Name: Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj platformę LSIT do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników. Ta metoda obrazowania bez soczewek wykrywa zmiany morfologiczne w ciągu 30 sekund, eliminując potrzebę barwienia i kosztownej cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez Programy Badań Podstawowych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) Korei (Grant#: RS-2024-00353675, Grant#: 2021R1I1A3056109), program wsparcia ITRC (Centrum Badań nad Technologiami Informacyjnymi) nadzorowany przez IITP (Instytut Planowania i Oceny Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych) oraz Agencję Promocji Komercjalizacji Wyników Badań i Rozwoju (COMPA) finansowaną przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (MSIT), Korea (Grant#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), Grant#: 2710084652), program wsparcia Koreańskiego Instytutu Promocji Nauki i Technologii Morskiej (KIMST) finansowany przez Ministerstwo Oceanów i Rybołówstwa, Korea (Grant#: 20210660) oraz Grant Uniwersytetu Koreańskiego. Autorzy dziękują firmie Metaimmunetech Inc. za współpracę, opartą na technologii przeniesionej z Uniwersytetu Koreańskiego, przy opracowywaniu urządzenia Cellytics NK.

Wszystkie badania były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Korea University Anam Hospital (numer zgody: 2021AN0040). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie i postępowanie z próbkami
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami krwi ludzkiej należy obchodzić się przy użyciu standardowych środków bezpieczeństwa biologicznego i odpowiednich środków ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Obwodową krew pełną należy pobrać od pacjenta w sterylnej probówce z heparyną w sposób aseptyczny.</li>
	<li>Delikatnie odwróć probówkę 8-10 razy, aby wymieszać antykoagulant z krwią.</li>
	<li>Próbkę krwi należy przeanalizować natychmiast po pobraniu. Jeśli analiza jest opóźniona, należy przechowywać próbkę w probówce z heparyną w temperaturze 2-8 °C i zużyć w ciągu 48 godzin. UWAGA: Nie zamrażaj krwi pełnej. Użyj świeżych próbek, aby zachować integralność komórkową.</li>
</ol>
2. Izolacja i aktywacja komórek NK
UWAGA: Protokół ten przedstawia zoptymalizowany i kompleksowy przepływ pracy do izolacji i aktywacji komórek NK bezpośrednio z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu zestawu NK Prep, który składa się z zestawu NK Sep do izolacji komórek i zestawu aktywacyjnego NK do stymulacji. Ten zestaw integruje selekcję negatywną i stymulację opartą na kulkach magnetycznych, aby umożliwić szybką ocenę fenotypową za pomocą platformy cytometrii obrazowej bez soczewek.
<ol>
	<li>Konfiguracja przed testem<ol>
		<li>Wyjmij zestawy z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej (15-28 °C). UWAGA: Zestaw NK Sep zawiera następujące elementy: a) Zielona pokrywka: probówka reakcyjna zawierająca koktajl przeciwciał. b) Czerwona pokrywka: Probówka separacyjna 1 zawierająca cząstki magnetyczne w pożywce rozcieńczającej (1,5 ml). (c) Fioletowa pokrywka: Rurka separacyjna 2 zawierająca cząstki magnetyczne. (d) Szara pokrywa: rurka odzyskiwania (czysta i pusta). Zestaw NK Activation zawiera następujące elementy: (a) Pojazd: Osiem przezroczystych tubek w szczelnie zamkniętej aluminiowej torbie. (b) ASC: Osiem żółtych probówek w szczelnie zamkniętej aluminiowej torbie. Wyjmij tylko wymagane probówki z zapieczętowanych worków. Ponownie zamknij i wstaw do lodówki wszelkie niewykorzystane elementy.</li>
		<li>Przygotuj niezbędny sprzęt: separator magnetyczny, pipety ze sterylnymi końcówkami oraz skalibrowany inkubator lub blok grzewczy ustawiony na 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura izolacji komórek NK<ol>
		<li>Dodaj 0,5 ml krwi pełnej do probówki reakcyjnej z zieloną nasadką zawierającą koktajl przeciwciał. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówkę 2-3 razy i inkubuj przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść całą zawartość do probówki rozdzielającej 1 z czerwoną nakrętką. Wymieszaj delikatnie 2-3 razy.</li>
		<li>Umieścić probówkę na separatorze magnetycznym i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Z założonym magnesem przenieś około 1,5 ml supernatantu do rurki separatora 2 z fioletową nakrętką. Wymieszaj delikatnie 2-3 razy.</li>
		<li>Umieść probówkę separacyjną dwie na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 10 minut.</li>
		<li>Trzymając magnes nadal podłączony, przenieś około 1,0 ml supernatantu do probówki regeneracyjnej z szarą pokrywką. Dokładnie wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja komórek NK<ol>
		<li>Dodać 100 μl wyizolowanej zawiesiny komórek NK do probówki pojazdu i kolejne 100 μl do probówki ASC</li>
		<li>Ostrożnie wymieszaj zawartość dwóch probówek.</li>
