Name: Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji LDL z osocza ludzkiego i przygotowania pułapek NET do badania odpowiedzi zapalnych w komórkach śródbłonka aorty. Technika ta pozwala analizować synergiczne działanie NET i lipoprotein w chorobach sercowo-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki, KAKENHI (numery grantów 23K10897 i 19K07069). Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Protokół przygotowania LDL został zatwierdzony przez komisję bioetyczną Szkoły Farmacji Uniwersytetu Medycznego Showa (nr 231). Pisemną świadomą zgodę uzyskano zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszyscy uczestnicy dobrowolnie złożyli swoje podpisy pod wnioskiem o udział w tym badaniu. Komórki manipulowano w sposób aseptyczny za pomocą okapu z przepływem laminarnym. Kryterium włączenia był przedział wiekowy 22-65 lat. Kryteria wykluczenia obejmowały nawyki palenia, istniejące wcześniej choroby sercowo-naczyniowe (takie jak choroba niedokrwienna serca, udar mózgu i choroby tętnic obwodowych), ciężką dysfunkcję wątroby i niekontrolowane stany przewlekłe, w tym cukrzycę, nadciśnienie, dyslipidemię, ciężkie choroby zapalne i nowotwory. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja LDL z ludzkiego osocza
<ol>
	<li>Pobrać pełną krew od zdrowego ochotnika w obecności heparyny przeciwzakrzepowej (10 jednostek/ml).</li>
	<li>Odwirować 45-50 ml ludzkiej krwi pełnej otrzymanej w probówce z heparyną (700 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C). Upewnij się, że powoli zmniejszasz prędkość wirówki. Zebrać górną warstwę zawierającą frakcję osocza.</li>
	<li>Przeprowadzić dwukrotne odwirowanie (700 × g, 15 minut w temperaturze 4 °C) przy tym samym ustawieniu opóźnienia, co w kroku 1.2 w celu wyeliminowania krwinek. Dodaj 1:1,000 objętości 250 mM EDTA (pH 7,4), aby zapobiec utlenianiu lipoprotein za pośrednictwem jonów metali dwuwartościowych.</li>
	<li>Umieścić 2,7 ml osocza w probówce z poliwęglanu o pojemności 4 ml (4 szt.), nałożyć na 900 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 250 μM EDTA (PBS/EDTA) i ultrawirować (600 000 × g, 7 min w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Wyrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować chylomikron. Ułóż 900 μl PBS/EDTA na osoczu i ultrawirówce (600 000 × g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Odrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Ten krok jest ważny, aby zapobiec zanieczyszczeniu LDL innymi frakcjami lipoprotein.</li>
	<li>Dodać 540 μl roztworu o stężeniu 0,5 g/ml KBr, aby dostosować gęstość do d = 1,063, a następnie delikatnie wymieszać pipetą, a następnie ultrawirować (600 000 x g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Zebrać 540 μl wierzchniej warstwy zawierającej LDL. Żółto-pomarańczowa warstwa wskazuje na udaną separację LDL9. Przenieść do membrany dializowej.</li>
	<li>Trzykrotnie dializować frakcję LDL w stosunku do 2 l PBS/EDTA w temperaturze 4 °C w ciemności, aby wyeliminować KBr.</li>
	<li>Przed użyciem przechowywać LDL w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie studzienek pokrytych poli-L-lizyną lub żelatyną
<ol>
	<li>Przygotuj 0,01% roztwór poli-L-lizyny10 , rozcieńczając 0,1% roztwór poli-L-lizyny sterylną wodą, a następnie przefiltruj sterylnym filtrem 0,2 μm. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 152 μl/basenik 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka na 12-dołkowej płytce i inkubować przez co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem do przygotowania NET.</li>
</ol>
3. Przygotowanie studzienek pokrytych żelatyną
<ol>
	<li>Przed użyciem przygotuj 0,1% roztwór żelatyny, rozcieńczając 2% roztwór żelatyny sterylną wodą.</li>
	<li>Dodać 152 μl/basenik 0,1 % roztworu żelatyny do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować przez co najmniej 5 minut11.</li>
	<li>Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Przed użyciem przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Utrzymanie i przygotowanie ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC)
<ol>
	<li>Hodowla pierwotnych HAEC w niepowlekanej kolbie hodowlanej przy użyciu kompletnego podłoża zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów, 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu, 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 22,5 μg/ml heparyny i 0,2 μg/ml hydrokortyzonu, zgodnie ze wskazaniami w instrukcji producenta. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż komórki zlewają się w 70%-80%.</li>
	<li>W celu stymulacji wysiewaj HAEC na 12-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do osiągnięcia zbiegu. Przeprowadź eksperyment między fragmentami 4 i 7.</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek neutrofilopodobnych pochodzących z HL-60, a następnie NET
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki HL-60 za pomocą pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 5% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny, używając naczyń niepoddanych działaniu substancji.</li>
	<li>W celu przygotowania komórek obojętnopodobnych pochodzących z HL-60 należy hodować od 2 × 106 komórek na 10 ml komórek HL-60 przez 4 dni w pożywce RPMI-1640 zawierającej 2 μM kwas all-trans-retinowy (AtRA).</li>
</ol>
6. Przygotowanie sieci NET z LDL
<ol>
	<li>Pobrać komórki HL-60 4 dni po leczeniu 2 μM AtRA. Po różnicowaniu komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, komórki stają się mniejsze.</li>
	<li>Odwirować komory (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C). Odessać supernatant i przemyć komórki równą objętością RPMI-1640 bez surowicy.</li>
	<li>Odwirować komórki (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C), a następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą RPMI-1640 bez surowicy.</li>
	<li>Policz komórki, a następnie ponownie zawieś komórki do 2 × 106 komórek/ml w RPMI-1640 bez surowicy i zamieść 0,5 ml zawiesiny komórek w dołkach 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej poli-L-lizyną. Hodowla przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 300 nM 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) do końcowego stężenia 0 lub 50 nM PMA. Kultura przez 30 min.</li>
	<li>Usuń pożywkę i umyj komórki raz za pomocą RPMI-1640 bez surowicy. Zastąp pożywkę RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 20 μg/ml LDL, a następnie hoduj przez 2 godziny.</li>
	<li>Zebrać pożywkę hodowlaną i odwirować (700 × g, 3 min w temperaturze 18–22 °C) w celu usunięcia resztek komórek.</li>
</ol>
7. Stymulacja HAEC za pomocą NET i LDL
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej. Posiew przez co najmniej 30 minut przed stymulacją.</li>
	<li>Dodać 167 μl pożywki zawierającej NET i LDL (krok 6.7) oraz LDL do szalek HAEC. Sprawdź zmiany morfologiczne w HAEC wywołane po stymulacji przez 12 godzin lub dłużej.</li>
</ol>

