Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Tak więc obecnie pracujemy nad opracowaniem nowych modeli raka surowicy o wysokim stopniu, modeli, które są syngeneiczne w sensie opisanym przez protokół. Pobieramy zdrowe jajowody od zdrowych myszy, a następnie wyprowadzamy je jako organoidy w szalce Petriego, a następnie nadajemy im wszystkie różne błędy lub modyfikacje genetyczne, które zwykle znajdujemy w normalnej ludzkiej wersji choroby. To bardzo ciekawe, bo z jednej strony można badać wszelkiego rodzaju wewnętrzne czynniki tych guzów wewnątrz szalki Petriego jako organoidy, które są bardziej realistyczne niż tradycyjne kultury dwuwymiarowe.

Ale ponieważ istnieją modele syngeneiczne, można wziąć te organoidy i umieścić je z powrotem w myszy, a następnie zobaczyć, jak guz faktycznie się rozwija i wchodzi w interakcje z gospodarzem. Pozwala nam to spojrzeć na to, jak faktycznie przebiega guz i jego powstanie, co mamy nadzieję dać nam lepsze narzędzia i lepsze zrozumienie, jak ta choroba faktycznie działa i jak z nią lepiej walczyć. Na początek zdobądź uśpione samice czarnych myszy C57 6J.

Usuń jajnik i jajowód i przenieś je do sterylnej szalki Petriego zawierającej DMEM, uzupełnioną streptomycyną penicyliną w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj mikroskopu rozcinającego się, cienkich kleszczy i nożyczek, aby usunąć pozostałości tłuszczu z jajnika. Odizoluj jajowod, w tym śródfundibulum oraz część dalszej ampułki, od jajnika i macicy.

Następnie przenieś oczyszczoną tkankę do probówki zawierającej całą mieszankę trawienia. Za pomocą cienkich nożyczek pokrój jajowód na kawałki mniejsze niż 0,5 milimetra. Następnie inkubuj rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 do 50 minut przed przeprowadzeniem hodowli organoidów.

Aby opracować model guza myszy, przygotowałem pięć zastrzyków, z których każdy zawiera cztery miliony komórek zawieszonych w nieuzupełnionym Opti-MEM I, lodowato zimnej matrycy błony podstawnej. Aby przygotować zastrzyki, najpierw wydmuchaj pęcherzyki powietrza z martwej objętości strzykawki insulinowej U-100 wyposażonej w igłę 28-gauge, używając zimnego PBS. Następnie powoli ładuj strzykawkę 40 mikrolitrami komórek i trzymaj je na lodzie, aż myszy zostaną znieczulone.

Gdy będą gotowe do wstrzyknięcia, umieść strzykawki obok lampy grzewczej, aby matryca błony podstawnej się ogrzała i zwiększyła lepkość, co ułatwia wstrzykiwanie i wszczepienie. Następnie umieść mysz w podgrzanej klatce pod lampą grzewczą, aby przygotować ją do operacji. Wykonaj nacięcie mniejsze niż jeden centymetr wzdłuż boku, nad udem u znieczulonej myszy.

Przetnij naskórek i podskórek, aby dotrzeć do okolic kaletki. Delikatnie wyciągnij jajnik, znajdując przymocowaną poduszkę tłuszczową. Następnie, używając przygotowanej strzykawki, wstrzykuję komórki przez tłuszczową poduszkę i jajnik do worka jajowodu.

Ostrożnie włóż jajnik do kaletki. Zamknij warstwę mięśniową za pomocą szwów nieplecionych. Następnie zamknij nacięcie skórne za pomocą chirurgicznych zszywek.

Umieść mysz z powrotem w rozgrzanej klatce i utrzymuj temperaturę ciała lampą grzewczą aż do półprzytomności, zwykle przez ponad 15 minut. Organoidy pochodzące z nabłonka jajowodu myszego mają wyraźnie zdefiniowany, kulisty i przezroczysty kształt po około pięciu dniach i wymagają pakowania około 10-12 dni. Organoidy typu dzikiego są przekształcane w nowotwory przednowotworowe za pomocą technik inżynierii genetycznej, takich jak nadekspresja genów lentiwirusowych lub retrowirusowych.

Pojedyncze klonowane linie komórkowe pochodzące z genetycznie modyfikowanych organoidów można dalej badać in vivo poprzez wstrzyknięcie do kaletki jajnika. Guzy zazwyczaj osiągają rozmiar od dwóch do trzech centymetrów około 60 dni po podaniu iniekcji. Mówimy to naprawdę, jak już wcześniej wspomniałem, największą zaletą tego protokołu jest generowanie tych modeli syngeneicznych, prawda?

A ponieważ są syngenetyczne, jak już mówiłem, można naprawdę docenić interakcję między kompletnym zwierzęciem, kompletną myszą a guzem, który się rozwija, mając jednocześnie pełną kontrolę nad genami guza. I oczywiście, w porównaniu z innymi modelami, gdzie może próbujesz zrozumieć układ odpornościowy wewnątrz szalki Petriego, oczywiście bardzo trudno będzie odtworzyć układ odpornościowy w szalce Petriego. Albo jeśli bierzesz PDX, czyli próbki guzów od pacjentów, które następnie wkładasz do myszy, aby to zadziałało, myszy nie mogą mieć układu odpornościowego, bo inaczej ten guz zostanie odrzucony, prawda?

Ale ponieważ ten model jest syngeneiczny, można naprawdę docenić całkowitą interakcję całego gospodarza z guzem, a szczególnie z układem odpornościowym, który obecnie jest jednym z najgorętszych obszarów badań w tej dziedzinie. Naprawdę uważam, że to najważniejsza zaleta tego protokołu w porównaniu z innymi protokołami, które można znaleźć gdzie indziej. Tak naprawdę już używamy tych modeli do badania bardzo interesujących zjawisk.

Powiedziałbym, że najbardziej interesuje mnie obecnie to, jak adaptacyjny układ odpornościowy, z tego, co widzieliśmy, wydaje się być głównym czynnikiem kształtującym właściwości genomowe, szczególnie wariantami liczby kopii w wysokostopieńskich surowicznych rakach jajnika, w tym sensie, że jeśli układ odpornościowy nie istnieje, wydaje się, że te guzy nie rozwijają tak masywnych i złożonych przekształceń DNA. Próbujemy więc ustalić, jak do tego dochodzi i jak możemy spróbować odwrócić sytuację, by wzmocnić wszelkie terapie immunologiczne przeciwko niej.