Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników
8 sierpnia 2025
Protokół ten opisuje bezznacznikową metodę szybkiej analizy liczby i aktywności komórek NK (Natural Cell ) bez użycia soczewek przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek. Metoda ta określa ilościowo zmiany morfologiczne w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.
Naszym celem jest szybka ocena funkcji immunologicznej poprzez ilościowe określenie aktywacji komórek NK w czasie rzeczywistym, przy użyciu obrazowania bez znaczników i soczewek w celu poprawy monitorowania immunologicznego. Wykazaliśmy, że wskaźnik odporności wrodzonej, czyli I3, niezawodnie rozróżnia aktywność komórek NK zdrowych i zdrowych dawców i silnie koreluje z cytokinami i markerami cytometrii przepływowej. Istniejące testy komórek NK wymagają etykiet, nieporęcznych narzędzi i długiego czasu inkubacji.
Nasza platforma LSIT wypełnia tę lukę, umożliwiając szybkie, niedrogie i bezetykietowe profilowanie przy użyciu prostej optoelektroniki. Nasza bezznacznikowa platforma LSIT różnicuje aktywację komórek NK na poziomie pojedynczej komórki w ciągu 30 sekund przy użyciu parametrów cienia, eliminując potrzebę barwienia i kosztownej cytometrii przepływowej. Rozszerzymy LSIT o monitorowanie aktywacji limfocytów T i B oraz zintegrujemy algorytmy głębokiego uczenia w celu wysokoprzepustowej klasyfikacji różnych stanów komórek odpornościowych.
Na początek wyjmij z lodówki zestawy do izolacji komórek metodą NK i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową od 15 do 28 stopni Celsjusza. Przygotuj wymagany sprzęt, umieszczając separator magnetyczny, pipety ze sterylnymi końcówkami i ustaw inkubator lub blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety dodaj 0,5 mililitra krwi pełnej do probówki reakcyjnej z zieloną nakrętką zawierającej koktajl przeciwciał.
Delikatnie wymieszaj zawartość, pipetując w górę i w dół probówki pięć do sześciu razy. Następnie inkubuj probówkę przez pięć minut. Przenieść całą zawartość probówki z zieloną nakrętką do probówki separacyjnej z czerwoną nakrętką za pomocą pipety i delikatnie wymieszać, pipetując probówkę pięć do sześciu razy.
Umieść probówkę z czerwoną nakrętką na separatorze magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Utrzymując magnes na miejscu, za pomocą pipety przenieś około 1.5 mililitra supernatantu do drugiej probówki separacyjnej z fioletową nakrętką. Delikatnie wymieszać zawartość, pipetując probówkę pięć do sześciu razy.
Teraz umieść probówkę z fioletową nakrętką na separatorze magnetycznym i inkubuj przez 10 minut. Gdy magnes jest nadal na miejscu, przenieś około 1 mililitra supernatantu do probówki regeneracyjnej z szarą pokrywką za pomocą pipety i ostrożnie wymieszaj zawartość, pipetując probówkę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów izolowanej zawiesiny komórek NK do rurki pojazdu i kolejne 100 mikrolitrów do probówki stymulatora aktywacji lub ASC.
Delikatnie wymieszaj zawartość obu tubek za pomocą mieszadła wirowego, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Inkubować probówki w bloku grzewczym lub inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Włącz platformę LSIT.
Uruchom oprogramowanie do przechwytywania LSIT. Zaloguj się, wprowadzając swój identyfikator i hasło, a następnie wybierz opcję Kalibruj, aby zainicjować tryb kalibracji. Naciśnij przycisk Otwórz na ekranie dotykowym lub użyj fizycznego przycisku drzwi przesuwnych, aby otworzyć szufladę.
Gdy szuflada się otworzy, wyjmij szkiełko kalibracyjne i schowaj je. Teraz kliknij Ustaw tło, aby skalibrować intensywność optyczną. Załóż suwak kalibracyjny w szufladzie i zamknij szufladę.
Następnie kliknij przycisk Rozpocznij kalibrację, aby zakończyć proces. Wyjąć szkiełko testowe z torebki. Oznacz go przykładowymi danymi przed umieszczeniem go na czystej, płaskiej powierzchni.
