Name: Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj udoskonalony system OnePOT PURE i przygotowanie rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek. Standaryzacja warunków wzrostu i ultrawirówka zwiększają odtwarzalność w syntetycznej biologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NL, SL, AB i NZ są wspierane przez stypendium UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1) NL. SL jest dodatkowo wspierane przez Biophoundry Inc. SY jest wspierane przez stypendium doktoranckie Darwin Trust z Uniwersytetu Edynburskiego. CW jest wspierany przez stypendium doktoranckie BBSRC Eastbio. Autorzy dziękują A. Pompa za pomoc w użyciu ultrawirówki, która została wsparta finansowo z Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Dodatkowo dziękujemy B. Lavickovej i S. J. Maerkl za pomoc w uruchomieniu oryginalnego protokołu OnePot. W celu otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji rękopisu zaakceptowanego przez autora wynikającej z tego zgłoszenia. Rysunek 1 został częściowo stworzony w BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pure technology.</a> Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnePot+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">OnePot PURE cell-free system.</a> J Vis Exp. (172), e62625(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+expression+in+the+One-Pot+PURE+system%3A+insights+into+reaction+composition+and+translation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).</li>
<li>Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+regeneration+from+pyruvate+in+the+PURE+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP regeneration from pyruvate in the PURE system.</a> ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).</li>
<li>Doerr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+with+minimal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems.</a> Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).</li>
<li>Christodoulou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+investigations+of+dynamic+regions+of+intact+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes.</a> PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).</li>
<li>Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+all-E+coli+TXTL+toolbox+3.0%3A+new+capabilities+of+a+cell-free+synthetic+biology+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform.</a> Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+template+preparation+on+variability+in+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production.</a> Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).</li>
<li>Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+method+to+rapidly+screen+machine+learning-generated+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaohakunakorn%2C+N+%22Cell-free+3PGA+energy+solution%22">Cell-free 3PGA energy solution</a>. , Protocols.io. (2020).</li>
<li>Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+on+ribosomal+peptidyltransferase%3A+the+behaviour+of+the+inhibitor+blasticidin+S%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S.</a> Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).</li>
<li>Blaha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functional+ribosomal+complexes+and+effect+of+buffer+conditions+on+tRNA+positions+observed+by+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy.</a> Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).</li>
</ol>

SL jest współzałożycielem i CTO firmy Biophoundry Inc., która rozwija technologię wolnokomórkową dla inżynierii fagów.

Przedstawiliśmy szczegółową procedurę, która pozwoliła nam uzyskać powtarzalne systemy PURE w wielu partiach i z użytkowników w tym samym laboratorium. Do osiągnięcia tego celu potrzebnych jest szereg kluczowych kroków.
Pierwszym ważnym krokiem jest zapewnienie integralności 36 szczepów PURE: oprócz sekwencjonowania wszystkich plazmidów, konieczne jest przeprowadzenie badania ekspresyjnego, aby potwierdzić, że wszystkie szczepy mają prawidłową nadekspresję, ponieważ utrata jednego szczepu może...