		<li>Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. UWAGA: Użyj skalibrowanego bloku grzewczego, aby utrzymać stałą temperaturę inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie i analiza za pomocą platformy LSIT
UWAGA: Komórki należy analizować natychmiast po inkubacji. Jeżeli natychmiastowa analiza nie jest możliwa, należy przechowywać inkubowane komórki w temperaturze 2-8 °C i przeanalizować je w ciągu 6 godzin. Platforma LSIT ocenia morfologię i liczbę komórek w próbkach krwi ludzkiej za pomocą DIH. Aby przeanalizować aktywność immunologiczną, zarówno niestymulowane, jak i stymulowane przez ASC komórki NK zostały załadowane na specjalny szkiełko, włożone do urządzenia i automatycznie zobrazowane.
<ol>
	<li>Konfiguracja i kalibracja urządzenia UWAGA: Zawsze wykonuj kalibrację tła przed analizą próbki.<ol>
		<li>Włącz platformę LSIT. Upewnij się, że dioda LED, wentylator i kamera działają.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie LSIT Capture . Zaloguj się, podając swój identyfikator i hasło.</li>
		<li>Przejdź do Ustawień i wybierz Kalibruj.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Otwórz na ekranie dotykowym lub użyj fizycznego przycisku drzwi przesuwnych, aby otworzyć drzwi. Gdy szuflada się otworzy, wyjmij szkiełko kalibracyjne i schowaj je.</li>
		<li>Upewnij się, że nie ma szkiełka testowego. Zamknij szufladę. UWAGA: Do czyszczenia powierzchni szkiełek należy używać wyłącznie chusteczek optycznych.</li>
		<li>Kliknij Ustaw tło , aby skalibrować intensywność optyczną.</li>
		<li>Załóż suwak kalibracyjny i zamknij szufladę.</li>
		<li>Kliknij Rozpocznij kalibrację. UWAGA: W przypadku rozlania płynu na urządzenie należy je natychmiast wyłączyć. Wytrzyj go do czysta. Nie demontuj urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i ładowanie szkiełek testowych<ol>
		<li>Wyjmij szkiełko testowe z torebki, oznacz je danymi próbki i umieść na czystej, płaskiej powierzchni.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl próbki z nośnika (niestymulowanej) do kanałów A i B.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl próbki stymulowanej ASC do kanałów C i D. UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków i przepełniania.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Otwórz , aby wysunąć szufladę, wyjmij szkiełko kalibracyjne i umieść je w schowku.</li>
		<li>Włóż przygotowany szkiełko testowe i naciśnij Zamknij.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu: Menu testowe 1 - Aktywność komórek NK UWAGA: Jeśli akwizycja obrazu nie powiedzie się, sprawdź oświetlenie i objętość próbki. W razie potrzeby należy przeprowadzić ponowną kalibrację.<ol>
		<li>Zaloguj się do systemu LSIT i wybierz Test Aktywności Komórek NK na ekranie głównym.</li>
		<li>Wprowadź identyfikator próbki lub użyj skanera kodów kreskowych. UWAGA: Aby pobrać identyfikator próbki z listy zarchiwizowanych, użyj przycisku Pobierz.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Przechwyć, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
		<li>Po przechwyceniu obrazu kliknij Analizuj</li>
		<li>Sprawdź aktywność komórek NK (%) i liczbę komórek wyświetlaną na ekranie. UWAGA: Prawidłowe wyniki są wyświetlane numerycznie. Jeśli I3 znajduje się poniżej zakresu, wyświetlany jest komunikat "≤100%". Powyżej zakresu wyświetlany jest komunikat ">300%".</li>
		<li>Pobierz wyniki na dysk USB lub wydrukuj je za pomocą menu na ekranie dotykowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu: Menu testowe 2 - zliczanie komórek<ol>
		<li>Wybierz opcję Zliczanie komórek w menu Test 2 w głównym interfejsie.</li>
		<li>Załadować 10 μl próbki do nowego kanału szkiełka testowego.</li>
		<li>Włóż suwak, zamknij szufladę i wprowadź identyfikator próbki.</li>
		<li>W stosownych przypadkach podać współczynnik rozcieńczenia.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Liczba. UWAGA: Jeśli wynik mieści się w zakresie testowym, liczba komórek NK jest wyświetlana jako wartość liczbowa na ekranie systemu. W przypadku wyników poniżej zakresu testowego wyświetlany jest komunikat "≤ 10 komórek/μl", a w przypadku wyników powyżej "> 1,000 komórek/μl".</li>
		<li>Wyświetlaj wyniki w postaci komórek/μl. UWAGA: Przełącz czarne pole wyniku, aby wyświetlić rzeczywistą liczbę komórek na obrazach.</li>
		<li>Przejrzyj wyniki i pobierz je lub wydrukuj. UWAGA: Upewnij się, że wprowadzono prawidłowy współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać dokładne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Czyszczenie po analizie
<ol>
	<li>Otwórz szufladę za pomocą przycisku Otwórz lub fizycznego przełącznika.</li>
	<li>Wyjmij zużyty suwak.</li>
	<li>Umieść suwak kalibracyjny z powrotem w szufladzie, aby chronić czujnik.</li>
	<li>Zamknij szufladę.</li>
	<li>Zużyte tuby, końcówki i szkiełka należy utylizować zgodnie z przepisami dotyczącymi odpadów laboratoryjnych.</li>
</ol>

