Name: Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania komórek nowotworowych na komórki dendrytyczne cDC1 in vivo w mysim modelu. Ta technika immunoterapii przekształca zimne guzy w gorące, wzmacniając odpowiedź przeciwnowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marianie Lopes i Camille Chatelain, członkiniom Laboratorium Przeprogramowania Komórek w Hematopoezie i Odporności, za redakcję i korektę manuskryptu.
Badanie to zostało przeprowadzone w ramach Narodowej Szkoły Badawczej ATMP finansowanej przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych. Omawiane projekty były współfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (866448-TrojanDC i 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), Europejską Radę ds. Innowacji (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2020-00615), Szwedzką Agencję ds. Innowacji (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) oraz Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). Fundacja Knuta i Alice Wallenbergów, Wydział Medyczny Uniwersytetu w Lund oraz Region Skanii są wdzięczni za hojne wsparcie finansowe.
Dostępne materiały:
Konstrukty i wektory wykorzystywane do przeprogramowania są dostępne w Asgard Therapeutics na podstawie umowy o transferze materiałów zawartej z tą spółką. Wszystkie inne dane potrzebne do oceny wniosków zawartych w artykule znajdują się w tekście głównym lub materiałach uzupełniających.

<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).</li>
<li>Adams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+monotherapy+for+previously+untreated%2C+PD-L1-positive%2C+metastatic+triple-negative+breast+cancer%3A+cohort+B+of+the+phase+II+KEYNOTE-086+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study.</a> Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
<li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+3+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+nivolumab+vs+bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%3A+CheckMate+143%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143.</a> Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+orchestrators+of+anticancer+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).</li>
<li>Heras-Murillo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+with+conventional+type-1+dendritic+cells+induces+immune+memory+and+limits+tumor+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse.</a> Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).</li>
<li>Theisen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDFY4+is+required+for+cross-presentation+in+response+to+viral+and+tumor+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens.</a> Science. 362 (6415), 694-699 (2018).</li>
<li>Meiser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+stimulatory+cDC1+subpopulation+amplifies+CD8%2B+T+cell+responses+in+tumors+for+protective+anti-cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity.</a> Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).</li>
<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
<li>Balan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+human+dendritic+cell+differentiation+revealing+Notch-dependent+lineage+bifurcation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity.</a> Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).</li>
<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
<li>Zimmermannova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+tumor+immunogenicity+with+dendritic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming.</a> Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).</li>
<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+primary+human+fibroblasts+with+only+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).</li>
<li>Rojas, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+RNA+neoantigen+vaccines+stimulate+T+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer.</a> Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).</li>
<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+lymphoid+structures+improve+immunotherapy+and+survival+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.</a> Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+endogenous+retroviruses+promote+lung+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy.</a> Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).</li>
</ol>

C.-F.P. posiada udziały w kapitale zakładowym i zajmuje stanowiska kierownicze w firmie Asgard Therapeutics AB, która opracowuje immunoterapie nowotworów w oparciu o technologie przeprogramowania in vivo DC. C.-F.P jest wynalazcą przyznanych patentów US 11,345,891, JP 7303743 i CN ZL201880005047.3 oraz zgłoszeń patentowych WO 2018/185709 i WO 2022/243448 (wraz z E.A.) należących do Asgard Therapeutics, które obejmują opisane tutaj podejście do przeprogramowania komórek.

W tym protokole opisujemy wykonalną metodę generowania komórek podobnych do cDC1 w oparciu o przeprogramowanie in vivo komórek rakowych z guzów litych. Nasze wyniki pokazują, że nadekspresja PU.1, IRF8 i BATF3 napędza stopniowe nabywanie fenotypu cDC1 w TME do 9 dnia, po czym komórki podobne do cDC1 są zubożone z guzów. Ostatecznie prowadzi to do wzrostu infiltracji komórek CD45 do TME do 3 dnia, powodując przebudowę "immunologicznie zimnego" TME na "immunologicznie gorący".
Obecne protokoły generowania cDC1 obejmują wzbogacanie autologicznych DC z krwi obwodowej, różnicowanie z hematopoetycznymi komórkami progenitorowymi CD34 + lub różnicowanie z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi 14,15,16,17,18,19. Jednak metody te mają czynniki ograniczające: niewystarczające dojrzewanie, zmniejszoną prezentację antygenu i zdolność do produkcji cytokin/chemokin in vivo, podatność na immunosupresję, wysoką heterogeniczność DC i małą liczbę generowanych komórek7. W tym miejscu udostępniamy protokół, który umożliwia skalowalne generowanie komórek podobnych do cDC1 in vivo do badań funkcjonalnych i mechanistycznych.
Za pomocą tej metody sprawdziliśmy, czy ekspresja kombinacji czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3 była wystarczająca do przeprowadzenia przeprogramowania in vivo . Protokół ten umożliwia precyzyjną kontrolę nad efektywnością podawania, ponieważ zmiana dawki wszczepianych komórek zmodyfikowanych genetycznie bezpośrednio wpływa na skuteczność leczenia. Wcześniej wykazaliśmy, że 2% transdukowanych komórek, które odpowiadają 0,15% komórek podobnych do CD45 + i MHC-II + cDC1, jest wystarczające do wywołania odporności przeciwnowotworowej20. Co więcej, szybka infiltracja immunologiczna obserwowana w dniu 3 sugeruje, że częściowo przeprogramowane komórki podobne do cDC1 są funkcjonalnie aktywne in vivo, ponieważ w tym momencie nie ma znacznego wzrostu w pełni przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1. W przyszłości interesujące będzie odkrycie funkcjonalnej roli częściowo i w pełni przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1 w skuteczności przeciwnowotworowej przy użyciu zmodyfikowanych wektorów zawierających gen samobójczy w celu wywołania śmierci komórki w wybranych populacjach komórek w określonych punktach czasowych24. Protokół ten może być dalej wykorzystywany do badania kombinacji z adiuwantami epigenetycznymi, które mogą zwiększyć wydajność przeprogramowywania25. Wreszcie, metodę tę można również zaadaptować do generowania innych podtypów DC in vivo, uruchamiając różne typy odpowiedzi immunologicznych, na przykład odpowiedzi przeciwwirusowe lub tolerogenne14. Ponadto możemy wykorzystać przeprogramowanie in vivo jako platformę do wykonywania badań przesiewowych z kodami kreskowymi dla kombinacji czynników transkrypcyjnych w celu wygenerowania różnych typów komórek odpornościowych. Możliwość ta może zwiększyć elastyczność leczenia poprzez wykorzystanie różnorodnych właściwości funkcjonalnych określonych podzbiorów immunologicznych.