Synteza białek wolnych komórek (CFPS) rozwinęła się jako technologia do różnych zastosowań, w tym bioprodukcji, biodetekcji i diagnostyki, prototypowania części i szlaków genetycznych oraz metabolicznych, szybkiej inżynierii białek oraz edukacji 1,2. Systemy CFPS wykorzystujące oczyszczone składniki, pierwotnie opracowane jako system3 "Protein Synthesis Using Recombinant Elements" (PURE), oferują szereg zalet w porównaniu z alternatywami opartymi na lizacie. Systemy PURE mają określony skład, składający się z 36 czynników białkowych, rybosomu 70S E. coli oraz określonej mieszaniny substratów chemicznych, w tym nukleozydowych trifosforanów (NTP), aminokwasów i tRNA, które można dowolnie dostosować do wymaganego zastosowania. Dlatego są one wysoce przystosowane do badań takich jak niekanoniczna inkorporacja aminokwasów, modelowanie mechanistyczne oraz konstrukcja systemów biomolekularnych i syntetycznych komórekoddolnych 1. Chociaż PURE jest dostępny u komercyjnych dostawców, jego koszt (0,34-1,63 USD za reakcję 1 μL) jest zbyt wysoki dla eksperymentów na dużą skalę; a alternatywna strategia produkcji PURE we własnej praktyce była jak dotąd utrudniona przez pracochłonne protokoły polegające na równoległym oczyszczaniu 36 białek i rybosomów4, które są trudne do przeprowadzenia w sposób odporny i powtarzalny, szczególnie dla niedoświadczonych użytkowników.
Najnowsze osiągnięcia wspomagają domową produkcję PURE. Na przykład Wang i in. zmodyfikowali szczepy E. coli tak, aby uwzględniały genomowo zintegrowane znaczniki heksa-histydyny na maszynie translacyjnej, co ułatwia jednoetapowe oczyszczanie5. Geny kodujące wszystkie białka PURE zostały złożone w niewielką liczbę plazmidów, które również zostały wykorzystane do zmniejszenia nakładu na oczyszczanie6. Villareal i in. stworzyli eleganckie konsorcja szczepów PURE, które równoważą ekspresję, aby produkować białka w odpowiednim stosunku, jednocześnie umożliwiając jednoetapowe oczyszczanie7.
Innowacyjny system OnePot PURE opracowany przez Lavickovu i in. niesie wielkie obietnice w zakresie łatwości użytkowania 8,9. W tym systemie oryginalne szczepy PURE są współhodowane i oczyszczane poprzez pojedynczy etap chromatografii. Chociaż nie jest możliwe dokładne określenie składu powstałego systemu PURE, autorzy wykazali, że wiele partii systemu jest w dużej mierze powtarzalnych, a przybliżony poziom kontroli można osiągnąć poprzez zmianę objętości szczepu każdego szczepu. Kompromis między precyzyjną kontrolą składu a łatwością produkcji jest akceptowalny dla wielu użytkowników, biorąc pod uwagę, że całkowity wynik syntezy białek z systemu OnePot jest podobny do tego uzyskanego komercyjnie. Jednak mimo szczegółowych protokołów dla systemu OnePot, pełne odtworzenie wyników Lavickovej i in. w innych laboratoriach było trudne. Na przykład zaobserwowano niestabilność wektorów ekspresji, powoli rosnące szczepy oraz proteolizę10.
W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy i dopracowany protokół OnePot PURE, który kontroluje wzrost komórek poprzez wykorzystujące standaryzowane zapasy glicerolu i korekty podłoża, udziela wskazówek dotyczących monitorowania wzrostu i przedawkowania przedawkowania podczas zbioru oraz normalizuje ilość glicerolu w końcowym oczyszczaniu. Po drugie, przedstawiamy zoptymalizowaną prymitywną procedurę oczyszczania rybosomów wyłącznie z wykorzystaniem różnicowej ultrawirunki, która równoważy kompromis między aktywnością rybosomów a kosztami i złożonością bardziej zaawansowanych metod.
Chociaż wprowadza to więcej kroków do protokołu OnePot, daje użytkownikowi większą możliwość dokładniejszego diagnozowania procedury w razie potrzeby oraz modyfikacji jej do własnych potrzeb. Demonstrujemy powtarzalność procesu, pokazując wiele biologicznych replikacji przeprowadzonych przez wielu użytkowników w tym samym laboratorium. Uważamy, że kontrola zarówno komponentów PURE, jak i przygotowania rybosomu jest kluczowa dla zapewnienia wysokiej wydajności systemu z CFPS.
Przygotowanie PURE i rybosomu trwają odpowiednio 4 lub 5 dni i mogą być wykonywane kolejno przez jednego użytkownika lub jednocześnie przez dwóch użytkowników. Przygotowanie PURE obejmuje 4x500 mL płynnej hodowli, z których każda daje ~2 g pelletu komórkowego i ~1 mL białek PURE w stężeniu ~15 mg/mL. Przygotowanie rybosomów obejmuje 4 × 500 mL = 2 L hodowli ciekłej, co daje łącznie ~3 g granulek komórkowych i daje ~1 mL prymitywnych rybosomów o stężeniu ~17 μM. Obecny protokół generuje systemy PURE o wydajności syntezy do ~100 μg/mL GFP lub ~130 μg/mL mCherry na 2 godziny reakcji partii11, co wypada korzystnie zarówno w porównaniu z oryginalnym OnePot, jak i systemami komercyjnymi (~140-160 μg/mL)8,12. Dlatego jest to odpowiedni punkt wyjścia do dalszej optymalizacji poprzez uzupełnianie lub modulację wrażliwych składników, takich jak sole, czynniki stłoczające i pojedyncze czynniki białkowe.