I.L., S.H., H.S.J. i S.S. są powiązane z Metaimmunetech Inc., firmą zaangażowaną w rozwój i komercjalizację platformy LSIT przedstawionej w tym badaniu. W szczególności H.S.J. jest założycielem i dyrektorem generalnym, S.H. jest dyrektorem generalnym, a S.S. jest dyrektorem technicznym firmy. Autorzy twierdzą jednak, że wyniki i interpretacje zawarte w tym manuskrypcie są przedstawione obiektywnie i nie mają na nie wpływu żadne interesy komercyjne. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten przedstawia znormalizowaną, bezznacznikową metodę ilościowego oznaczania aktywacji komórek NK, która łączy izolację i aktywację komórek przy użyciu zestawu NK Prep Kit z analizą za pośrednictwem platformy LSIT. Stanowi szybką i ilościową alternatywę dla konwencjonalnych testów, takich jak uwalnianie 51Cr, cytometria przepływowa i ELISA. Protokół został opracowany z myślą o laboratoriach wyposażonych w platformę LSIT i zapewnia proste wyniki oparte na analizie obrazu w tle liczby komórek N...

Morfologia komórek staje się kluczowym wskaźnikiem mechanizmów molekularnych. Zapewnia nie tylko wizualną reprezentację struktury komórki, ale także oferuje cenny wgląd w podstawowe procesy i funkcje poszczególnych komórek1. Analiza kształtu, wielkości i aktywności komórek odpornościowych na poziomie pojedynczej komórki dostarcza kluczowych informacji na temat ich zachowania, heterogeniczności i ról w zdrowiu i chorobie 2,3,4,5,6.
Wśród tych kluczowych komórek znajdują się komórki NK (natural killer), które są centralnym składnikiem wrodzonego układu odpornościowego 7,8. Eliminują komórki zakażone wirusem i nowotworowe oraz regulują adaptacyjną odpowiedź immunologiczną poprzez uwalnianie cytokin 9,10,11. Nowotwory, infekcje wirusowe i niedobory odporności często zmniejszają liczbę komórek NK i upośledzają ich funkcje 12,13,14. Dlatego aktywacja komórek NK służy jako ważny biomarker i dostarcza informacji o ogólnym stanie zdrowia układu odpornościowego. W związku z tym szybka jednokomórkowa ocena aktywacji komórek NK jest niezbędna do rokowania, diagnozy, monitorowania choroby i stratyfikacji pacjentów 15,16,17,18.
Obecnie aktywność komórek NK ocenia się na podstawie ich zdolności cytotoksycznej (zdolności do zabijania komórek docelowych) i produkcji cytokin 19,20,21,22. Konwencjonalne metody pomiaru cytotoksyczności za pośrednictwem komórek23, takie jak testy uwalniania chromu-51 (51Cr)24,25, testy cytometrii przepływowej26,27 i testy immunoenzymatyczne (ELISA) w celu ilościowego określenia interferonu gamma (IFN-γ) wydzielanego przez komórki NK po stymulacji 28,29,30 mają kilka ograniczeń. Należą do nich brak standaryzacji, długotrwałe protokoły (np. inkubacja ELISA przez noc), zależność od znakowania komórek oraz wysokie koszty sprzętu 31,32,33. Wyzwania te podkreślają potrzebę innowacyjnych metod, które oferują szybkie wyniki, opłacalność, analizę bez etykietowania i wysoką przepustowość. Ponadto ocena aktywacji komórek NK na poziomie pojedynczej komórki dostarcza szczegółowych informacji na temat niejednorodności populacji i indywidualnych odpowiedzi komórkowych na stymulację.
