Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Projekt ten ma na celu opracowanie wysokoprzepustowej metody optymalizacji i charakteryzacji wieloskładnikowego narzędzia optogenetycznego o nazwie LACE do ekspresji genów ssaków. Na początek umieść kolbkę z komórkami HEK 293 T w szafce na zabezpieczenie biologiczne. Użyj pipety serologicznej do aspiracji zużytego nośnika.

Pipetą nałóż 10 mililitrów DPBS do jednego rogu kolby i delikatnie mieszaj, aby umyć komórki. Następnie zasysaj roztwór płukający i wyrzucaj zarówno DPBS, jak i aspirator do pojemnika na odpady. Następnie dodaj do kolby 1,5 mililitra 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię, i inkubuj.

Delikatnie stuknij w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni. Następnie pipetować 8,5 mililitra świeżego DMEM do kolby. Aspiruj roztwór w górę i w dół, aż nie pojawią się żadne agregaty do ponownego zawiesienia komórek.

Następnie przelej dziewięć mililitrów zawiesiny ogniwowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj do kolby dziewięć mililitrów świeżego DMEM. Inkubuj zawiesinę aż do zbiórki pod 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów zawieszonych komórek z 10 mikrolitrami barwnika trypsyny w proporcji jeden do jednego, aby obliczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Do każdego odwiertu zasiać około 35 000 komórek w 100 mikrolitrach wysokiej wydajnej płyty o wysokiej wydajności numer 1,5, czarnej, 96-dołkowej płyty o szklanym dnie. Włóż talerz do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny.

Do transfekcji najpierw należy podać 11 mikrolitrów ciepłego, wolnego od surowicy DMEM do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra na jeden dołek i nadmiar 10%. Przygotuj różne stosunki masowe plazmidów białka fluorescencyjnego wzmocnionego CRY2 do RNA przewodnika CIBN/Aliquot 110 nanogramów na dołek przygotowanych roztworów do każdej probówki zawierającej alikwoty medium wolnego od surowicy. Następnie pipetuję dodatkowe 11 mikrolitrów bezsurowicznego DMEM dla każdego dołka do osobnych probówek do rozcieńczenia odczynników transfekcyjnych.

Dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do mieszaniny podłoża DNA i inkubuj, aby utworzyć kompleksy transfekcyjne. Następnie pipetować 20 mikrolitrów przygotowanego kompleksu transfekcyjnego do każdej dołki na 96-dołkowej płytce zawierającej komórki HEK 293 T. Owiń płytę z 96 dołkami folią aluminiową i umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza pod stężeniem 5% dwutlenku węgla na 24 godziny.

Aby rozpocząć proces aktywacji, zmodyfikuj kod wejściowy mikrokontrolera, aby oświetlał pożądane studnie za pomocą określonych linii skryptu. Ustaw natężenie diody lulumenckiej na 9,27 miliwata na centymetr kwadratowy, korzystając z wskazanych linii kodowych. Reguluj długość impulsu do jednej sekundy, a następnie ustaw częstotliwość na 0,067 herca, co odpowiada co 15 sekund.

Spryskaj pokrywkę optoPlate wydrukowaną w 3D 70% etanolem. Następnie pozwól wyschnąć w szafce zabezpieczającej się biologicznie. Teraz włącz czerwoną lampę w ciemni.

Włóż płytkę z 96 dołkami do szafki do zabezpieczenia biologicznego. Wymień pokrywkę talerza na wysuszoną pokrywkę drukowaną w 3D. Umieść płytkę z 96 dołkami na matrycy LED, aby złożyć aparat aktywacyjny.

Umieść w pełni złożony aparat LED w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Podłącz mikrokontroler, diodę lutarną i porty wentylatora do źródła zasilania. Aby wykonać cytometrię przepływową, uruchom program uruchamiający system w oprogramowaniu ekspertów na stronie.

Załaduj dwa mililitry wody zdejonizowanej do ładowarki próbek. Przeprowadz kontrolę jakości z wykorzystaniem dostarczonych koralików kontroli jakości. Ustaw i określ odwierty próbkowe do pozyskiwania.

Stwórz wykresy i tabele dla rozrzutu bocznego względem rozrzutu do przodu, wysokości rozrzutu bocznego względem obszaru bocznego, obszaru rozpraszania bocznego względem FITC-A oraz tabeli statystyk FITC-A. Teraz zatrzaskaj płytkę V-down 960-dołkową do ładowarki płytowej cytometru. Wybierz nietransfektowany dół i kliknij Inicjalizuj, a następnie Uruchom.

Dostosuj rozpraszanie boczne i napięcia FITC, aby centrować populację zainteresowaną na wykresie SSC-A kontra FSC-A. Kliknij na Run, a następnie wybierz zielone fluorescencyjne białko wzmocnione CMV, które zostało dobrze przetransekowane. Dostosuj napięcie FITC, aby uwzględnić zarówno ogniwa autofluorescencyjne, jak i fluorescencyjne w wykresie SSC-A kontra FITC-A.

Stwórz wielokąt, aby zredukować populację zdrowych komórek. Drugi wielokąt do zabezpieczenia dla rozróżniania podwójnych na wykresie SSC-H kontra SSC-A. Stwórz bramkę wielokątną, aby odróżnić komórki fluorescujące od niefluorescencyjnych, używając bramki z komórek nietransfekowanych jako odniesienia.

Automatyczne rejestrowanie próbek z prędkością 60 mikrolitrów na minutę, aż do upływu 200 sekund lub osiągnięcia 10 000 zdarzeń. Następnie eksportuj średnie wartości FITC jako plik CSV i analizuj dane. Czyść przepływowy cytometr, wybierając opcję codziennego czyszczenia.

Obrazowanie fluorescencyjne wykazało, że przy stosunku masowym aktywacji niebieskiego światła jeden do dziewięciu indukuje się niższa maksymalna ekspresja eGFP w porównaniu do stosunku pięć, który również wykazywał zwiększoną nieszczelność w warunkach ciemności. Cytometria przepływowa wykazała, że ponad 95% zdarzeń gateated w P1 to singlety we wszystkich warunkach. A nietransfekowane komórki miały mniej niż 0,1% populacji z eGFP.

Kontrola CMV-eGFP miała około 99% komórek eGFP-dodatnich, podczas gdy komórki transfekowane 2pLACE miały około 57%. Komórki transfekowane CMV-eGFP wykazywały silną konstytutywną ekspresję eGFP zarówno w jasnych, jak i ciemnych warunkach, podczas gdy komórki nietransfekowane nie wykazywały widocznej fluorescencji. Potwierdził również skuteczną transfekcję 2pLACE oraz aktywację ekspresji eGFP pod niebieskim światłem przy niższej ekspresji niż CMVeGFP. W próbkach 2pLACE aktywowanych światłem zaobserwowano trzykrotny wzrost ekspresji eGFP w porównaniu do warunków ciemności.

Procent komórek eGFP-dodatnich w próbkach transfekowanych 2pLACE wynosił około 60%. Stosunek masy 3 do 7 dawał najwyższą średnią intensywność fluorescencji i zakres dynamiczny. Protokół ten umożliwia wysokoprzepustową ocenę próbek oraz techniczne replikowanie za pomocą optoPlate do programowania zmiennych warunków świetlnych i częstotliwości impulsów.