Odpipetować 10 mikrolitrów próbki pojazdu do kanałów A i B, a następnie pipetować 10 mikrolitrów próbki stymulowanej ASC do kanałów C i D. Teraz naciśnij przycisk Otwórz, aby wysunąć szufladę. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i umieść je w pudełku do przechowywania. Włóż przygotowany szkiełko testowe do szuflady i naciśnij Zamknij, aby je zabezpieczyć.
Wróć do menu głównego i wybierz NK Cell Activity and Test z ekranu głównego. Wprowadź identyfikator próbki lub zeskanuj kod kreskowy, aby załadować profil próbki. Następnie naciśnij Przechwyć, aby rozpocząć nagrywanie obrazu.
Po przechwyceniu obrazu kliknij Analizuj, aby rozpocząć przetwarzanie. Przejrzyj procent aktywności komórek NK i liczbę komórek wyświetlanych na ekranie. Pobierz wyniki na dysk USB lub wydrukuj je za pomocą menu na ekranie dotykowym.
Wybierz opcję Cell Counting and Test (Zliczanie komórek) i Test (Test) w głównym interfejsie LSIT. Załadować 10 mikrolitrów nowej próbki na świeży kanał szkiełkowy do testu za pomocą pipety. Włóż prowadnicę do szuflady.
Zamknij szufladę za pomocą ekranu dotykowego lub przycisku i wprowadź identyfikator próbki w systemie. Wprowadź współczynnik rozcieńczenia na ekranie dotykowym, jeśli ma to zastosowanie, i naciśnij Zliczanie, aby rozpocząć kwantyfikację komórek. Wyświetl wyniki wyświetlane na ekranie jako komórki na mikrolitr.
Po analizie otwórz szufladę, naciskając przycisk Otwórz lub przełączając przełącznik fizyczny. Wyjmij zużytą prowadnicę z szuflady za pomocą rękawiczek. Na koniec umieść suwak kalibracyjny z powrotem w szufladzie, aby chronić czujnik i zamknij szufladę za pomocą ekranu dotykowego lub fizycznego przełącznika.
Platforma LSIT ze zintegrowanym oprogramowaniem oceniła ilościowo aktywację komórek NK, porównując wartości CSP aktywowanych i niestymulowanych komórek kontrolnych. Do sprawozdania na temat odporności dołączyła skróconą tabelę statystyczną. Stymulacja ASC wywołała wyraźne zmiany morfologiczne w komórkach NK, w tym zwiększony rozmiar i złożoność cytoplazmatyczną, co zaobserwowano w cytospinach barwionych Hema 3 po 30 minutach i dwóch godzinach.
Obrazy cieni wykazały, że komórki stymulowane przez ASC miały widocznie bardziej złożone wzory dyfrakcyjne w porównaniu z kontrolami pojazdu, z wyodrębnionymi parametrami wskazującymi na zwiększoną odległość między szczytami, ziarnistość cytoplazmatyczną i połączony parametr cienia. Połączone wartości parametrów cienia pozwoliły na jasną klasyfikację między zdrowymi dawcami a pacjentami z rakiem, przy minimalnym nakładaniu się rozkładów pojedynczych komórek aktywowanych i nieaktywowanych komórek NK. Zdrowi dawcy wykazywali istotnie wyższe wartości wskaźnika odporności wrodzonej niż pacjenci z rakiem po stymulacji ASC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje bezetykietową metodę szybkiej analizy pojedynczych komórek w celu oznaczenia liczby i aktywności komórek NK (natural killer) z wykorzystaniem technologii obrazowania cieni bezsoczewkowego. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie zmian morfologicznych w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Technologia obrazowania
Wstęp
- Obecne testy komórek NK wymagają znakowania i czasochłonnych procesów.
- Istniejące metody często wiążą się z użyciem nieporęcznych instrumentów i długim czasem inkubacji.
- Istnieje zapotrzebowanie na szybkie i przystępne cenowo techniki monitorowania odporności.
- Obrazowanie bezsoczewkowe może usprawnić ocenę funkcji odpornościowej.
Cel badania
- Szybka ocena funkcji odpornościowej poprzez ilościowe określanie aktywacji komórek NK w czasie rzeczywistym.
- Zastosowanie metody bezetykietowej do profilowania komórek NK.
- Różnicowanie aktywności komórek NK pomiędzy zdrowymi a obciążonymi immunologicznymi dawcami.