Wśród pojawiających się technologii mających na celu przezwyciężenie tych ograniczeń, szczególnie skutecznym rozwiązaniem jest technologia obrazowania cieni bez soczewek (LSIT) 34,35,36. LSIT, uproszczona cyfrowa holografia inline (DIH), umożliwia szybką, bezznacznikową, wysokoprzepustową analizę aktywacji komórek NK w rozdzielczościpojedynczej komórki 37,38,39. DIH rejestruje wzorce interferencyjne między rozproszonym światłem laserowym a współliniową wiązką odniesienia na czujniku cyfrowym w celu zrekonstruowania trójwymiarowych (3D) informacji o mikroskopijnych obiektach40,41. LSIT upraszcza to podejście, wykorzystując częściowo spójną diodę LED, mikrootworek i czujnik CMOS do przechwytywania wzorów dyfrakcyjnych (tj. obrazów cieni) komórek 42,43,44,45. Uzasadnienie tej techniki opiera się na obserwacji, że aktywacja komórek odpornościowych często powoduje zmiany morfologiczne, w tym zmiany w wielkości komórki, kształcie, ziarnistości cytoplazmatycznej i strukturze jądrowej 46,47,48,49,50. LSIT jest bardzo wrażliwy na te zmiany, które mają bezpośredni wpływ na wzory dyfrakcyjne 51,52,53.
Opierając się na wrażliwości LSIT na te zmiany morfologiczne i ich wpływie na wzory dyfrakcyjne, protokół ten przedstawia nową metodę szybkiego i dokładnego oznaczania ilościowego liczby komórek NK i aktywności funkcjonalnej na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu platformy Cellytics NK, zwanej dalej platformą LSIT54. Jak pokazano na rysunku 1A, platforma LSIT integruje przetwarzanie, aktywację i obrazowanie w cieniu próbek w kompaktowy wielokanałowy przepływ pracy. Komórki NK wyizolowano z krwi pełnej, stymulowano specjalnie opracowanym koktajlem stymulatora aktywacji (ASC) i załadowano do dedykowanego chipa testowego. ASC indukuje zmiany morfologiczne w komórkach NK w ciągu 1 godziny od ekspozycji, takie jak zwiększony rozmiar komórek i złożoność wewnętrzna, które można precyzyjnie wykryć za pomocą platformy LSIT55,56.
Platforma LSIT wykorzystuje źródło światła LED i czujnik CMOS do uchwycenia wzorów DIH (cieni) poszczególnych komórek (rysunek 1B). Specjalny algorytm następnie analizuje te wzory cieni i wyodrębnia kluczowe parametry, takie jak odległość między szczytami (PPD), która koreluje z rozmiarem komórki, oraz odchylenie standardowe szerokości wtórnego maksimum (WSM-SD), które koreluje ze złożonością i nieregularnością cytoplazmy (Rysunek 1C, D). Porównując wartości przed i po stymulacji, platforma oblicza złożone wskaźniki: połączony parametr cienia (CSP = PPD × WSM-SD) oraz wskaźnik odporności wrodzonej (I³), które odzwierciedlają procentową zmianę CSP po aktywacji. Powodem wprowadzenia CSP jest to, że aktywacja immunologiczna obejmuje zarówno powiększenie komórek, jak i zwiększoną złożoność cytoplazmatyczną. Poleganie tylko na jednym z dwóch kryteriów może spowodować pominięcie aktywacji granicznej lub wpływ hałasu, takiego jak zanieczyszczenia lub nieregularne oświetlenie. CSP poprawia klasyfikację, wymagając spójnych zmian w obu metrykach. Wskaźniki te klasyfikują stany aktywacji różnych populacji komórek bez znakowania fluorescencyjnego lub złożonego przetwarzania próbek.