W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że immunosupresyjne środowisko in vivo nie utrudnia przeprogramowania ludzkich komórek nowotworowych w immunogenne cDC120. W tym artykule pokazujemy, że u myszy przeprogramowanie jest szybsze i wydajniejsze in vivo niż in vitro, co sugeruje, że zwiększone przeprogramowanie obserwowane in vivo jest zjawiskiem konserwatywnym u obu gatunków. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest brak środowiska in vivo podczas początkowego dostarczania wektora; W związku z tym nie jest w stanie stwierdzić, czy sygnały środowiskowe wpływają na wydajność dostarczania in vivo. Należy to ustalić in situ, porównując różne cząstki. Wektory adenowirusowe, które zidentyfikowaliśmy jako bardziej wydajne niż wektory lentiwirusowe do dostarczania in situ 20, można porównać z ugrupowaniami niewirusowymi, takimi jak liniowe, kołowe i samowzmacniające się RNA lub koktajle małocząsteczkowe2 6,27.
Wcześniej wykazaliśmy, że przeprogramowanie cDC1 wyposaża komórki rakowe w cytokiny prozapalne i wydzielanie chemokiny rekrutujące limfocyty oraz profesjonalne przetwarzanie i prezentację antygenów na MHC-I i MHC-II w modelach czerniaka23,28. Powoduje to przebudowę TME ze stanu "immunologiczno-zimnego" do "immunologicznie gorącego" poprzez indukowanie tworzenia TLS, co zwiększa infiltrację cytotoksycznych efektorowych limfocytów T, komórek NK i limfocytów B oraz zmniejsza populacje immunosupresyjne, takie jak regulatorowe i wyczerpane limfocyty T20. U pacjentów pozytywne odpowiedzi na immunoterapię zostały powiązane z obecnością TLS w guzach, w których utrzymujące się pobudzanie komórek T i B przeciwko antygenom nowotworowym generuje odpowiedzi przeciwciał specyficzne dla nowotworu29,30. W przyszłości przewidujemy zastosowanie tego wykonalnego protokołu przeprogramowania cDC1 in vivo do rozwikłania mechanizmów indukowanej neogenezy TLS, przebudowy TME i odporności przeciwnowotworowej w różnych typach nowotworów oraz scharakteryzowania, czy stymulowana jest produkcja przeciwciał specyficznych dla nowotworu.
Wcześniej zaobserwowaliśmy synergizm między przeprogramowaniem in vivo cDC1 a ICB z anty-PD-1 lub anty-CTLA-420. Sugeruje to, że "immunologicznie gorący" TME stworzony przez przeprogramowanie cDC1 może stanowić korzystne środowisko dla możliwych kombinacji z innymi immunoterapiami, takimi jak ACT, w tym receptorem limfocytów T (TCR)-T, chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR)-T lub limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL). Kolejną zaletą tej metody jest możliwość wykonywania dużych, bezstronnych badań kombinatorycznych lub CRISPR, w których receptory immunologiczne, cytokiny, chemokiny lub limfotoksyny mogą ulegać nadekspresji lub zubożeniu w komórkach podobnych do cDC1 w opornych typach nowotworów, odkrywając w ten sposób rolę odrębnych szlaków we wzmacnianiu odporności za pośrednictwem cDC1. Podsumowując, obecny protokół stanowi cenne źródło informacji dla szerokiej społeczności naukowej, ponieważ przeprogramowanie cDC1 in vivo jest elastyczną i potężną platformą do badań mechanistycznych i innowacji terapeutycznych w immunoterapii nowotworów.

Ostatnie postępy w metodach immunoterapii nowotworów, w tym blokada immunologicznego punktu kontrolnego (ICB), adoptywna terapia komórkowa (ACT) i szczepionki, zmieniły krajobraz leczenia raka1. W czerniaku wskaźniki odpowiedzi na hamowanie białka programowanej śmierci komórki 1 (PD-1) i cytotoksycznego białka związanego z limfocytami T 4 (CTLA-4) mogą sięgać nawet 60%2. Niemniej jednak ponad 40% pacjentów z czerniakiem nie reaguje na ICB, a wskaźniki odpowiedzi w mniej immunogennych nowotworach, takich jak rak piersi, stabilny mikrosatelitarnie rak jelita grubego i glejak, pozostają poniżej 5%, co wskazuje na luki kliniczne 3,4,5. Główną przeszkodą na drodze do szerokiego sukcesu klinicznego jest słaba aktywacja odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, która zależy od skutecznej prezentacji antygenu w mikrośrodowisku guza (TME)6.
Konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1 (cDC1) są rzadkie, ale niezbędne do zainicjowania odporności specyficznej dla nowotworu, oferując trzy kluczowe sygnały do głównych odpowiedzi limfocytów T: (1) profesjonalne przetwarzanie i prezentacja antygenów na głównych kompleksach zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II, (2) kostymulacja przez CD80 i CD86 oraz (3) sygnalizacja cytokin prozapalnych, w tym IL-12 7,8. Wśród podzbiorów komórek dendrytycznych (DC), cDC1 przodują w krzyżowej prezentacji antygenów związanych z komórkami nowotworowymi w celu przygotowania naiwnych lub reaktywacji limfocytów T pamięci CD8 + lub napędzania różnicowania limfocytów T CD4 + do komórek pomocniczych T typu 1 (TH1)9. Dodatkowo, cDC1 są głównymi producentami chemokin, ligandów chemokiny motywu C-X-C 9 i 10 (CXCL9 / 10), które pośredniczą w rekrutacji limfocytów T do tkanki nowotworowej 10,11,12,13. W ciągu ostatnich kilku lat liczne badania wykazały, że odrzucenie guza i skuteczne odpowiedzi na ICB lub ACT silnie korelują z obecnością wewnątrznowotworowych cDC112,13. W związku z tym cDC1 stały się atrakcyjnym celem immunoterapii nowotworów, a skuteczne wykorzystanie ich unikalnych cech może mieć znaczny potencjał translacyjny.
Obecne metody generowania cDC1 opierają się na izolacji krwi lub różnicowaniu od progenitorów CD34+ lub pluripotencjalnych komórek macierzystych 14,15,16. Dominujące strategie kliniczne polegają na wyizolowaniu mieszaniny autologicznych podzbiorów DC z krwi i stymulowaniu ich ex vivo za pomocą agonistów receptorów toll-podobnych lub cytokin prozapalnych w celu wywołania dojrzałego, immunogennego programu przed reinfuzją16. Jednak strategie te są ograniczone przez słabe dojrzewanie komórek, bariery immunosupresyjne w TME i niejednorodność podzbioru w infuzji mieszaniny DC, w której obecna jest tylko niewielka część cDC17. Co więcej, wyizolowanie tylko cDC1 do immunoterapii nowotworów lub szczepienia jest wyzwaniem ze względu na ich wyjątkowo niską liczebność we krwi obwodowej (<0,3%)16. Dodatkowo cDC1 mogą być wytwarzane z komórek progenitorowych CD34 + lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą cytokin i sygnalizacji NOTCH. Jednak metody te wymagają złożonych i długich protokołów oraz dają niską liczbę i niejednorodne populacje podzbiorów DC 17,18,19.
Aby zaradzić tym ograniczeniom, przeprogramowanie in vivo zapewnia odpowiednią strategię immunoterapii nowotworów w celu wygenerowania komórek podobnych do cDC1, które przypominają właściwości fenotypowe, transkrypcyjne i funkcjonalne cDC1s20. Poprzez nadekspresję specyficznej dla cDC1 minimalnej sieci regulacyjnej genów - PU.1, IRF8 i BATF3 (zbiorczo określanych jako PIB) - fibroblasty, komórki zrębu i komórki rakowe zostały stopniowo przeprogramowane w komórki podobne do cDC1, umożliwiając przetwarzanie antygenu nowotworowego i prezentację na MHC klasy I i II, sygnalizację kostymulującą przez CD80 i CD86 oraz wydzielanie cytokin/chemokin, w tym CXCL9/10 i IL-1220, 21,22,23. Przeprogramowanie cDC1 postępowało szybciej i wydajniej w ludzkich ksenoprzeszczepach in vivo i niezależnie od immunosupresji, generując komórki podobne do cDC1 z dojrzałą sygnaturą immunogenną20. W syngenicznych guzach czerniaka zaobserwowaliśmy, że komórki podobne do cDC1 przebudowały swoje TME, indukowały tworzenie trzeciorzędowej struktury limfoidalnej (TLS) oraz rekrutowały i ekspandowały poliklonalne limfocyty TH1 i cytotoksyczne limfocyty T pamięci, prowadząc do długotrwałej odporności ogólnoustrojowej20. Wreszcie, opracowaliśmy nowatorską metodę immunoterapii nowotworów opartą na przeprogramowaniu in situ komórek rakowych w komórki podobne do cDC1 poprzez wstrzyknięcie do guza wektorów adenowirusowych20. Odkrycia te torują drogę do klinicznego przeprogramowania cDC1 jako nowej metody immunoterapii nowotworów, która może wykorzystać funkcjonalne właściwości cDC1.