<ol><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).</li>
<li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).</li>
<li>Meher, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+IL+%28Interleukin%29-1%CE%B2+in+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).</li>
<li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-specific+deletion+of+Peptidylarginine+Deiminase+4+mitigates+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis.</a> Front Immunol. 9, 1680(2018).</li>
<li>Zhai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+from+activated+vascular+smooth+muscle+cells+drive+the+progression+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis.</a> Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).</li>
<li>Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+modified+by+myeloperoxidase+oxidants+induces+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction.</a> Redox Biol. 13, 623-632 (2017).</li>
<li>Mueller, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+lipoprotein+%28a%29+Isolation+from+a+small+volume+of+plasma+with+applications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research.</a> Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).</li>
<li>Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+redox-cycling+nitroxide+tempol+inhibits+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation.</a> Front Immunol. 3, 391(2012).</li>
<li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+endothelial+cells+induce+neutrophil+extracellular+traps+and+are+susceptible+to+NETosis-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death.</a> FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+action+of+oxidized+low-density+lipoproteins+and+neutrophils+on+endothelial+inflammatory+responses+through+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation.</a> Front Immunol. 10, 1899(2019).</li>
<li>Schröter, J., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorinated+phospholipids+and+fatty+acids%3A+Patho%29physiological+relevance%2C+potential+toxicity%2C+and+analysis+of+lipid+chlorohydrins%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).</li>
<li>Nose, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+perilipin-3+%28TIP47%29+in+formation+of+lipid+droplets+and+PGE2+production+in+HL-60-derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils.</a> PLoS One. 8 (8), e71542(2013).</li>
<li>Manda-Handzlik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+agents+differentiating+HL-60+cells+toward+granulocyte-like+cells+on+their+ability+to+release+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps.</a> Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+suppresses+neutrophil+extracellular+traps+enhanced+by+oxidized+low-density+lipoprotein+or+oxidized+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).</li>
<li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+derived+from+macrophages%2C+mast+cells%2C+eosinophils%2C+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+eosinophils+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease.</a> Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje przygotowanie NET z komórek dHL-60 indukowanych przez współistnienie LDL, które są następnie wykorzystywane do analizy odpowiedzi HAEC. Znaczenie tego protokołu polega na użyciu świeżej pożywki zawierającej NET i LDL do stymulacji komórek, mimo że wiele innych badań wykorzystuje podstawowy roztwór NET zamrożony w temperaturze -20 °C. Ponieważ lipoproteiny są kompleksami lipidowo-białkowymi, ich nienaruszone struktury i cechy są tracone podczas zamrażania i rozmrażania, powodując denaturację i agregac...