Protokół ten jest szczególnie przydatny dla badaczy i klinicystów, którzy wymagają szybkiej, ilościowej i bezznacznikowej metody monitorowania zmian morfologicznych w komórkach odpornościowych wywołanych aktywacją. Nadaje się do podstawowych badań immunologicznych, przedklinicznych badań przesiewowych leków i oceny immunoterapii i może być stosowany jako narzędzie diagnostyczne lub prognostyczne w warunkach klinicznych, w których niezbędna jest szybka ocena stanu odporności. Ta metoda wymaga izolowanych populacji komórek, dostępu do platformy LSIT i specyficznego koktajlu aktywacji komórek NK.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml</td><td>AXYGEN (PROCESOR)</td><td>MCT-175-C</td><td>Sterylne, wolne od DNaz/RNaz</td></tr><tr><td>Szkiełko testowe</td><td>Metaimmunetech</td><td>Zobacz materiał AS050-G</td><td>Dedykowana zjeżdżalnia do systemu Cellytics 50 szkiełek w pudełku</td></tr><tr><td>System Cellytics z oprogramowaniem</td><td>Metaimmunetech</td><td>Dokument CS001 powiedział:</td><td>Platforma obrazowania cieni bez soczewek</td></tr><tr><td>Wirówka (wirnik z odchylanym kubełkiem)</td><td>LABOGEN</td><td>1580R</td><td>300&ndash; 500 i razy; Zakres G</td></tr><tr><td>Przetwornik obrazu CMOS</td><td>W zestawie z urządzeniem Cellytics</td><td>Zintegrowany</td><td>Służy do obrazowania dyfrakcyjnego</td></tr><tr><td>Wirówka cytospinowa</td><td>Nasco korea</td><td>Wirówka cyto TXT3</td><td>Do barwienia cytospinowego</td></tr><tr><td>Cyfrowy blok grzewczy (37 &deg; C)</td><td>Daihan Scientific</td><td>DH. WHB00349</td><td>Do inkubacji komórek</td></tr><tr><td>Zestaw ELISA (IFN-&gamma;)</td><td>R& Układ D</td><td>DIF50C</td><td>Ludzki IFN-&gamma; Zestaw ELISA</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Guava easyCyte</td><td>Milipory</td><td>0500-5005</td><td>Do analizy ekspresji CD107a</td></tr><tr><td>Pakiet statystyk Hema 3</td><td>Rybak termiczny</td><td>122-911</td><td>Do barwienia cytospinowego</td></tr><tr><td>IL-12 (rekombinowany człowiek)</td><td>R& Układ D</td><td></td><td>Składnik ASC</td></tr><tr><td>IL-2 (rekombinowany człowiek)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>Składnik ASC</td></tr><tr><td>Stojak do separacji magnetycznej</td><td>Metaimmunetech</td><td>Zobacz materiał M13R8</td><td>Do oddzielania ściegów</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Lotnisko Marienfeld</td><td>1000612</td><td>Do preparatów cytospinowych</td></tr><tr><td>Zestaw aktywacyjny NK</td><td>Metaimmunetech</td><td>MIT2301V, MIT2301A</td><td>Do aktywacji komórek NK</td></tr><tr><td>Zestaw NK Sep</td><td>Metaimmunetech</td><td>MIT2301-500 szt.</td><td>Do izolacji komórek NK</td></tr><tr><td>Mysz PE Anti-Human CD107a, 100test</td><td>BD nauki biologiczne</td><td>555801</td><td>Do analizy ekspresji CD107a</td></tr><tr><td>Przysłona otworkowa</td><td>W zestawie z urządzeniem Cellytics</td><td>Zintegrowany</td><td>Używany w ścieżce oświetlenia LSIT</td></tr><tr><td>Pipety (2&ndash; 20 &mikro; L, 20&ndash; 200 i mikro; L)</td><td>AXYGEN (PROCESOR)</td><td>T-200-Y</td><td>Regulowana głośność</td></tr><tr><td>Suwak kalibracji cieni</td><td>Metaimmunetech</td><td>Zobacz materiał AS050-G</td><td>Do kalibracji urządzenia. 1 szkiełko kalibracyjne w 1 pudełku z szkiełkami testowymi</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>SI-0246A</td><td>Do ponownego zawieszenia</td></tr></tbody></table>

wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek nk bez użycia znaczników

Field-Deployable Lens-Free Imaging Platform for Rapid Label-Free Analysis of Natural Killer Cell Activation

Komórki NK są ważnymi efektorami odporności wrodzonej, które eliminują komórki zakażone wirusem i złośliwe. Monitorowanie aktywności komórek NK jest niezbędne do oceny funkcji układu odpornościowego. Jednak konwencjonalne metody, takie jak cytometria przepływowa, są pracochłonne i czasochłonne. Protokół ten opisuje bezznacznikową technikę szybkiej analizy aktywności komórek NK (Natural Killer) przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek (LSIT). Komórki NK wyizolowane z krwi obwodowej i stymulowane autorskim aktywatorem analizowano za pomocą platformy LSIT w ciągu 5 minut. Platforma LSIT przechwytuje obrazy holograficzne, znane jako obrazy cieni, powstałe w wyniku interferencji światła z komórkami NK i monitoruje ich stan aktywacji poprzez analizę zmian parametrów cienia. Kluczowe parametry uzyskane z obrazów cieni, w tym odległość między szczytami (PPD) i odchylenie standardowe drugorzędnej maksymalnej szerokości (WSM-SD), ilościowo odzwierciedlały morfologię komórki i złożoność wewnętrzną. Parametry te zostały zintegrowane z połączonym parametrem cienia (CSP) i wskaźnikiem odporności wrodzonej (I3), aby zapewnić kompleksową ocenę i kwantyfikację aktywności komórek NK w oparciu o zmiany morfologiczne w komórkach. I3, obliczony jako procentowa zmiana CSP po aktywacji, służył jako bezpośrednia miara aktywności komórek NK. Komórki NK od osób zdrowych konsekwentnie wykazywały znacznie wyższe wartości I3 niż te od osób z obniżoną odpornością. Platforma LSIT umożliwia szybkie i ekonomiczne profilowanie immunologiczne, które jest odpowiednie do diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem.

Zgodnie z tym protokołem platforma LSIT umożliwia ilościową, bezznacznikową ocenę aktywacji komórek NK na podstawie zmian morfologicznych w komórkach. Rycina 2A przedstawia barwione hema-3 preparaty cytospinowe pierwotnych komórek NK od zdrowych dawców po 2-godzinnej inkubacji z ASC lub bez. Aktywacja przez ASC powoduje wyraźne zmiany, przede wszystkim powiększenie komórek i zwiększenie wewnętrznej złożoności lub ziarnistości, w porównaniu z grupą kontrolną z nośnikiem (niestymulowanym). Zmi...

Protokół ten opisuje bezznacznikową metodę szybkiej analizy liczby i aktywności komórek NK (Natural Cell ) bez użycia soczewek przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek. Metoda ta określa ilościowo zmiany morfologiczne w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.

Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników

Natural killer (NK) cells are important effectors of innate immunity that eliminate virus-infected and malignant cells. Monitoring NK cell activity is ...