Zastosowane metody
- Technologia obrazowania cieni bez użycia soczewek (LSIT).
- Komputerowa analiza wzorów dyfrakcyjnych.
- Monitorowanie aktywacji komórek NK w czasie rzeczywistym.
- Integracja algorytmów głębokiego uczenia w celu klasyfikacji stanów komórek odpornościowych.
Główne wyniki
- Metoda LSIT pozwala na odróżnienie aktywacji komórek NK na poziomie pojedynczej komórki w ciągu 30 sekund.
- Wskaźnik odporności wrodzonej (I3) koreluje z poziomem cytokin oraz markerami z cytometrii przepływowej.
- Wyeliminowanie barwienia i kosztownej cytometrii przepływowej zwiększa wydajność procesu.
- Potencjał do rozszerzenia zastosowania LSIT w celu monitorowania aktywacji limfocytów T i B.
Wnioski
- Platforma LSIT oferuje szybką, przystępną cenowo i bezetykietową metodę profilowania.
- Metoda ta zwiększa możliwości monitorowania odpowiedzi immunologicznej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować wysokoprzepustową klasyfikację różnych stanów komórek odpornościowych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka, bezznakowa kwantyfikacja aktywacji komórek NK z wykorzystaniem technologii obrazowania cieni bezsoczewkowego (LSIT) rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w ocenie funkcji immunologicznych w badaniach translacyjnych i przedklinicznych. Dzięki umożliwieniu ilościowego profilowania immunologicznego w czasie rzeczywistym, bez konieczności barwienia lub zastosowania cytometrii przepływowej, platforma ta zwiększa pewność prognostyczną i efektywność operacyjną w kluczowych punktach zwrotnych odkryć i walidacji. Podejście to wspiera skalowalne monitorowanie odpowiedzi immunologicznej, ułatwiając podejmowanie decyzji portfelowych skorygowanych o ryzyko w badaniach i rozwoju (R&D) zorientowanych na immunologię.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościowe badanie aktywacji komórek NK jako funkcjonalnego odczytu immunologicznego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnienie odpowiedzi dawców zdrowych od osób z niedoborem odporności.
- Zapewnia szybkie dane bez konieczności znakowania, co pozwala na walidację celów i badania mechanistyczne.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie angażowania szlaków immunologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne wskaźniki aktywacji pojedynczych komórek, odpowiednie do opracowywania testów.
- Skraca czas realizacji testów poprzez wyeliminowanie barwienia i potrzeby stosowania złożonej aparatury.
- Umożliwia wysokoprzepustowe profilowanie komórek odpornościowych w ramach procesów przesiewowych związków chemicznych.
- Wspiera skalowalność platformy oraz możliwość jej ponownego wykorzystania dla różnych typów komórek odpornościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wskaźników aktywacji odpornościowej z funkcjonalnymi punktami końcowymi istotnymi dla choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczny monitoring odpowiedzi odpornościowej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościową ocenę funkcji odpornościowej.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów odporności wrodzonej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma LSIT integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, dostarczając szybkich, ilościowych danych dotyczących aktywacji komórek odpornościowych, które wspierają zarówno wczesną walidację celów, jak i późniejsze badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar aktywacji komórek NK w czasie rzeczywistym.
- Przesiewy: Oferuje powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testów opartych na komórkach odpornościowych.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych, takich jak wskaźnik odporności wrodzonej (I3) oraz połączony parametr cienia (CSP), umożliwiając rzetelne porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną za pomocą profilowania immunologicznego istotnego dla danej choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Zapewnia skalowalną platformę bez użycia znaczników, którą można dostosować do dodatkowych typów komórek odpornościowych i testów funkcjonalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie funkcji odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia przepływy pracy dzięki standaryzacji, szybkiemu czasowi realizacji i minimalnemu przygotowaniu próbek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od pracochłonnych analiz.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów skoncentrowanych na immunologii.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji komórek odpornościowych i ilościowej analizie obrazu.
- Zależna od dostępu do aparatury LSIT i zintegrowanego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania próbek i interpretacji danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek odpornościowych poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczona koniecznością stosowania zastrzeżonych aktywatorów i odczynników specyficznych dla danej platformy.