W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół generowania komórek podobnych do cDC1 w TME w oparciu o przeprogramowanie cDC1 in vivo . Lentiwirusowe dostarczanie PIB do komórek nowotworowych, a następnie implantacja jako zdefiniowana mieszanina transdukowanych komórek nowotworowych z nietransdukowanymi macierzystymi komórkami nowotworowymi pozwala na przeprogramowanie in vivo kontrolowanej frakcji komórek nowotworowych w TME. Ponadto metoda ta nie jest ograniczona przez skuteczność dostarczania wektorów wirusowych in situ 20. Przedstawiamy kroki w celu wydajnej produkcji wektorów lentiwirusowych, miareczkowania funkcjonalnego i przeprogramowania cDC1 in vivo na przykładzie modelu czerniaka syngenicznego, YUMM1.7. Szczegółowo opisujemy konfigurację eksperymentalną i strategię bramkowania do analizy in vivo przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1 za pomocą cytometrii przepływowej po dysocjacji guza. Zapewniamy również kroki do oceny zmian w TME poprzez wykonanie krioprezerwacji, sekcji i barwienia immunofluorescencyjnego skrawków guza, a następnie mikroskopii konfokalnej. Na koniec zajmiemy się tym, jak monitorować odporność indukowaną przez cDC1, mierząc wzrost i przeżycie guza. To wykonalne i skalowalne podejście oferuje naukowcom cenne narzędzie do oceny strategii leczenia skojarzonego z przeprogramowaniem cDC1 in vivo , do scharakteryzowania zmian w neogenezie TME i TLS w modelach nowotworowych lub do przeprowadzenia dużych badań przesiewowych modyfikujących ekspresję różnych szlaków immunologicznych, na przykład prezentacji antygenu lub wydzielania cytokin/chemokin, oraz do zbadania ich wpływu na odporność przeciwnowotworową.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m niskobiałkowy filtr wiążący, 150 ml filtr próżniowy do butelki</td><td>Fisher naukowy</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol 50 mM</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-mysie CD45 (klon: 30-F11), szczurze IgG2b i kappa;</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Klasa B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki do insuliny BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Sitko Corning Falcon Cell do użytku z probówkami stożkowymi o pojemności 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe Corning 24 x 50 mm&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Roztwór do odzyskiwania antygenu IHC - niskie pH (10x)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFP [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM/Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Średni</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, poliklonalne, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HEK 293T</td><td>ATTC (Kontroler Nadzoru)</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny (Polybrene)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicylina Streptomycyna 100x roztwór (długopis/paciorkowiec)</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS)</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol weterynarz. Roztwór do wstrzykiwań 100 mg/ml</td><td>MSD Zdrowie Zwierząt Szwecja</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomowe - C35</td><td>Medyczne zarządzanie finansami publicznymi (PFM</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-CD45.2 (104), Surface, APC, monoklonalna</td><td>Legenda biologiczna</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>Mysi anty-MHCII (M5/114.15.2), Powierzchniowy, PE-Cy7, Monoklonalny</td><td>Legenda biologiczna</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td><td>Księga Abcam</td><td>ab7481 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica szczura (sterylna)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab7488 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki polipropylenowe z otwartą górą</td><td>Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., bez metanolu</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>043368.9 mln</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Batf3</td><td>Addgene powiedział:</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Irf8</td><td>Addgene powiedział:</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Pu.1</td><td>Addgene powiedział:</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pMD2.G</td><td>Addgene powiedział:</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid psPAX2</td><td>Addgene powiedział:</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid SFFV-eGFP (eGFP)</td><td>Klonowanie w domu</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>Klonowanie w domu</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid SFFV-PIB-eGFP,&nbsp; policytroniczna mysz kodująca kasetę PU.1, IRF8 i BATF3 (PIB)&nbsp;</td><td>Klonowanie w domu</td><td>-</td><td>Konstrukty i wektory wykorzystywane do przeprogramowania są dostępne w Asgard Therapeutics na podstawie umowy o transferze materiałów zawartej z firmą</td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI), Liniowa, MW 25000, Stopień transfekcji</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes Długopis do badania z hydrofobową barierą</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>Czynnik R3777</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S7903</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus Adhesion</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x) bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermediate, kwadratowy (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Xysol weterynarz. Roztwór do wstrzykiwań 20 mg/ml</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa YUMM1.7</td><td>Antineo (antyneo)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

Skuteczność immunoterapii nowotworów zależy od rekrutacji i aktywacji odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T przeciwko guzom litym przez konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1 (cDC1). Jednak wytwarzanie cDC1 do immunoterapii nowotworów napotyka na znaczne ograniczenia, w tym słabą wydajność komórek, niejednorodność funkcjonalną i podatność na immunosupresję w mikrośrodowisku guza (TME). Niedawno opracowaliśmy metodę immunoterapii opartą na przeprogramowaniu in vivo komórek nowotworowych na immunogenne komórki podobne do cDC1, co umożliwiło komórkom rakowym prezentowanie antygenów nowotworowych jako cDC1 i wywołało poliklonalne odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T oraz trwałą ogólnoustrojową odporność przeciwnowotworową. W tym miejscu opisujemy praktyczny protokół generowania komórek podobnych do cDC1 w TME poprzez nadekspresję minimalnej sieci regulacyjnej genu specyficznej dla cDC1 - PU.1, IRF8 i BATF3 (łącznie określanych jako PIB) - w komórkach nowotworowych, a następnie podskórne wszczepienie mieszaniny komórek transdukowanych i rodzicielskich. Nadekspresja PIB napędza stopniowe nabywanie markera krwiotwórczego CD45 i profesjonalnego kompleksu prezentacji antygenu MHC klasy II na komórkach nowotworowych, służąc jako odczyty powierzchni komórek do przeprogramowania cDC1 in vivo . W porównaniu z procesem przeprogramowania in vitro, przeprogramowanie mysiego modelu czerniaka YUMM1.7 in vivo wykazało szybszą kinetykę i wyższą skuteczność. Komórki podobne do cDC1 indukowały szybką przebudowę TME poprzez rekrutację komórek odpornościowych gospodarza w ciągu pierwszych 3 dni i prowadząc do powstania trzeciorzędowej struktury limfatycznej do 9 dnia. Przeprogramowane komórki podobne do cDC1 utrzymywały się w guzach przez co najmniej 9 dni, ale nie zostały wykryte w 15 dniu. Opisany tutaj protokół przeprogramowania cDC1 in vivo zapewnia wykonalną i solidną metodę skutecznego przekształcania "zimno-immunologicznych" guzów w "immunologicznie gorące". Ogólnie rzecz biorąc, stanowi on potężną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw odporności przeciwnowotworowej za pośrednictwem cDC1 i odkrywania synergicznych kombinacji z innymi metodami immunoterapii nowotworów.

