Metody elektrofizjologiczne oceny blokady bólu obwodowego u znieczulonego szczura
21 listopada 2025
Przedstawiamy tutaj metodę oceny aktywacji i blokady aksonów czuciowych w nerwach obwodowych w ostrych, znieczulonych, in vivo eksperymentach na szczurach z użyciem dwóch typów elektrofizjologicznych pomiarów rdzenia, które pozwalają rozróżnić aktywność podtypów włókien nerwowych: lokalnych potencjałów pola oraz zapisów pojedynczego neuronu o szerokim zakresie dynamicznym.
Celem naszych badań jest opracowanie obwodowych blokad nerwowych elektrycznych i bliskich podczerwieni do leczenia bólu. Technologie takie jak bloki elektryczne prądem stałym i prądem przemiennym o wysokiej częstotliwości oraz fotobiomodulacja w bliskiej podczerwieni oferują potencjał w klinicznym złagodzeniu bólu. Na początek ułóż znieczulonego szczura na plecach na stole operacyjnym.
Intubuj szczura w pozycji leżącej, używając pochewy z dożylnego cewnika Angiocath 14 gauge oraz laryngoskopu z ostrzem w rozmiarze 0 lub 0.0. Oczyść boczną stronę żyły ogonowej letnią wodą, a następnie dodać 70% alkoholu izopropylowego. Następnie cewnik bocznej żyły ogonowej za pomocą dożylnego cewnika 22 gauge.
Teraz wstrzyknij około jednego mililitra bezpłodnej soli fizjologicznej do cewnikowanej żyły ogona. Za pomocą rurki polietylenowej podłącz wkładany cewnik żyły ogonowej do strzykawki zawierającej roztwór rokuronia o stężeniu dwóch miligramów na mililitr, zamontowanej na śrubokrętze strzykawkowym. Dotknij najbardziej ogonowego żebra po lewej stronie szczura i podążaj nim grzbietowo, aż do kręgosłupa.
Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie środkowe o długości około 60 milimetrów, wyśrodkowane na tym punkcie. Za pomocą skalpela zeskrobaj tkanki z wyrostków kolczastych. Następnie użyj nożyczek, aby odsłonić żebra i zlokalizować najbardziej ogonowe żebro.
Potwierdź położenie żeber wizualnie i dotykowo, wykonując tępe rozwarstwienie pod mikroskopem chirurgicznym z powiększeniem 3,5 do 45 x. Oznacz wyrostek kolczasty T13 markerem permanentnym. Następnie wykonaj tępe rozwarstwienie, aby utworzyć kieszenie po obu stronach kręgów T11 i L4.
Włóż dwa pionowe słupy z mocowaniem podstawowym do ścieżki T-platformy stereotaksyjnej i wyrównaj je z kręgami T11 i L4 bez zaciskania. Włóż cylindryczne wałki zacisków kręgowych do zacisków słupa, ale jeszcze ich nie dokręcaj. Zaczynając od kręgu T11, trzymaj kręgosłup za pomocą ząbkowanych kleszczy.
Włóż szczęki zacisków kręgosłupa po obu stronach kręgu pod kątem około 45 stopni od kręgu T13 i zaciskaj szczęki. Dokręć trzon zacisku grzbietowego w zacisku słupa. Następnie unieś oba zaciski na słupach, aby unieść kręgosłup, zapewniając, że tułów jest całkowicie podparty przez zaciski kręgosłupa.
Następnie zaznacz rostralne pozycje ogonowe wyrostków kolczastych T13 i L1, umieszczając pojedyncze szwy na powierzchni mięśnia, bocznie od kręgosłupa. Użyj kleszczy zębatych, nożyczek i skalpela, aby oczyścić mięsień i tkankę łączną z powierzchni błonek kręgów między T12 a L3. Pod mikroskopem chirurgicznym użyj rongeurów Friedmana-Pearsona do usunięcia błonek kręgowych od L2 do T13. Rozpoczęcie laminektomii od trzymania rongeurów blisko poziomości i pobierania małych kęsów z części ogonowej L2, gdzie nakładają się na L3. Przedłuż laminektomię na wyrost, odsłaniając linię środkową rdzenia kręgowego, unikając nacisku na rdzeń kręgowy i regularnie usuwając fragmenty kości z rongeurów.
Przedłuż laminektomię o dwa milimetry bocznie po obu stronach linii środkowej rdzenia kręgowego. Następnie użyj cienkich kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby usunąć oponę twardą z odsłoniętego rdzenia kręgowego. Zabarw dura mater przed nacięciami.