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET), wytwarzane przez aktywowane neutrofile po zakażeniu bakteryjnym, a także w niezakaźnych fizjologicznie prawdopodobnych warunkach, uwalniają zdekondensowane DNA i białka, takie jak histony, mieloperoksydaza (MPO) i elastaza neutrofilowa1. Ponieważ składniki te mogą demontować komórki i tkanki brzeżne, powodując uporczywy stan zapalny, tworzenie NET stało się czynnikiem sprawczym w inicjowaniu i postępie różnych ostrych i przewlekłych chorób, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy, cukrzycy, choroby Alzheimera, przerzutów raka i chorób sercowo-naczyniowych2. Analizy histologiczne zmian naczyniowych człowieka w miażdżycy3 i tętniaku aorty brzusznej4 wykazały kolokalizację nacieku neutrofili i tworzenia NET. W krążącej krwi poziomy markerów NETs, takich jak cytrulinowane histony, NET-DNA i MPO, wzrastają wraz z ciężkością choroby wieńcowej5. We wczesnych stadiach miażdżycy tworzenie NET często poprzedza akumulację lipidów, która zachodzi poprzez tworzenie komórek piankowatychprzez makrofagi 6,7. Zjawiska te silnie sugerują, że MPO i enzymy proteolityczne uwalniane zewnątrzkomórkowo podczas tworzenia NET mogą działać nie tylko na tkanki naczyniowe, ale także na składniki krwi, takie jak lipoproteiny. Lipoproteiny to delikatne kompleksy lipidowo-białkowe, które mogą zostać uszkodzone przez białka pochodzące z NET, takie jak MPO8; w związku z tym tworzenie NET może powodować zmiany strukturalne i biochemiczne w lipoproteinach, wpływając w ten sposób na homeostazę naczyń. Jednak synergiczny wpływ tworzenia NET i lipoprotein na dysregulację i reakcje zapalne wywołane przez komórki naczyniowe pozostaje niejasny.
W tym artykule przedstawiono metodę badania odpowiedzi komórkowych ludzkich komórek śródbłonka naczyń krwionośnych indukowanych przez leczenie NET przygotowanymi z komórek podobnych do neutrofili pochodzących z HL-60 i lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) frakcjonowanych z ludzkiego osocza. Reprezentatywne wyniki wskazują na frakcjonowanie LDL z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania oraz odpowiedzi komórkowe ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC) stymulowanych NET po jednoczesnej inkubacji z LDL. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu komórek naczyniowych z udziałem innych lipoprotein.

