Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili biorą udział w różnych chorobach, w tym chorobach sercowo-naczyniowych. Jednak synergiczny wpływ tworzenia NET i lipoprotein na komórki naczyniowe pozostaje niejasny. Korzystając z tego protokołu, do tej pory trwa analiza mechanistyczna, w jaki sposób reakcje zapalne są indukowane w ludzkich komórkach śródbłonka aorty leczonych pułapkami zewnątrzkomórkowymi neutrofili i lipoproteinami o niskiej gęstości.

Wykazaliśmy, że lipoproteina o dużej gęstości działa jako supresor tworzenia NET. Jest to promowane przez utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości, utlenione fosfolipidy i lizofosfolipidy. Na początek odwiruj od 45 do 50 mililitrów ludzkiej krwi pełnej uzyskanej w probówce z heparyną o sile 700 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Powoli zmniejsz prędkość wirówki po wirowaniu, a następnie zbierz górną warstwę zawierającą frakcję osocza. Odwirować frakcję osocza dwa razy w temperaturze 700 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby całkowicie usunąć krwinki, zachowując to samo ustawienie opóźnienia. Następnie dodaj jeden mikrolitr 250-milimolowego roztworu EDTA na jeden mililitr osocza, aby zapobiec utlenianiu lipoprotein za pośrednictwem jonów metali dwuwartościowych.

Umieść 2,7 mililitra osocza w probówce ultrawirówkowej. Nakładka z 900 mikrolitrami PBS zawierającymi 250 mikromolowych EDTA. Następnie ultraodwirować probówkę o stężeniu 600 000 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć 900 mikrolitrów z górnej warstwy, aby wyeliminować frakcję chylomicron. Dodać 900 mikrolitrów PBS zawierającego EDTA na pozostałą plazmę i ultrawirować w temperaturze 600 000 G przez 2,5 godziny w czterech stopniach Celsjusza. Wyrzuć 900 mikrolitrów górnej warstwy, aby wyeliminować frakcję lipoprotein o bardzo niskiej gęstości.

Następnie dodaj 540 mikrolitrów 0,5 grama na mililitr roztworu bromku potasu do osocza, aby dostosować gęstość do 1,063. Zawartość delikatnie wymieszać za pomocą pipety i ultrawirówki w temperaturze 600 000 G przez 2,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz 540 mikrolitrów górnej warstwy zawierającej lipoproteiny o niskiej gęstości.

Przenieś zebraną frakcję do membrany dializacyjnej i dializuj z dwoma litrami PBS zawierającego EDTA w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby wyeliminować bromek potasu. Dodaj 152 mikrolitry 0,01% polilizyny lub 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka 12-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Następnie usuń roztwór ze studzienek, umyj raz 200 mikrolitrami sterylnej wody i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Przygotowaną płytkę przechowuj w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia. Przygotować płytki pokryte żelatyną, postępując zgodnie z tą samą procedurą, jak w przypadku polilizyny. Hodowla dwa razy dziesięć do mocy sześciu komórek HL60 na 10 mililitrów w pożywce RPMI-1640, uzupełnionej dwoma mikromolowymi kwasami all-trans retinowymi.

Po czterech dniach inkubacji z kwasem all-trans retinowym zbierz komórki HL60. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 220 G przez cztery minuty w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza. Odessać supernatant, a następnie przemyć komórki równą objętością pożywki RPMI-1640 bez surowicy.

Ponownie odwirować umyte komórki w temperaturze 220 G przez cztery minuty w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI-1640 bez surowicy. Po dostosowaniu stężenia komórek do dwa razy dziesięć do mocy sześciu komórek na mililitr, wysiew 0,5 mililitra zawiesiny do każdej studzienki 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej polilizyną. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 300 nanomolowego 12-mirystynianu 13-octanu lub PMA lub bez niego.

Hoduj komórki przez 30 minut. Następnie usuń pożywkę z dołków. Umyj komórki raz pożywką RPMI-1640 bez surowicy i zastąp ją RPMI-1640 bez surowicy zawierającą zero lub 20 mikrogramów na mililitr lipoproteiny o niskiej gęstości.

Kontynuuj hodowlę komórek przez dwie godziny. Zebrać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki do probówki i odwirować przy 700 G przez trzy minuty w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza w celu usunięcia resztek komórkowych. W celu stymulacji uzyskaj hodowlę komórek śródbłonka ludzkiej aorty i zastąp zużytą pożywkę 0,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej i inkubuj komórki przez 30 minut.

Na koniec dodaj 167 mikrolitrów pożywki hodowlanej zebranej z komórek podobnych do neutrofili zawierających zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili i LDL do szalek z ludzkimi komórkami śródbłonka aorty. Stymulacja ludzkich komórek śródbłonka aorty za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych doprowadziła do zależnych od dawki zmian morfologicznych z brukowego na wydłużony. Zmiany morfologiczne w ludzkich komórkach śródbłonka aorty były wzmocnione po stymulacji zewnątrzkomórkowymi pułapkami neutrofili indukowanymi przez LDL, z widocznym wydłużeniem widocznym już po sześciu godzinach.