Po pierwszym cięciu pozwól niewielkiej ilości płynu mózgowo-rdzeniowego wypłynąć i delikatnie go namoczyć, używając skręconej tkaniny wolnej od kłaczków. Następnie usuń pozostałą część mięśnia twardego. Przykryj odsłonięte miejsce laminektomii kawałkiem tkanki zwilżonej solą fizjologiczną do czasu rozpoczęcia sesji elektrofizjologicznej.
Aby pobudzić nerw kulszowy, odsłonij nerw i umieść wokół niego specjalnie wykonaną elektrodę w stylu JC z platyny dwubiegunowej, z odsłoniętymi stykami o wymiarach jeden na trzy milimetry. Następnie umieść urządzenie blokujące nerwy obok odsłoniętego nerwu. Do stymulacji sadznicy włóż dwie 13-milimetrowe elektrody ze stali nierdzewnej, jedną wewnątrz piątego palca, a drugą na zewnątrz czwartego, blisko powierzchni donicy tylnej łapy.
Dla rejestracji neuronów o szerokim zakresie dynamicznym stymuluj albo powierzchnię sadzenia tylnej łapy, albo bezpośrednio stymuluj nerw kulszowy za pomocą elektrody mankietowej nerwowej. Aby uzyskać lokalne nagrania potencjału pola, należy bezpośrednio stymulować nerw kulszowy, aby uniknąć sygnałów rozproszonych. Aby rejestrować sygnały elektrofizjologiczne, należy włożyć igły hipodermiczne o grubości 21 gauge 1,5 cala do mięśnia po obu stronach kręgosłupa, ustawionych równolegle do kręgosłupa.
Cyfrow sygnały elektrofizjologiczne w ciągłym tempie i wyświetlaj je w czasie rzeczywistym. Do lokalnych pomiarów potencjału pola włóż matrycę elektrod skierowaną w stronę ogonowej rostralnej, ustawiając najbardziej wysuniętą elektrodę na wysokość rostralnej z szwem oznaczającym wyrostek kolczasty T13 jak najbliżej linii środkowej bez uszkadzania naczyń krwionośnych linii środkowej. Dostosowuj parametry stymulacji podczas monitorowania zarejestrowanych sygnałów.
Dla blokady nerwu obwodowego użyj elektrody z rozdzielonym węglem, aby przyprowadzić 0,1 do 5 miliamperów oczyszczający prąd stały do nerwu kulszowego bliższego boku mankietu stymulującego, jeśli obecny blok został wywołany zarówno we włóknach A, jak i C w zbliżonym tempie, co pokazuje zmniejszenie obszaru sygnału pola lokalnego podczas okresu stosowania prądu stałego. Odzyskiwanie z blokady różniło się w zależności od typu światłowodów. Rekonwalescencja była szybka w przypadku włókien C i powolna w przypadku włókien A.
Światłowody C o dłuższej latencji blokowały dłużej, ale odzyskiwały się wcześniej niż światłowody C o krótszym opóźnieniu. Dzięki tej technice możemy ocenić szybkość indukcji bloku oraz powrót nerwów do prawidłowego przewodzenia po zabiegu. W porównaniu z ocenami behawioralnymi, nasze techniki elektrofizjologiczne pozwalają na dokładniejsze określenie wpływu blokady nerwowej na różne klasy włókien nerwowych.
Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na selektywnym bloku bólu, jednocześnie minimalizując blokadę aksonów zaangażowanych w kontrolę ruchu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje techniki rejestracji elektrofizjologicznej in vivo z obszaru lędźwiowego kręgosłupa szczura, służące do badania aktywacji neuronów sensorycznych w kończynach tylnych oraz oceny skuteczności interwencji terapeutycznych przerywających wstępujące sygnały bólowe. Protokół obejmuje przygotowanie chirurgiczne, gromadzenie danych oraz analizę potencjałów polowych (LFP) i rejestracji pojedynczych neuronów o szerokim zakresie dynamicznym (WDR), co umożliwia rozróżnienie podklas włókien nerwowych oraz ocenę rodzajów blokady nerwów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Badania nad bólem
Wstęp
- Rejestracje elektrofizjologiczne z rdzenia kręgowego szczura dostarczają informacji na temat przekazywania sygnałów sensorycznych i mechanizmów bólu.
- Rejestracje LFP i WDR umożliwiają rozróżnienie typów włókien nerwowych na podstawie prędkości przewodzenia.
- Za pomocą tych technik można ocenić terapeutyczne interwencje polegające na blokowaniu nerwów.
- W porównaniu z ocenami behawioralnymi możliwe jest dokładne ilościowe określenie efektów bloku nerwowego.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja metod elektrofizjologicznych służących do oceny aktywacji neuronów sensorycznych oraz skuteczności blokady nerwu u szczurów.