Schematyczny przegląd wykonalnego protokołu przeprogramowania in vivo przedstawiono na rysunku 1. Najpierw wyprodukowaliśmy policistroniczny wektor lentiwirusowy SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), kodujący czynniki przeprogramowujące instruujące cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, a następnie wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES) i wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) w linii komórkowej pakowania HEK 293T. Aby kontrolować immunogenność za pośrednictwem lentiwirusa, wyprodukowaliśmy pusty wektor SFFV-MCS-eGFP (eGFP), zawierający wiele miejsc klonowania (MCS) i IRES-eGFP, ale z wyłączeniem czynników przeprogramowujących. Po wyprodukowaniu wirusa zebraliśmy supernatant zawierający lentiwirusa i zagęściliśmy go przez ultrawirowanie. Funkcjonalnie miareczkowaliśmy wirusa, aby określić ilość wymaganą do osiągnięcia stosunku 1: 1 komórek transdukowanych (eGFP+) do nietransdukowanych (eGFP-), które oceniliśmy w 3 dniu po transdukcji. Następnie wykorzystaliśmy otrzymaną ilość wirusa do transdukcji wybranej linii komórek rakowych w dniu -1. Po 24 godzinach pobraliśmy komórki i wszczepiliśmy je podskórnie w celu ustalenia guzów. Strategia ta zapewniła, że transdukowane komórki zostały przeprogramowane na komórki podobne do cDC1 in vivo, w TME. We wskazanych punktach czasowych po wszczepieniu wycięliśmy i przetworzyliśmy guzy do dalszych analiz, w tym cytometrii przepływowej zdysocjowanych komórek nowotworowych, w celu ilościowego określenia skuteczności przeprogramowania in vivo lub barwienia immunofluorescencyjnego kriokonserwowanych skrawków guza w celu scharakteryzowania zmian w TME.
Po pierwsze, aby zapewnić produkcję wysokich mian lentiwirusowych, monitorowaliśmy komórki HEK 293T przed transfekcją, dążąc do osiągnięcia 70-80% konfluencji, a 24 godziny później oceniliśmy skuteczność transfekcji poprzez ekspresję eGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Figura 2A). Następnie zebraliśmy pożywkę zawierającą wirusa 48 godzin i 60 godzin po transfekcji, ultraodwirowaliśmy ją i przechowywaliśmy w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C (ryc. 2B). Następnie określiliśmy optymalną ilość wirusa wymaganą do osiągnięcia stosunku 1:1 komórek eGFP+ do eGFP- w komórkach czerniaka YUMM1.7. Wysialiśmy 105 komórek YUMM1,7 na studzienkę na 6-dołkowej płytce, transdukowaliśmy komórki zwiększającymi się objętościami lentiwirusa i zastąpiliśmy supernatant zawierający wirusa świeżą kompletną pożywką DMEM / F12 po 24 godzinach (Figura 2C). W dniu 3 oceniliśmy ekspresję eGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zanim przystąpiliśmy do ilościowego określenia dokładnej procentowej zawartości komórek eGFP + za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 2C). Aby określić ilościowo stosunek komórek eGFP+ do eGFP- , przeprowadziliśmy bramkowanie w żywych, pojedynczych komórkach, aby wykluczyć martwe komórki i dublety (ryc. 2D). Optymalna objętość wyprodukowanej partii lentiwirusa została określona zarówno dla PIB-eGFP, jak i kontrolnego wirusa eGFP jako 2 μl na 105 komórek YUMM1,7, co daje odpowiednio 50,0 ± 0,3% i 63,0 ± 0,9% komórek eGFP+ (ryc. 2E).
Następnie, aby ocenić skuteczność przeprogramowania in vivo, wygenerowaliśmy znakowaną fluorescencyjnie (mCherry+) linię komórek nowotworowych (YUMM1.7-mCherry). Zapewniło to, że możemy odróżnić komórki rakowe od komórek zrębowych lub odpornościowych poprzez bramkowanie w żywych komórkach mCherry + w analizie cytometrii przepływowej (ryc. 3A, B). Następnie transdukowaliśmy komórki YUMM1.7-mCherry z 2 μl PIB-eGFP lub kontrolnego wirusa eGFP na 10-5 komórek, aby uzyskać stosunek 1:1 eGFP+ do eGFP-. Wszczepiliśmy podskórnie 1,6 × 106 komórek na guz myszom CD45.1 i zachowaliśmy porcję komórek do hodowli in vitro dla porównania. Oceniliśmy skuteczność przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej, bramkowania żywych komórek mCherry + eGFP + i CD45.1 w celu wykluczenia komórek odpornościowych gospodarza, które pochłonęły eGFP lub mCherry (Figura 3B). Od 1 do 9 dni zaobserwowaliśmy stopniowe nabywanie ekspresji CD45.2 i / lub MHC-II, oznaczając częściowo przeprogramowane komórki podobne do cDC1 (CD45.2 + MHC-II - lub CD45.2 - MHC-II +) i w pełni przeprogramowane komórki podobne do cDC1 (CD45 + MHC-II +) (Figura 3C). Potwierdziliśmy, że przeprogramowanie mysich komórek rakowych in vivo skutkowało wyższym odsetkiem komórek podobnych do cDC1 w dniu 9 w porównaniu z warunkami in vitro (9,54 ± 1,54% CD45 + MHC-II + in vivo w porównaniu z 4,72 ± 1,1 % CD45 + MHC-II + in vitro, P = 0,018). Kinetyka przeprogramowania została również przyspieszona, ponieważ zaobserwowaliśmy wyższy odsetek komórek podobnych do cDC1 już w 4 dniu (8,7 ± 3,3% CD45 + MHC-II + in vivo w porównaniu z 0,3 ± 0,1% CD45 + MHC-II + in vitro, P = 0,05), co wskazuje, że obecność sygnałów środowiskowych sprzyja szybszemu i bardziej wydajnemu przeprogramowaniu w kierunku komórek podobnych do cDC119. Podczas gdy przeprogramowane in vitro komórki podobne do cDC1 były obecne do 15 dnia, komórki podobne do cDC1 in vivo utrzymywały się przez 9 dni, ale nie zostały wykryte do 15 dnia, co sugeruje wyczerpanie TME przez układ odpornościowy gospodarza (Figura 3C).
