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Po zakończeniu etapu wiązania pozwól systemowi wykonać trzy etapy mycia, mieszając z niską prędkością przez 30 sekund w celu usunięcia niespecyficznych zanieczyszczeń.

Pozwól zautomatyzowanemu systemowi zainicjować lizę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu odzyskania białka, wykonując 30-sekundową mieszankę dolną. Podczas inkubacji urządzenie zatrzyma się na siedem minut i 30 sekund, utrzymując końcówki pipet umieszczone nad każdym dołkiem. Zainicjuj kolejne 30=sekundowe mieszanie, po którym następuje kolejna siedmiominutowa i 30-sekundowa pauza.

Po zakończeniu protokołu system podniesie zużyty grzebień z końcówką, pozostawiając roztwór w 96-dołkowej płytce i kulkach magnetycznych przymocowanych do końcówek. Na koniec instrument przejdzie do etapu opuszczania, wkładając grzebień końcówki do płytki grzebieniowej końcówki. Otwórz instrument i wyjmij płytki.

Fluorescencja GFP potwierdziła ekspresję CAR w transdukowanych limfocytach T, z lokalizacją widoczną w klastrach komórkowych i kolokalizacją zweryfikowaną przez nałożenie kanałów jasnego pola i GFP. Analiza śledzenia nanocząstek wykazała znacznie wyższe stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we wzbogaconej frakcji EV w porównaniu z kondycjonowanymi pożywkami zarówno dla konstruktów EGFR, jak i HER2 CAR. Western blot potwierdził obecność granzymu B w komórkach wykazujących ekspresję CAR oraz w izolowanych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, przy czym w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych nie było kalneksyny, co wskazuje na brak zanieczyszczenia komórkowego.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe CAR ukierunkowane na EGFR znacznie zmniejszyły żywotność komórek raka piersi MCF-7 o 70%, a żywotność komórek raka krwi K-562 o 40%Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ukierunkowane na HER2 wykazały około 10% zmniejszenie żywotności komórek raka piersi MCF-7, nie mając zauważalnego wpływu na komórki raka krwi K-562.