- Rozróżnienie aktywacji podtypów włókien nerwowych (włókna Aα/β, Aδ, C) w odpowiedzi na stymulację elektryczną.
- Ocena właściwości czasowych różnych rodzajów blokady bólu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie chirurgiczne, obejmujące laminektomię oraz odsłonięcie nerwu kulszowego u znieczulonych szczurów.
- Umieszczenie elektrod stymulujących (dwubiegunowej opaski lub elektrod igłowych) na nerwie kulszowym lub powierzchni podeszwowej.
- Rejestracja lokalnych potencjałów polowych oraz aktywności pojedynczych neuronów o szerokim zakresie dynamicznym w lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego.
- Zastosowanie interwencji blokujących nerw: prądu stałego, prądu przemiennego o częstotliwości kilocyhertz oraz fotobiomodulacji.
Główne wyniki
- Rejestracje LFP pozwalają odróżnić włókna Aα/β i C, ale nie włókna Aδ, dostarczając globalnych danych o aktywacji nerwu kulszowego.
- Rejestracje WDR rozróżniają aktywność włókien Aα/β, Aδ i C, wykazując potencjały czynnościowe o wysokim stosunku sygnału do szumu.
- Blokada nerwu prądem stałym wywołała blokadę zarówno we włóknach A, jak i C w podobnym tempie; powrót funkcji był szybki dla włókien C i wolniejszy dla włókien A.
- Techniki elektrofizjologiczne umożliwiają precyzyjny pomiar dynamiki indukcji i zniesienia blokady nerwu.
Wnioski
- Elektrofizjologia rdzenia kręgowego in vivo umożliwia szczegółowe badanie aktywacji włókien sensorycznych oraz skuteczności blokady nerwów.
- Metody te zapewniają bardziej precyzyjną kwantyfikację niż oceny behawioralne.
- Przyszłe badania mają na celu selektywną blokadę włókien bólowych przy jednoczesnym zachowaniu funkcji motorycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektrofizjologiczna ocena blokady bólu obwodowego u znieczulonych szczurów zapewnia ilościowe, oparte na mechanizmach podejście do oceny interwencji blokowania nerwów na poziomie włókien sensorycznych. Metodologia ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków przeciwbólowych, umożliwiając bezpośredni pomiar dynamiki blokady i regeneracji specyficznych dla danych włókien. Integracja tych technik z procesem badawczym wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie nowych terapii przeciwbólowych oraz interwencji opartych na urządzeniach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę modulacji szlaków bólowych przez potencjalne interwencje.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez elektrofizjologiczne odczyty specyficzne dla typu włókien.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla strategii blokowania bólu obwodowego.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla selekcji i priorytetyzacji portfolio.
Przesiewy i rozwój testów
- Ustanawia zwalidowane modele in vivo dla powtarzalnej oceny skuteczności blokady nerwowej.
- Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki do przesiewu związków lub urządzeń.
- Umożliwia rozróżnienie odpowiedzi włókien Aα/β, Aδ i C w celu zapewnienia specyficzności analizy.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w programach modulacji bólu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie przedklinicznych odczytów do profili aktywacji włókien sensorycznych istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po rozwój biomarkerów translacyjnych.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o rozwoju terapii przeciwbólowych i urządzeń do neuromodulacji w oparciu o analizę ryzyka.
- Zwiększa wartość prognostyczną dla translacji klinicznej poprzez kwantyfikację kinetyki blokady i regeneracji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta platforma elektrofizjologiczna łączy wczesny etap odkrywania, identyfikację wiodących związków oraz walidację przedkliniczną interwencji w zakresie blokowania bólu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących przerywania i powrotu sygnałów bólowych specyficznych dla poszczególnych włókien.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary skuteczności blokady nerwu w celu oceny kandydatów.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar blokady przewodzenia, regeneracji oraz selektywności względem typu włókien.
- Badania translacyjne: Dostosowuje przedkliniczną skuteczność do mechanistycznych biomarkerów istotnych dla ludzkich szlaków bólowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę in vivo dla różnorodnych strategii modulacji bólu i modalności interwencji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w leczeniu bólu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne oceny elektrofizjologiczne.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczaniu ilościowych danych specyficznych dla poszczególnych włókien.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na leki blokujące ból.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii in vivo oraz przygotowania chirurgicznego.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do akwizycji i analizy sygnałów w czasie rzeczywistym.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów stymulacji i rejestracji pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych nerwów docelowych lub modeli zwierzęcych.
- Czas przygotowania jest ograniczony do około 5 godzin na jedną sesję interwencyjną.
