SCAnED – otwartoźródłowe makro do segmentacji skóry do półautomatycznego wykrywania komórek i jąder w przegrodach skóry naskórnej i skórnej

W naszej pracy badamy mechanizmy regulacyjne utrzymujące homeostazę tkanek na poziomie molekularnym, komórkowym, strukturalnym i mechanicznym. Naszym celem jest zrozumienie schorzeń patologicznych, takich jak stan zapalny skóry czy nowotwory. Dzięki nowym narzędziom do obrazowania i multiomiki o wysokiej rozdzielczości możemy teraz mapować zmiany w komórkach i ekspresji genów w tkankach w 2D i 3D.

To naprawdę poszerza nasze rozumienie tego, jak choroby się rozwijają i postępują. Jednym z dużych wyzwań obecnie jest ogromna ilość danych generowanych przez zaawansowaną mikroskopię. I choć dostępnych jest więcej narzędzi do analizy obrazów, często nie są one przyjazne dla osób bez dużego doświadczenia lub są dość drogie.

Nasz protokół oferuje bezpłatne, przyjazne użytkownikowi narzędzie do analizy komórek skóry zarówno w naskórku, jak i skórze skórnej. Poprawia to dokładność w porównaniu do zwykłych narzędzi i nie wymaga doświadczenia w programowaniu ani wcześniejszej analizie obrazów. Aby zacząć, otwórz obrazy immunofluorescencji w Fiji lub Obraz J, używając formatów biologicznych z domyślnymi ustawieniami.

Nie dziel kanałów podczas tego etapu. Pobierz makr SCAnED i uruchom je, wybierając wtyczki. Potem makra i klikanie "uruchom".

Wybierz plik skryptu makra SCAnED po wywołaniu pytania. Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie zawartymi w makrze. Wybierz kanał E-cadherin, gdy makro go wywoła.

Następnie przejdź do obrazu, wybierz dostosowanie, a następnie próg, aby ręcznie dostosować próg dla kanału E-cadherin. Kliknij OK, gdy region naskórka zostanie w pełni uchwycony. Następnie wybierz kanał DAP-E, gdy pojawi się poproszenie o rozpoczęcie segmentacji.

Automatycznie definiuj poziomy intensywności segmentacji jąder przy użyciu funkcji progowej. Dla StarDist otwórz wtyczkę w Image J. Załaduj model wykrywania jąder do graficznego interfejsu StarDist i kliknij kanał jąder, aby wybrać go do analizy. Teraz dostosuj ustawienia kafelków w StarDyst tak, aby odpowiadały oczekiwanemu rozmiarowi patcha 256 na 256 pikseli.

Po zapytanie wybierz tak, aby zmierzyć intensywność markera w jądrach. Następnie powtórz proces segmentacji i analizy dla każdego kanału fluorescencyjnego. Po przetworzeniu wszystkich kanałów zapisz dane wyjściowe jako pliki wartości oddzielone przecinkami, zgodnie z instrukcjami makra.

Dla regionu cytoplazmatycznego, gdy segmentacja jąder została przeprowadzona za pomocą funkcji progowej, należy zastosować dylatację binarną, aby poszerzyć interesujący obszar jądra. Gdy StarDist zostanie użyty do segmentacji jąder, należy zastosować rozszerzenie powiększenia do interesującego obszaru jądrowego. Wybierz tak, gdy zostaniesz poproszony o pomiar intensywności markera w całym obszarze komórki.

Następnie zapisz powstałe pliki danych jako format wartości rozdzielony przecinkami zgodnie z instrukcjami makra. Ustal progi intensywności specyficzne dla markerów, korzystając z próbek kontrolowanych izotypem. Pobierz odpowiedni notes Jupyter i przejdź do Google Collab, aby wybrać plik, a następnie otwórz notes.

Wybierz plik i uruchom komórki kodu sekwencyjnie. Gdy pojawi się opcja wyboru plików, kliknij przycisk i zaślij plik z wartością rozdzieloną przecinkami. Dla każdego przeciwciała oblicz średnią intensywność fluorescencji za pomocą plików kontrolnych izotypów.

Aby określić progi progowe, otwórz notes dot plot, zaślij dane sterujące izotypem i uruchom kod. Na podstawie rozkładu kropek na wykresach zarówno dla kontroli izotypu, jak i danych specyficznych przeciwciał, wybierz próg intensywności, aby odróżnić sygnał tła od prawdziwego wyrażenia markerów. Użyj tego progu, aby sklasyfikować każdą komórkę jako dodatnią lub ujemną dla danego markera.

Na koniec stwórz wykresy kropkowe, aby zwizualizować wzorce współwyrażeń markerów, uruchamiając kod wykresu kropkowego w notatniku Google Collab. Na obrazach ręcznie segmentowanych komórki z wimentyną wykazywały silny sygnał cytoplazmatyczny z wyraźnymi granicami ROI pokrywającymi cały organizm komórki. Półautomatyczna segmentacja SCAnED uchwyciła komórki wimentynowe o podobnych granicach, stosując podejście progowe i dylatacyjne.

Ilościowe porównanie intensywności vimentyny w 21 komórkach nie wykazało istotnej różnicy między segmentacją manualną a SCAnED. Analiza histogramu wykazała częstszą częstotliwość komórek wimentynowych w skórze skórnej łuszczycy w porównaniu do zdrowej skóry. Analiza skalarna komórek skórnych wykazała wzrost liczby komórek pozytywnych na wimentynę w luszcycy na podstawie CD-90 w porównaniu do zdrowej skóry.

W epidermie próbki łuszczycy wykazały wzrost liczby komórek wimentynowych z ujemnym wynikiem CD-90, prawdopodobnie keratynoocytów, w porównaniu do zdrowej skóry. Liczba komórek wimentynowych w naskórku łuszczycowym i zdrowym była porównywalna między SCAnED a QuPath. segmentacja wzrokowa wykazała, że SCAnED dokładniej przypisał komórki graniczne do naskórka niż QuPath, który błędnie przypisał kilka.