Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Badamy programowanie in vivo komórek nowotworowych w komórkach podobnych do cDC1 jako nową strategię immunoterapii. Naszym celem jest ustalenie, czy to podejście może przekształcić zimne nowotwory immunologiczne w gorące immunologiczne, ogłaszając w ten sposób odporność przeciwnowotworową. Zajmujemy się ograniczeniami obecnych strategii generowania cDC1 in vivo, przedstawiając protokół przekształcania komórek rakowych w immunogenne komórki podobne do cDC1 bezpośrednio w guzie, umożliwiając badanie odpowiedzi immunologicznych sterowanych cDC1 in situ.

Nasz praktyczny protokół programowania in vivo niezawodnie generuje dojrzałe immunogenne komórki podobne do cDC1, pokonując supresyjne mikrośrodowisko guza, a ponieważ komórki te są generowane bezpośrednio in vivo, takie podejście eliminuje potrzebę produkcji komórek odpornościowych in vitro. Nasze odkrycia stanowią podstawę do przełożenia przeprogramowania za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego in vivo na praktykę kliniczną, wprowadzając gotową, ale spersonalizowaną immunoterapię nowotworów, która wywołuje trwałe przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Idąc dalej, badamy, w jaki sposób przeprogramowanie komórek podobnych do cDC1 może wywołać tworzenie się trzeciorzędów i infrastruktury oraz czy przekłada się to na odporność humoralną.

Ponadto badamy jego potencjalną synergię z innymi podejściami immunoterapeutycznymi. Na początek hoduj komórki HEK 293T, aż osiągną 70 do 80% konfluencji. Teraz należy dokładnie wirować przygotowaną mieszankę transfekcyjną zawierającą plazmid transferowy przez jedną minutę i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie kompleksu lipidowego DNA.

Odessać pożywkę z komórek HEK 293T i dodać 10 mililitrów DMEM bez penicyliny, streptomycyny i uzupełnionej 10% FBS. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami do 150-milimetrowych płytek i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji zastąp pożywkę 20 mililitrami kompletnej pożywki DMEM uzupełnionej jednym milimolowym maślanem sodu i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnie zebrać supernatant zawierający lentiwirusa do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów po 48 i 60 godzinach od transfekcji. Po pierwszym zbiorze dodaj 12 mililitrów wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM na 150-milimetrową płytkę na drugi zbiór. Przefiltruj zebraną ciecz przez filtr polieterosulfonowy o średnicy 0,45 mikrometra, o niskiej zawartości wiązania białek.

Odpipetować 37 gramów pożywki zawierającej lentiwirusa do 38,5 mililitrowych cienkościennych probówek polipropylenowych o pojemności 38,5 mililitra. Odwirować probówki w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 25 000 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zassać supernatant bez naruszania osadu.

Umieść otwarte cienkościenne rurki polipropylenowe do góry nogami na chusteczce laboratoryjnej lub podobnym materiale chłonnym na pięć minut, aby spuścić nadmiar płynu i wysuszyć granulkę. Następnie dodaj 200 mikrolitrów lodowatego DMEM uzupełnionego HEPES lub PBS do każdej granulki i przenieś mieszaninę do probówki mikrowirówki umieszczonej w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Inkubować osad przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić całkowite ponowne wymieszanie.

Połącz wszystkie zawieszone granulki w jednym pojemniku, podziel zapas wirusa na mniejsze objętości od 50 do 200 mikrolitrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego stosowania. Po ekspansji komórek rakowych przygotuj zawiesiny komórek do transdukcji, aby osiągnąć stosunek komórek EGFP dodatnich do ujemnych EGFP w trzecim dniu. Dodać osiem mikrogramów na mililitr polibrenu do zawiesiny komórek, a następnie odpowiednią objętość lentiwirusa, jak wcześniej oznaczono.

Delikatnie wymieszaj zawartość, nie tworząc bąbelków. Teraz odpipetować dwa mililitry przygotowanej zawiesiny komórkowej zawierającej jeden razy 10 do mocy pięciu komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 24 godzinach usunąć pożywkę zawierającą lentiwirusa z każdej studzienki.

Umyj studzienki dwa razy PBS. Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie zbadaj studzienki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek od płytki.

Następnie zbierz komórki za pomocą kompletnych pożywek do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować komórki przez pięć minut w temperaturze 350 G, aby je ogranulować. Umyj granulki PBS.

Pobrać podwielokrotność i ocenić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Następnie ponownie zawieś ostatnią osadkę komórkową w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie od dwóch do czterech razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr, co odpowiada od jednego do dwóch razy 10 mocy sześciu komórek w 50 mikrolitrach na guz. Umieść komórki na lodzie i przenieś się do obszaru eksperymentów na zwierzętach.

Po znieczuleniu myszy CD45.1 umieść ją na podkładce rozgrzewającej, aby zapobiec hipotermii. Nałóż krem pod oczy na mysz, aby zapobiec odwodnieniu oczu podczas znieczulenia. Za pomocą brzytwy ogol prawy bok myszy.

Opcjonalnie oznacz mysz obcinaczem do uszu. Zdezynfekuj ogolony obszar i usuń pozostałe włosy wacikiem nasączonym 70% etanolem. Teraz, za pomocą pipety P1000, dokładnie zawieś komórki rakowe.

Załadować całkowicie zawieszoną zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30. Delikatnie unieś skórę na ogolonym boku myszy dwoma palcami i włóż końcówkę igły strzykawki w fałd utworzony przez uniesioną skórę. Zwolnić uniesioną skórę, trzymając strzykawkę jedną ręką na miejscu.

Drugą ręką rozciągnij wierzch skóry dwoma palcami. Powoli wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych, aby w miejscu wstrzyknięcia powstał widoczny owalny obrzęk podskórny. Po zabiegu wstrzyknięcia należy obserwować zwierzę do momentu całkowitego wybudzenia się ze znieczulenia, aby zapewnić przeżycie.

Komórki HEK 293T transfekowane plazmidem SFFV-PIB-eGFP wykazały wyraźną ekspresję eGFP 24 godziny po transfekcji, potwierdzając pomyślne dostarczenie osocza. 72 godziny po transdukcji komórki czerniaka wykazały pomyślne dostarczenie czynników przeprogramowujących i eGFP. W dziewiątym dniu po implantacji komórek, przeprogramowanie in vivo dało wyższy odsetek w pełni przeprogramowanych komórek CD45-dodatnich, MHC-II-dodatnich, cDC1 niż w warunkach in vitro.

W trzecim dniu po implantacji guzy PIB-eGFP wykazywały znacznie wyższy naciek komórek odpornościowych CD45-dodatnich niż grupy kontrolne eGFP, co wskazuje na wczesną przebudowę immunologiczną. Do dziewiątego dnia średnia intensywność fluorescencji CD45 na obszar guza pozostała znacznie wyższa w guzach PIB-eGFP niż w grupie kontrolnej. Trzeciorzędowe struktury limfatyczne stały się wykrywalne w guzach PIB-eGFP do dziewiątego dnia, co wskazuje na strukturalne zmiany immunologiczne w mikrośrodowisku guza.