Na koniec naszym celem było scharakteryzowanie wczesnych zmian w TME w wyniku przeprogramowania cDC1 in vivo w ciągu pierwszych 9 dni. Przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne kriokonserwowanych i wyciętych tkanek nowotworowych zarówno z guzów eGFP, jak i PIB-eGFP po 3 i 9 dniach przeprogramowania in vivo, koncentrując się na infiltracji komórek odpornościowych oznaczonych markerem pan-hematopoetycznym CD45. Warto zauważyć, że komórki podobne do cDC1 rekrutowały znacznie więcej komórek CD45 do TME w 3 dniu, w porównaniu z guzami eGFP (49,6 ± 17,0 w porównaniu z 8,0 ± 5,8 średnia intensywność fluorescencji barwienia CD45 na obszar guza; Rysunek 4A,B). Co ciekawe, wykryliśmy TLS w TME guzów po 9 dniach przeprogramowania in vivo. Sugeruje to, że komórki podobne do cDC1 mogą szybko przemodelować TME z "immunologicznie zimnego" do "immunologicznie gorącego" środowiska w ciągu 3 dni, co następnie prowadzi do powstania TLS w 9 dniu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu generowania komórek podobnych do cDC1 poprzez przeprogramowanie komórek nowotworowych in vivo. Wektory lentiwirusowe SFFV-PIB-IRES-eGFP kodujące PU.1, IRF8 i BATF3 w kasecie policistronicznej pod kontrolą promotora wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV) i eGFP po wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu (IRES) w celu śledzenia transdukowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej - są wytwarzane w linii komórkowej HEK 293T. Następnie wektory lentiwirusowe są ultrawirowane i funkcjonalnie miareczkowane w celu określenia ilości wirusa wymaganej do transdukcji komórek rakowych w stosunku 1:1 transdukowanych eGFP+ do nietransdukowanych komórek eGFP. W przypadku eksperymentów z przeprogramowaniem in vivo, komórki rakowe są posiane optymalną ilością lentiwirusa w dniu -1. Następnego dnia ta mieszanina 1:1 transdukowanych komórek GFP+ i nietransdukowanych komórek GFP jest myta i zbierana w celu podskórnego ustalenia guza u myszy. Równoległe hodowle in vitro są utrzymywane w celu walidacji transdukcji w dniu 3 za pomocą cytometrii przepływowej. Zwierzęta są monitorowane co 2-3 dni pod kątem wzrostu i przeżycia guza. Guzy są zbierane w określonych punktach czasowych, dysocjowane i barwione w celu ekspresji markera powierzchniowego do analizy cytometrii przepływowej. Alternatywnie, całe tkanki są utrwalane, kriokonserwowane i cięte w celu barwienia immunofluorescencyjnego i analizy mikroskopii konfokalnej. Skuteczność przeprogramowania in vivo ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej, natomiast zmiany w mikrośrodowisku guza charakteryzują się obrazowaniem konfokalnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
Ryc. 2: Wytwarzanie i miareczkowanie funkcjonalne lentiwirusa do przeprogramowania cDC1 in vivo.(A) Gdy komórki HEK 293T osiągną konfluencję ~ 70-80%, są transfekowane mieszaniną zawierającą 10 μg plazmidu transferowego SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) lub pustego wektora lentiwirusowego kontrolnego SFFV-eGFP (eGFP), wraz z 7,5 μg psPAX2 i 2,5 μg mPD2.G i 60 μl 1 mg / ml PEI. Obrazy z mikroskopii jasnego pola i fluorescencji komórek HEK 293T wykazujące ekspresję eGFP 24 godziny po transfekcji, co wskazuje na pomyślne dostarczenie plazmidu. Podziałka = 200 μm. (B) Schematyczne przedstawienie przebiegu ultrawirowania w celu zagęszczenia lentiwirusa. Supernatant komórek HEK 293T zawierający lentiwirusa jest pobierany 48 godzin i 60 godzin po transfekcji, filtrowany przez filtr PES o niskiej wartości wiązania białka 0,45 μm, a następnie ważony 37 g w cienkościennych probówkach polipropylenowych typu open za pomocą wagi stołowej. Probówki są ultrawirowane w wirniku z wahliwym kubełkiem, supernatant jest zasysany, a osad suszony przez 5 minut. Granulki są następnie ponownie zawieszane w lodowatym DMEM zawierającym HEPES i inkubowane przez noc przed porcjowaniem i przechowywaniem w temperaturze -80 °C. (C) Eksperymentalna strategia miareczkowania funkcjonalnego w celu określenia optymalnej dawki wirusa w celu osiągnięcia stosunku 1:1 komórek GFP+ do GFP-. Obrazy z mikroskopii jasnego pola i fluorescencji pokazujące ekspresję eGFP w komórkach czerniaka YUMM1.7, 72 godziny po transdukcji, wskazujące na pomyślne dostarczenie czynników przeprogramowujących i eGFP. Słupki skali = 100 μm. (D) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające strategię bramkowania w celu ilościowego określenia stosunku komórek eGFP+. Żywe komórki bramkowano w celu zapewnienia żywotności populacji ujemnej pod względem barwnika (DAPI), a następnie wykluczenia dubletowego. (E) Kwantyfikacja wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej wraz ze wzrostem dawek wirusa w celu określenia optymalnej objętości dla uzyskania komórek 1:1 GFP+/GFP-. Zarówno w przypadku lentiwirusa PIB-eGFP, jak i lentiwirusa eGFP, objętość 2 μl na 105 komórek osiągnęła pożądany stosunek. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; PEI = polietyleninina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Ocena skuteczności przeprogramowania cDC1 in vivo . (A) Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy do oceny skuteczności przeprogramowania in vivo cDC1. Komórki rakowe są początkowo transdukowane lentiwirusem eksprymującym mCherry w celu wytworzenia znakowanej fluorescencyjnie linii komórkowej (YUMM1.7-mCherry), a następnie transdukcji zoptymalizowaną dawką lentiwirusa PIB-eGFP w dniu -1. Komórki są następnie wstrzykiwane podskórnie w stosunku 1:1 komórek eGFP+ / eGFP- w dniu 0, aby ustalić guzy u myszy CD45.1 i umożliwić komórkom transdukowanym PIB przeprogramowanie się w komórki podobne do cDC1 w TME. Guzy są następnie izolowane we wskazanych punktach czasowych, dysocjowane i barwione pod kątem CD45.1, CD45.2 i MHC-II za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na wykluczenie komórek odpornościowych gospodarza CD45.1 w celu ilościowego określenia skuteczności przeprogramowania cDC1 in vivo poprzez ekspresję CD45.2 i MHC-II. Równoległe hodowle in vitro są utrzymywane przez wszystkie punkty czasowe w porównaniu z przeprogramowaniem in vivo . (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej ilustrujące strategię bramkowania w dniu 9. Komórki bramkowano na mCherry+ i GFP+ w celu zidentyfikowania pomyślnie transdukowanych komórek rakowych. Komórki odpornościowe gospodarza zostały wykluczone przez bramkowanie komórek CD45.1 + . (C) Kwantyfikacja skuteczności przeprogramowania in vivo (po lewej) komórek YUMM1.7-mCherry za pomocą cytometrii przepływowej jako procent komórek CD45+ MHC-II+ (całkowicie przeprogramowanych) i komórek CD45.2+ HLA-DR- lub CD45.2- HLA-DR+ cDC1 (częściowo przeprogramowanych) bramkowanych w eGFP+ mCherry+ Komórek. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej (po prawej) przedstawiające stopniowe nabywanie ekspresji CD45.2 i MHC-II w komórkach YUMM1.7-mCherry transdukowanych przez PIB-eGFP we wskazanych punktach czasowych. Komórki YUMM1.7-mCherry transdukowane eGFP wykorzystano jako kontrolę, a do porównania wykorzystano przeprogramowane komórki podobne do cDC1 przeprogramowane in vitro . Dane w (C) wskazują na średnią ± SD z 3-5 biologicznych powtórzonych eksperymentów. Analizę statystyczną w (C) przeprowadzono dla komórek CD45 + MHC-II + przy użyciu testu Manna-Whitneya. *P &lt; 0,05. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; TME = mikrośrodowisko guza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
Rycina 4: Analiza infiltracji immunologicznej w mikrośrodowisku guza po przeprogramowaniu cDC1 in vivo . (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiające komórki CD45 + w guzach YUMM1.7 po podskórnej implantacji komórek transdukowanych PIB-eGFP lub kontrolnych eGFP (stosunek transdukcji do komórek rodzicielskich 1:1) w dniach 3 i 9. Słupki skali = 500 μm. (B) Kwantyfikacja MFI dla barwienia CD45 w guzach YUMM1.7 leczonych PIB i kontrolnych transdukowanych eGFP w dniach 3 i 9. Dane w (B) wskazują na średnią ± SD z 3-6 biologicznych powtórzonych eksperymentów. Analizę statystyczną w (B) przeprowadzono za pomocą testu Manna-Whitneya. *P &lt; 0,05 i ***P &lt; 0,001. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; MFI = średnia intensywność fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

The efficacy of cancer immunotherapy relies on the recruitment and activation of cytotoxic T cell responses against solid tumors by type 1 conventional ...

Badamy programowanie in vivo komórek nowotworowych w komórkach podobnych do cDC1 jako nową strategię immunoterapii. Naszym celem jest ustalenie, czy to podejście może przekształcić zimne nowotwory immunologiczne w gorące immunologiczne, ogłaszając w ten sposób odporność przeciwnowotworową. Zajmujemy się ograniczeniami obecnych strategii generowania cDC1 in vivo, przedstawiając protokół przekształcania komórek rakowych w immunogenne komórki podobne do cDC1 bezpośrednio w guzie, umożliwiając badanie odpowiedzi immunologicznych sterowanych cDC1 in situ.Nasz praktyczny protokół programowania in vivo niezawodnie generuje dojrzałe immunogenne komórki podobne do cDC1, pokonując supresyjne mikrośrodowisko guza, a ponieważ komórki te są generowane bezpośrednio in vivo, takie podejście eliminuje potrzebę produkcji komórek odpornościowych in vitro. Nasze odkrycia stanowią podstawę do przełożenia przeprogramowania za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego in vivo na praktykę kliniczną, wprowadzając gotową, ale spersonalizowaną immunoterapię nowotworów, która wywołuje trwałe przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Idąc dalej, badamy, w jaki sposób przeprogramowanie komórek podobnych do cDC1 może wywołać tworzenie się trzeciorzędów i infrastruktury oraz czy przekłada się to na odporność humoralną.Ponadto badamy jego potencjalną synergię z innymi podejściami immunoterapeutycznymi. Na początek hoduj komórki HEK 293T, aż osiągną 70 do 80% konfluencji. Teraz należy dokładnie wirować przygotowaną mieszankę transfekcyjną zawierającą plazmid transferowy przez jedną minutę i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie kompleksu lipidowego DNA.Odessać pożywkę z komórek HEK 293T i dodać 10 mililitrów DMEM bez penicyliny, streptomycyny i uzupełnionej 10% FBS. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami do 150-milimetrowych płytek i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji zastąp pożywkę 20 mililitrami kompletnej pożywki DMEM uzupełnionej jednym milimolowym maślanem sodu i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Następnie zebrać supernatant zawierający lentiwirusa do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów po 48 i 60 godzinach od transfekcji. Po pierwszym zbiorze dodaj 12 mililitrów wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM na 150-milimetrową płytkę na drugi zbiór. Przefiltruj zebraną ciecz przez filtr polieterosulfonowy o średnicy 0,45 mikrometra, o niskiej zawartości wiązania białek.Odpipetować 37 gramów pożywki zawierającej lentiwirusa do 38,5 mililitrowych cienkościennych probówek polipropylenowych o pojemności 38,5 mililitra. Odwirować probówki w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 25 000 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zassać supernatant bez naruszania osadu.Umieść otwarte cienkościenne rurki polipropylenowe do góry nogami na chusteczce laboratoryjnej lub podobnym materiale chłonnym na pięć minut, aby spuścić nadmiar płynu i wysuszyć granulkę. Następnie dodaj 200 mikrolitrów lodowatego DMEM uzupełnionego HEPES lub PBS do każdej granulki i przenieś mieszaninę do probówki mikrowirówki umieszczonej w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Inkubować osad przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić całkowite ponowne wymieszanie.Połącz wszystkie zawieszone granulki w jednym pojemniku, podziel zapas wirusa na mniejsze objętości od 50 do 200 mikrolitrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego stosowania. Po ekspansji komórek rakowych przygotuj zawiesiny komórek do transdukcji, aby osiągnąć stosunek komórek EGFP dodatnich do ujemnych EGFP w trzecim dniu. Dodać osiem mikrogramów na mililitr polibrenu do zawiesiny komórek, a następnie odpowiednią objętość lentiwirusa, jak wcześniej oznaczono.Delikatnie wymieszaj zawartość, nie tworząc bąbelków. Teraz odpipetować dwa mililitry przygotowanej zawiesiny komórkowej zawierającej jeden razy 10 do mocy pięciu komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 24 godzinach usunąć pożywkę zawierającą lentiwirusa z każdej studzienki.Umyj studzienki dwa razy PBS. Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie zbadaj studzienki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek od płytki.Następnie zbierz komórki za pomocą kompletnych pożywek do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować komórki przez pięć minut w temperaturze 350 G, aby je ogranulować. Umyj granulki PBS.Pobrać podwielokrotność i ocenić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Następnie ponownie zawieś ostatnią osadkę komórkową w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie od dwóch do czterech razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr, co odpowiada od jednego do dwóch razy 10 mocy sześciu komórek w 50 mikrolitrach na guz. Umieść komórki na lodzie i przenieś się do obszaru eksperymentów na zwierzętach.Po znieczuleniu myszy CD45.1 umieść ją na podkładce rozgrzewającej, aby zapobiec hipotermii. Nałóż krem pod oczy na mysz, aby zapobiec odwodnieniu oczu podczas znieczulenia. Za pomocą brzytwy ogol prawy bok myszy.Opcjonalnie oznacz mysz obcinaczem do uszu. Zdezynfekuj ogolony obszar i usuń pozostałe włosy wacikiem nasączonym 70% etanolem. Teraz, za pomocą pipety P1000, dokładnie zawieś komórki rakowe.Załadować całkowicie zawieszoną zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30. Delikatnie unieś skórę na ogolonym boku myszy dwoma palcami i włóż końcówkę igły strzykawki w fałd utworzony przez uniesioną skórę. Zwolnić uniesioną skórę, trzymając strzykawkę jedną ręką na miejscu.Drugą ręką rozciągnij wierzch skóry dwoma palcami. Powoli wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych, aby w miejscu wstrzyknięcia powstał widoczny owalny obrzęk podskórny. Po zabiegu wstrzyknięcia należy obserwować zwierzę do momentu całkowitego wybudzenia się ze znieczulenia, aby zapewnić przeżycie.Komórki HEK 293T transfekowane plazmidem SFFV-PIB-eGFP wykazały wyraźną ekspresję eGFP 24 godziny po transfekcji, potwierdzając pomyślne dostarczenie osocza. 72 godziny po transdukcji komórki czerniaka wykazały pomyślne dostarczenie czynników przeprogramowujących i eGFP. W dziewiątym dniu po implantacji komórek, przeprogramowanie in vivo dało wyższy odsetek w pełni przeprogramowanych komórek CD45-dodatnich, MHC-II-dodatnich, cDC1 niż w warunkach in vitro.W trzecim dniu po implantacji guzy PIB-eGFP wykazywały znacznie wyższy naciek komórek odpornościowych CD45-dodatnich niż grupy kontrolne eGFP, co wskazuje na wczesną przebudowę immunologiczną. Do dziewiątego dnia średnia intensywność fluorescencji CD45 na obszar guza pozostała znacznie wyższa w guzach PIB-eGFP niż w grupie kontrolnej. Trzeciorzędowe struktury limfatyczne stały się wykrywalne w guzach PIB-eGFP do dziewiątego dnia, co wskazuje na strukturalne zmiany immunologiczne w mikrośrodowisku guza.

tractable-vivo-reprogramming-tumor-cells-to-type-1-conventional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Poznaj metodę przeprogramowania komórek nowotworowych na komórki dendrytyczne cDC1 in vivo w mysim modelu. Ta technika immunoterapii przekształca zimne guzy w gorące, wzmacniając odpowiedź przeciwnowotworową.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Przeglądaj więcej filmów