<table><tbody><tr><td>2x YT</td><td>Sigma</td><td>Y2377-250G</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Wolny od octana amonu RNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9070G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>09718-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>A8351-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) kompetentny E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Butelka, wirówka (Nalgene)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120-9500</td><td>Butelka z polipropylenowym kopolimerem</td></tr><tr><td>butelka, szklana (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 L</td><td>VWR</td><td>215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596</td><td></td></tr><tr><td>Test Bradforda, Quick Start 1x Dye Reagent</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, mikro</td><td>Eppendorf</td><td>5424R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Cuwettes, półmikro 1,6 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodowy ortofofosforan</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4450/60</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta dializowa, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52962</td><td></td></tr><tr><td>Dwutasowy ortofosforan bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/5240/60</td><td></td></tr><tr><td>DTT bez ważenia</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>jednostka filtra, odśrodkowa 3kDa MWCO Amicon Ultra 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Kolba, 500 mL</td><td>VWR</td><td>214-1133</td><td></td></tr><tr><td>flaska, przepusta 2,5 L&nbsp;</td><td>Tunair</td><td>SS-5013</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Fisherbrand</td><td>H/1200/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES, 1 M roztworu pH 7,3</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP299</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>New Brunswick Innova&reg; 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0392</td><td></td></tr><tr><td>Śruty KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-kwas glutaminowy, hemimagnesium soleny tetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy, sól monopotasa monohydrat</td><td>Sigma</td><td>49601-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octana magnezu</td><td>Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Układ mieszania magnetycznego</td><td>Stuart</td><td>US152</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBExpress Ni-NTA Mag Beads</td><td>NEB</td><td>S1423S</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>pipeta, wielokanałowy Eppendorf Research Plus 30-300 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka do czytnika płytek</td><td>ExcelScientific</td><td>STR-SEAL-PLT (Sterylny)</td><td></td></tr><tr><td>Płyta uszczelniająca do przepuszczania</td><td>Starlab</td><td>E2796-3005</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka foliowa płytowa</td><td>ExcelScientific</td><td>FCS-25</td><td></td></tr><tr><td>czytnik tablic</td><td>BioTek</td><td>Synergia H1</td><td></td></tr><tr><td>Shaker płyt</td><td>Allsheng</td><td>MBI100-4A</td><td></td></tr><tr><td>Płyta, studnia 384</td><td>Thermo Scientific</td><td>242764</td><td></td></tr><tr><td>płytka, 96 głęboka studnia 1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>736-0601</td><td></td></tr><tr><td>płytka, 96 głęboki odwiert, 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>płytka, 96-dołkowy PCR</td><td>Sarstedt</td><td>721,978</td><td></td></tr><tr><td>płytka, optyczna jamka 96</td><td>Thermo Scientific</td><td>10057581</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Orthofosforan diwodoru potasu</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik z ekstrakcją białek (BugBuster)</td><td>EMD Millipore</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>Żywica oczyszczająca białka (cOmplete)</td><td>Roche</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>Shaker do rożna</td><td>Starlab</td><td>RM-Multi 1</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3105/70</td><td></td></tr><tr><td>Sonda sonifikacji, FisherBrand 15-50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>12931181</td><td></td></tr><tr><td>Sonifikacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Jenway</td><td>Genova Plus</td><td></td></tr><tr><td>spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S2626-1G</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 0,5 M</td><td>Supelco</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>NTP Thermo Fisher, buforowany Tris</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1481</td><td></td></tr><tr><td>tRNA z E. coli MRE600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>trypton</td><td>Formedium</td><td>TRP02</td><td></td></tr><tr><td>lampa, 0,2 mL klasy PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td></td></tr><tr><td>rurka, błyskawica Sterilin 7 mL polistyren</td><td>Thermo Scientific</td><td>129A</td><td></td></tr><tr><td>lampa, stożkowa (Falcon) 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>lampa, stożkowa (Falcon) 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>rurka, mikrowirówka (Eppendorf) 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>rurka, mikrowirówka (Eppendorf) 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.700</td><td></td></tr><tr><td>rurka, wirowanie S100&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355619</td><td></td></tr><tr><td>rurka, wirowanie S30&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Wirnik o stałym kącie 70Ti</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana wolna od ultraczystej DNazy/RNazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2791</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oksoid</td><td>LP0021T</td><td></td></tr></tbody></table>

udoskonalenie onepot pure oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Refinement of OnePot PURE and Crude Ribosome Production for Reproducible Cell-free Protein Synthesis