Naszym celem jest szybka ocena funkcji immunologicznej poprzez ilościowe określenie aktywacji komórek NK w czasie rzeczywistym, przy użyciu obrazowania bez znaczników i soczewek w celu poprawy monitorowania immunologicznego. Wykazaliśmy, że wskaźnik odporności wrodzonej, czyli I3, niezawodnie rozróżnia aktywność komórek NK zdrowych i zdrowych dawców i silnie koreluje z cytokinami i markerami cytometrii przepływowej. Istniejące testy komórek NK wymagają etykiet, nieporęcznych narzędzi i długiego czasu inkubacji.Nasza platforma LSIT wypełnia tę lukę, umożliwiając szybkie, niedrogie i bezetykietowe profilowanie przy użyciu prostej optoelektroniki. Nasza bezznacznikowa platforma LSIT różnicuje aktywację komórek NK na poziomie pojedynczej komórki w ciągu 30 sekund przy użyciu parametrów cienia, eliminując potrzebę barwienia i kosztownej cytometrii przepływowej. Rozszerzymy LSIT o monitorowanie aktywacji limfocytów T i B oraz zintegrujemy algorytmy głębokiego uczenia w celu wysokoprzepustowej klasyfikacji różnych stanów komórek odpornościowych.Na początek wyjmij z lodówki zestawy do izolacji komórek metodą NK i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową od 15 do 28 stopni Celsjusza. Przygotuj wymagany sprzęt, umieszczając separator magnetyczny, pipety ze sterylnymi końcówkami i ustaw inkubator lub blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety dodaj 0,5 mililitra krwi pełnej do probówki reakcyjnej z zieloną nakrętką zawierającej koktajl przeciwciał.Delikatnie wymieszaj zawartość, pipetując w górę i w dół probówki pięć do sześciu razy. Następnie inkubuj probówkę przez pięć minut. Przenieść całą zawartość probówki z zieloną nakrętką do probówki separacyjnej z czerwoną nakrętką za pomocą pipety i delikatnie wymieszać, pipetując probówkę pięć do sześciu razy.Umieść probówkę z czerwoną nakrętką na separatorze magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Utrzymując magnes na miejscu, za pomocą pipety przenieś około 1.5 mililitra supernatantu do drugiej probówki separacyjnej z fioletową nakrętką. Delikatnie wymieszać zawartość, pipetując probówkę pięć do sześciu razy.Teraz umieść probówkę z fioletową nakrętką na separatorze magnetycznym i inkubuj przez 10 minut. Gdy magnes jest nadal na miejscu, przenieś około 1 mililitra supernatantu do probówki regeneracyjnej z szarą pokrywką za pomocą pipety i ostrożnie wymieszaj zawartość, pipetując probówkę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów izolowanej zawiesiny komórek NK do rurki pojazdu i kolejne 100 mikrolitrów do probówki stymulatora aktywacji lub ASC.Delikatnie wymieszaj zawartość obu tubek za pomocą mieszadła wirowego, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Inkubować probówki w bloku grzewczym lub inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Włącz platformę LSIT.Uruchom oprogramowanie do przechwytywania LSIT. Zaloguj się, wprowadzając swój identyfikator i hasło, a następnie wybierz opcję Kalibruj, aby zainicjować tryb kalibracji. Naciśnij przycisk Otwórz na ekranie dotykowym lub użyj fizycznego przycisku drzwi przesuwnych, aby otworzyć szufladę.Gdy szuflada się otworzy, wyjmij szkiełko kalibracyjne i schowaj je. Teraz kliknij Ustaw tło, aby skalibrować intensywność optyczną. Załóż suwak kalibracyjny w szufladzie i zamknij szufladę.Następnie kliknij przycisk Rozpocznij kalibrację, aby zakończyć proces. Wyjąć szkiełko testowe z torebki. Oznacz go przykładowymi danymi przed umieszczeniem go na czystej, płaskiej powierzchni.Odpipetować 10 mikrolitrów próbki pojazdu do kanałów A i B, a następnie pipetować 10 mikrolitrów próbki stymulowanej ASC do kanałów C i D. Teraz naciśnij przycisk Otwórz, aby wysunąć szufladę. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i umieść je w pudełku do przechowywania. Włóż przygotowany szkiełko testowe do szuflady i naciśnij Zamknij, aby je zabezpieczyć.Wróć do menu głównego i wybierz NK Cell Activity and Test z ekranu głównego. Wprowadź identyfikator próbki lub zeskanuj kod kreskowy, aby załadować profil próbki. Następnie naciśnij Przechwyć, aby rozpocząć nagrywanie obrazu.Po przechwyceniu obrazu kliknij Analizuj, aby rozpocząć przetwarzanie. Przejrzyj procent aktywności komórek NK i liczbę komórek wyświetlanych na ekranie. Pobierz wyniki na dysk USB lub wydrukuj je za pomocą menu na ekranie dotykowym.Wybierz opcję Cell Counting and Test (Zliczanie komórek) i Test (Test) w głównym interfejsie LSIT. Załadować 10 mikrolitrów nowej próbki na świeży kanał szkiełkowy do testu za pomocą pipety. Włóż prowadnicę do szuflady.Zamknij szufladę za pomocą ekranu dotykowego lub przycisku i wprowadź identyfikator próbki w systemie. Wprowadź współczynnik rozcieńczenia na ekranie dotykowym, jeśli ma to zastosowanie, i naciśnij Zliczanie, aby rozpocząć kwantyfikację komórek. Wyświetl wyniki wyświetlane na ekranie jako komórki na mikrolitr.Po analizie otwórz szufladę, naciskając przycisk Otwórz lub przełączając przełącznik fizyczny. Wyjmij zużytą prowadnicę z szuflady za pomocą rękawiczek. Na koniec umieść suwak kalibracyjny z powrotem w szufladzie, aby chronić czujnik i zamknij szufladę za pomocą ekranu dotykowego lub fizycznego przełącznika.Platforma LSIT ze zintegrowanym oprogramowaniem oceniła ilościowo aktywację komórek NK, porównując wartości CSP aktywowanych i niestymulowanych komórek kontrolnych. Do sprawozdania na temat odporności dołączyła skróconą tabelę statystyczną. Stymulacja ASC wywołała wyraźne zmiany morfologiczne w komórkach NK, w tym zwiększony rozmiar i złożoność cytoplazmatyczną, co zaobserwowano w cytospinach barwionych Hema 3 po 30 minutach i dwóch godzinach.Obrazy cieni wykazały, że komórki stymulowane przez ASC miały widocznie bardziej złożone wzory dyfrakcyjne w porównaniu z kontrolami pojazdu, z wyodrębnionymi parametrami wskazującymi na zwiększoną odległość między szczytami, ziarnistość cytoplazmatyczną i połączony parametr cienia. Połączone wartości parametrów cienia pozwoliły na jasną klasyfikację między zdrowymi dawcami a pacjentami z rakiem, przy minimalnym nakładaniu się rozkładów pojedynczych komórek aktywowanych i nieaktywowanych komórek NK. Zdrowi dawcy wykazywali istotnie wyższe wartości wskaźnika odporności wrodzonej niż pacjenci z rakiem po stymulacji ASC.

field-deployable-lens-free-imaging-platform-for-rapid-label-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.

Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii świetlnej w kratach, aby zobrazować interakcje między żywymi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda polega na skupieniu ultracienkiego arkusza światła sieciowego na oddziałującej parze komórek w celu uzyskania serii dwuwymiarowych obrazów, które są łączone w celu uzyskania czterowymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, które ujawniają czasoprzestrzenną dynamikę interakcji komórka-komórka.

Mikroskopia świetlna w sieci do wizualizacji interakcji receptor-ligand w żywych komórkach

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Opisujemy protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiary tomogram 3D indeksu refrakcji limfocytów prezentują informacje morfologiczne i biochemiczne 3D dla poszczególnych komórek, które są następnie analizowane za pomocą algorytmu uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek.

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Poznaj platformę LSIT do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników. Ta metoda obrazowania bez soczewek wykrywa zmiany morfologiczne w ciągu 30 sekund, eliminując potrzebę barwienia i kosztownej cytometrii przepływowej.

Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników

Przeglądaj więcej filmów