<table><tbody><tr><td>0,1% poli-L-lizyny</td><td>SigmaAldrich</td><td>Zobacz materiał P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Sokół</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2% żelatyny</td><td>SigmaAldrich</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Rura 4 PC</td><td>Himac powiedział:</td><td>S404332A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas all-trans retinowy</td><td>Wako</td><td>188-01113</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Rurki do dializy celurozowej</td><td>MISUMI Group Inc.</td><td>0327-23-37-07 (UC18-32-100)</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo powiedział:</td><td>345-01865</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Zestaw do pomiaru wzrostu komórek śródbłonka 2</td><td>Komórka promocyjna</td><td>Nr kat. C-22111</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10270-106</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa (5 000 jednostek/5 ml)</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.</td><td></td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości</td><td>TOMY</td><td>Zobacz materiał SRX-201</td><td>Przyspieszenie: 9, Opóźnienie: 7</td></tr><tr><td>ludzkie komórki śródbłonka aorty</td><td>Lonza</td><td>Klasa CC-2535</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>Wako</td><td>168-03475</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopii KEYENCE</td><td>KLUCZ POWIEDZIAŁ:</td><td>Analizator BZ-II</td><td></td></tr><tr><td>Mikro ultrawirówka</td><td>Himac powiedział:</td><td>CS150GX</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia</td><td>OLYMPUS</td><td>Zobacz materiał CK40</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia</td><td>KLUCZ POWIEDZIAŁ:</td><td>BZ-9000</td><td>Do obrazowania poklatkowego (opcja)</td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Nikon</td><td>Skaner DS-Fi3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery mikroskopowej</td><td>Nikon</td><td>Czytnik DS-L4</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140-122 100ML</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (&razy; 10)</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 2,6 g NaH2PO4&middot; 2H2O, 29 g Na2HPO4&middot; 12H2O, 80 g NaCl i 2,0 g KCl w wodzie destylowanej i dostosować do objętości 1 L.&nbsp; (Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę)</td></tr><tr><td>PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)</td><td>Wako</td><td>162-23591</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Pakiet odczynników</td><td>Lonza</td><td>CC-5034 powiedział:</td><td>(CC-5022: Buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES, CC-5012: Trypsyna/EDTA, CC-5002: Roztwór neutralizujący trypsynę)&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirnik</td><td>Himac powiedział:</td><td>S100AT6-0242</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 (z czerwienią fenolową)</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)</td><td>Wako</td><td>186-02155</td><td>Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę</td></tr><tr><td>Kolba T-25</td><td>Corning</td><td>3275</td><td></td></tr></tbody></table>

stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Stimulation of Vascular Endothelial Cells Using Neutrophil Extracellular Traps in the Presence of Low-Density Lipoprotein

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) pojawiły się jako czynniki sprawcze w różnych chorobach niezakaźnych i są związane z zaburzeniami sercowo-naczyniowymi, takimi jak miażdżyca i zakrzepica. Tworzenie NET obserwuje się w ścianie naczynia krwionośnego i istnieją przekonujące dowody na to, że markery powstawania NET w osoczu zwiększają się wraz z nasileniem choroby. Składniki NET pochodzące z neutrofili, w tym mieloperoksydazy i proteazy, wpływają na lipoproteiny osocza i homeostazę naczyń krwionośnych. W tym miejscu opisano szereg metod stymulacji komórek naczyniowych za pomocą NET powstających w obecności lipoprotein o niskiej gęstości (LDL). LDL frakcjonowano z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania. Komórki HL-60 potraktowano kwasem all-trans retinowym w celu różnicowania ich w komórki podobne do neutrofili, a następnie stymulowano 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) w celu indukowania tworzenia NET. Po usunięciu i wypłukaniu PMA, komórki były dalej inkubowane z LDL. Pobrane supernatanty zawierające NET i LDL natychmiast wykorzystano do stymulacji ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC). Jako reprezentatywną odpowiedź, zmiana morfologiczna HAEC wywołana leczeniem NET została wzmocniona przez obecność LDL, co sugeruje, że tworzenie NET w połączeniu z LDL wzmacnia odpowiedź HAEC. Metody te są korzystne dla badania wpływu LDL na komórki śródbłonka pod wpływem aktywacji neutrofili i zapalenia związanego z NET, dostarczając w ten sposób nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw chorób sercowo-naczyniowych związanych ze zwiększonym stężeniem LDL w osoczu.