Najnowsze osiągnięcia umożliwiły produkcję systemu bezkomórkowego syntezy białek z użyciem elementów rekombinowanych (PURE) w indywidualnych laboratoriach w sposób ekonomiczny i przy mniejszym obciążeniu pracą. Jednak przygotowanie 36 składników białkowych i rybosomu, które tworzą PURE, pozostaje złożonym przedsięwzięciem, z dużym potencjałem na zmienność i błędy. Przedstawiamy szczegółową i zaktualizowaną procedurę produkcji PURE opartą na niedawno opublikowanym protokole OnePot, która obejmuje regulację kilku kluczowych kroków, w szczególności inokulacji hodowli za pomocą zapasów glicerolu o gęstości optycznej (OD), starannego monitorowania wzrostu komórek oraz kontroli końcowych stężeń glicerolu. Stosując to podejście, raportujemy powtarzalne przygotowania PURE od wielu biologicznych replikacji i użytkowników. Protokół ten służy jako punkt odniesienia i punkt wyjścia dla innych laboratoriów do produkcji i rozwiązywania problemów z własnymi systemami PURE, co zwiększa demokratyzację wielu zastosowań, które umożliwia PURE, takich jak budowa systemów biomolekularnych oddolnie czy rozwój syntetycznych komórek.

Przepływ pracy dla PURE i preparatów rybosomowych przedstawiono na Rysunku 1, a zalecany harmonogram pracy w Tabeli 1. Zazwyczaj reakcje monitoruje się poprzez produkcję białek fluorescencjących, takich jak GFP czy mCherry, a odczyty RFU można przeliczyć na stężenia za pomocą kalibracji11. Jednak wydajność CFPS zależy od konkretnego produkowanego białka, dlatego ważne jest zoptymalizowanie systemu, aby wyprodukować poż...

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Recent advances have enabled the Protein synthesis Using Recombinant Elements (PURE) cell-free system to be produced in individual laboratories ...

Udoskonaliliśmy system OnePOT PURE oraz prymitywne przygotowanie rybosomów, aby poprawić powtarzalność i dostępność, umożliwiając większej liczbie laboratoriów budowę i diagnostykę zaawansowanych systemów wolnych komórek do badań biologii syntetycznej. Wyzwania eksperymentalne obejmują zmienność partia do partii, niestabilność wektorów ekspresji oraz wolno rosnące szczepy, co utrudnia powtarzalność i spójną wydajność w przygotowywaniu wewnętrznych systemów PURE. Ustaliliśmy, że dokładna kontrola wzrostu szczepu, szczepienia i stężenia glicerolu znacząco poprawia powtarzalność i wydajność w preparatach OnePOT PURE oraz rybosomów u użytkowników oraz biologicznych replikacji.Zajmujemy się brakiem powtarzalnego, dostępnego protokołu przygotowania PURE i rybosomów we własnym zakresie, pomagając laboratoriom pokonać bariery techniczne i wdrażać samooporność do badań biologii syntetycznej. Nasz protokół poprawia powtarzalność i elastyczność poprzez standaryzację warunków wzrostu i użycia glicerolu oraz usprawnia przygotowanie rybosomów wyłącznie przy użyciu ultrawirówki, unikając bardziej skomplikowanych lub kosztownych metod oczyszczania. Na początek rozmroz zamrożone granulki komórek BL

refinement-onepot-pure-crude-ribosome-production-for-reproducible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zanieczyszczenie preparatów rybosomów eukariotycznych oczyszczonych metodami tradycyjnymi współoczyszczającymi nukleazami i proteazami negatywnie wpływa na późniejsze analizy biochemiczne i strukturalne. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano szybką i prostą metodę oczyszczania chromatograficznego, wykorzystując rybosomy drożdżowe jako system modelowy.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Prezentujemy syntezę hydrożelu białkowego, w którym pośredniczy rozszczepiona inteina. Budulcem tego hydrożelu są dwa kopolimery białkowe, z których każdy zawiera podjednostkę białka trimerycznego, która służy jako środek sieciujący i połowę rozszczepionej inteiny. Zmieszanie dwóch kopolimerów białkowych wyzwala reakcję splicingu trans-inteinowego, w wyniku której powstaje jednostka polipeptydowa, która samoorganizuje się w hydrożel. Ten hydrożel jest wysoce stabilny pod względem pH i...

Synteza sztucznego hydrożelu białkowego za pośrednictwem inteiny

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Poznaj udoskonalony system OnePOT PURE i przygotowanie rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek. Standaryzacja warunków wzrostu i ultrawirówka zwiększają odtwarzalność w syntetycznej biologii.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Przeglądaj więcej filmów