Po usunięciu chylomikronów, a następnie frakcji VLDL z ludzkiego osocza poprzez sekwencyjne ultrawirowanie, ludzkie osocze zmieszano z roztworem KBr w celu dostosowania gęstości do d = 1,063. Na tym etapie pozostały środek strącający nie został całkowicie rozpuszczony w roztworze i uniknięto silnego mieszania, które tworzyło pęcherzyki gazu, aby utrzymać LDL w stanie nienaruszonym. Po ultrawirowaniu LDL został wizualnie oceniony na górnej warstwie na podstawie jego żółto-pomarańczowego koloru9<...

Opisano szereg metod, w tym izolację lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z ludzkiego osocza, różnicowanie komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, przygotowanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w obecności LDL oraz stymulację ludzkich komórek śródbłonka aorty mieszaniną NET i LDL.

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Neutrophil extracellular traps (NETs) have emerged as causative factors in various non-infectious diseases and have been implicated in cardiovascular ...

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili biorą udział w różnych chorobach, w tym chorobach sercowo-naczyniowych. Jednak synergiczny wpływ tworzenia NET i lipoprotein na komórki naczyniowe pozostaje niejasny. Korzystając z tego protokołu, do tej pory trwa analiza mechanistyczna, w jaki sposób reakcje zapalne są indukowane w ludzkich komórkach śródbłonka aorty leczonych pułapkami zewnątrzkomórkowymi neutrofili i lipoproteinami o niskiej gęstości.Wykazaliśmy, że lipoproteina o dużej gęstości działa jako supresor tworzenia NET. Jest to promowane przez utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości, utlenione fosfolipidy i lizofosfolipidy. Na początek odwiruj od 45 do 50 mililitrów ludzkiej krwi pełnej uzyskanej w probówce z heparyną o sile 700 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Powoli zmniejsz prędkość wirówki po wirowaniu, a następnie zbierz górną warstwę zawierającą frakcję osocza. Odwirować frakcję osocza dwa razy w temperaturze 700 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby całkowicie usunąć krwinki, zachowując to samo ustawienie opóźnienia. Następnie dodaj jeden mikrolitr 250-milimolowego roztworu EDTA na jeden mililitr osocza, aby zapobiec utleni

stimulation-vascular-endothelial-cells-using-neutrophil-extracellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Ten film demonstruje in vitro stymulację makrofagów zewnątrzkomórkowych pułapek (MET) u ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów przy użyciu różnych bodźców zapalnych, takich jak TNF-alfa, PMA i HOCL. Film przedstawia również metodę barwienia barwnikiem SYTOX MET w celu wizualizacji.

Stymulacja in vitro i wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Tutaj prezentujemy metodę, w której ludzkie neutrofile o niskiej gęstości (LDN), odzyskane z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej, wytwarzają ogromne pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) i skutecznie zatrzymują wolne komórki nowotworowe, które następnie rosną.

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę izolacji LDL z osocza ludzkiego i przygotowania pułapek NET do badania odpowiedzi zapalnych w komórkach śródbłonka aorty. Technika ta pozwala analizować synergiczne działanie NET i lipoprotein w chorobach sercowo-naczyniowych.

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów