Name: Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj metodę ilościowej identyfikacji pochłaniania kwasów tłuszczowych w komórkach śródbłonka naczyniowego przy użyciu fluorescencyjnych analogów BODIPY. Ta technika pozwala badać metabolizm lipidów i potencjalne cele terapeutyczne chorób metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tanisha Choudhury została sfinansowana z letniego stypendium badawczego dla studentów licencjackich z Office for Undergraduate Research na University of North Carolina at Chapel Hill. Boa Kim był wspierany przez NHLBI (R56HL162660) i AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim był wspierany przez Faculty Research Fund Union College.

Wszystkie komórki śródbłonka pochodzącego od człowieka (HUVEC) użyte w tym badaniu zostały pozyskane z komercyjnie dostępnych, anonimowych źródeł zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i dostawcami dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkich materiałów biologicznych. Wszystkie etapy wykonuj w sterylnym środowisku pod laminarnym kapturem. Zobacz Tabelę Materiałów , aby znaleźć listę wszystkich odczynników i sprzętu.
1. Powłoka żelatynowa na płytce 96-dołkowej
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 0,1%, rozcieńczając 25 mL 2% zapasu żelatynowego w 500 mL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i sterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego 0,2 μm (lub autoklawu).</li>
	<li>Dodaj 100 μL żelatyny 0,1% na dołek do czarnej, przezroczystej płyty z 96 dołkami.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut lub najlepiej przez noc.</li>
</ol>
2. Siewowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesinę pojedynczolowej EC w kompletnym nośniku.<ol>
		<li>Przygotuj kompletne podłoże, uzupełniając odpowiedni podłoże bazalne o 10% surowicy płodowej bydła i 1% penicyliny/streptomycyny (w obu przypadkach w dołku). UWAGA: Ośrodek bazalny różni się w zależności od konkretnego typu komórki; w tym badaniu dla komórek HUVEC i EA.hy926 zastosowano odpowiednio ośrodek wzrostu śródbłonka śródbłonkowego (EGM-2) oraz zmodyfikowane medium Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipeta włóż 100 μL zawiesiny komórkowej do każdej studni z gęstością zasiewną, która pozwala komórkom osiągnąć zbieg do następnego dnia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i aplikacja odczynników do obróbki
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki w dwuwartościanowym PBS (z Ca2+ i Mg2+) i podgrzej do 37 °C.<ol>
		<li>Przygotuj 3-HIB (pozytywną kontrolę) jako roztwór roboczy o pojemności 20 mM. Rozpuszcz roztwór bulwarowy w temperaturze 1 M w wodzie podwójnie destylowanej i przechowuj w 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj laktan (pozytywna kontrola) jako roztwór roboczy o pojemności 20 mM. Rozpuszcz roztwór bulwarowy w temperaturze 1 M w wodzie podwójnie destylowanej i przechowuj w 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj niklosamid (kontrolę negatywną) w końcowym stężeniu 1 μM. Rozpuszcz roztwór zapasowy w stężeniu 10 mM w DMSO. Zawieraj mniejsze objętości, aby uniknąć cyklu zamarzania i rozmrażania, i przechowywaj w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki raz podgrzanym dwuwartościowym PBS.</li>
	<li>Dodaj 50 μL odpowiedniego odczynnika leczniczego na dołek (3-HIB, mleczan lub niklosamid) i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut (w przypadku niklosamidu) lub 60 minut (w przypadku 3-HIB i mleczanu).</li>
</ol>
4. BODIPY-FA: złożone przygotowanie i zastosowanie BSA
<ol>
	<li>Przygotuj kompleksy BODIPY-FA: BSA w stężeniach końcowych 0,5 μM, 1 μM lub 2 μM w PBS, stosując molowy stosunek 2:1 FA:BSA. Dla roztworu bodipy-fa o pojemności 2 μM inkubuj z 1 μM wolnym od FA BSA w PBS. Dla 1 μM BODIPY-FA używaj 0,5 μM BSA i tak dalej. Zawsze chroń kompleksy przed światłem podczas inkubacji.</li>
	<li>Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 50 μL kompleksu do oczyszczonych studni. UWAGA: Używaj tylko środkowych 10 kolumn, aby uniknąć efektów krawędzi. Zarezerwuj zewnętrzne kolumny jako regulatory autofluorescencji, dodając do tych studni jedynie PBS.</li>
	<li>Inkubuj płytkę w 37 °C przez 1 minutę, 5 lub 10 minut.</li>
</ol>
5. Hartowanie fluorescencji i wykrywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych
<ol>
	<li>Przygotuj 1 μM BSA wolnego od FA w PBS jako bufor płukania i podgrzej do 37 °C.</li>
	<li>Usuń BODIPY-FA: BSA i dwukrotnie umyj całą płytę 50 μL podgrzanego 1 μM wolnego od FA BSA w PBS. Każde mycie wykonuj przez 1,5 minuty.</li>
	<li>Dodaj 50 μL 0,08% Trypan Blue, aby ograniczyć fluorescencję zewnątrzkomórkową.</li>
	<li>Natychmiast zmierz fluorescencję wewnątrzkomórkową za pomocą czytnika mikropłytek o następujących ustawieniach: Wzbudzenie: 488 nm, Emisja: 515 nm, Cutoff: 495 nm, Tryb: odczyt od dołu. UWAGA: W kroku 4 odejmij tło autofluorescencji za pomocą zewnętrznych kolumnowych dołków zawierających komórki, które nie były traktowane BODIPY-FA.</li>
</ol>
6. Barwienie jądrowe Hoechsta dla normalizacji komórek
<ol>
	<li>Usuń roztwór Trypan Blue i delikatnie przemyj PBS. UWAGA: Komórki mogą być nieco delikatne i podatne na łuszczenie się. Zachowaj ostrożność podczas mycia.</li>
	<li>Dodaj 4 μg/mL Hoechst w podłożu 10% i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. UWAGA: Czas inkubacji Hoechst może wymagać optymalizacji. W zależności od typu komórki, może być potrzebne od 5 do 60 minut, aby osiągnąć jednolite oznakowanie jądrowe i odpowiednią intensywność sygnału. Nie dodawaj Hoechst do zewnętrznych kolumn.</li>
	<li>Umyj talerz raz PBS.</li>
	<li>Dodaj świeże PBS i zmierz fluorescencję Hoechst przy następujących ustawieniach: Wzbudzenie: 350 nm, Emisja: 461 nm, Odcięcie: 455 nm, Tryb: odczyt od dołu. UWAGA: Odejmij tło autofluorescencji Hoechst za pomocą zewnętrznych studni kolumnowych.</li>
	<li>Znormalizuj fluorescencję BODIPY-FA do liczby komórek, dzieląc wartości skorygowane autofluorescencją z kroku 5.3 przez odpowiadające wartości Hoechsta uzyskane w kroku 6.4. Używaj wartości koregowanych tłem zarówno dla sygnałów BODIPY, jak i Hoechst. UWAGA: Końcowe wartości reprezentują pobór BODIPY-FA znormalizowany do liczby komórek, skorygowany o autofluorescencję zarówno w kanałach BODIPY, jak i Hoechst.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną dla Rysunku 2 za pomocą dwukierunkowej metody ANOVA, aby ocenić wpływ czasu, koncentracji i ich interakcji. Zastosuj test post hoc Tukey'a do wielu porównań.</li>
	<li>Dla Rysunku 3 i Rysunku 4 użyj niesparowanego dwustronnego testu t Studenta przy porównywaniu dwóch warunków. W eksperymentach obejmujących trzy lub więcej warunków stosuje się jednokierunkową metodę ANOVA, a następnie test Dunnetta dla wielu porównań.</li>
</ol>

<ol><li>Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+across+the+cell+membrane%3A+regulation+by+fatty+acid+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).</li>
<li>He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake%2C+metabolism+and+sensing+of+long-chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).</li>
<li>Mashek, D. G., Coleman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fatty+acid+uptake%3A+the+contribution+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism.</a> Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).</li>
<li>Jang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+branched-chain+amino+acid+metabolite+drives+vascular+fatty+acid+transport+and+causes+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance.</a> Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+B+controls+endothelial+fatty+acid+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake.</a> Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).</li>
<li>Hwangbo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+APLNR+regulates+tissue+fatty+acid+uptake+and+is+essential+for+apelin%27s+glucose-lowering+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects.</a> Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).</li>
<li>Ibrahim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-stimulated+adipocytes+secrete+lactate+to+promote+endothelial+fatty+acid+uptake+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport.</a> J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).</li>
<li>Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis+and+function+in+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium.</a> Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).</li>
<li>Ibrahim, A., Arany, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+endothelium+buffer+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Does endothelium buffer fat.</a> Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).</li>
<li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+lipid+droplets+suppress+eNOS+to+link+high-fat+consumption+to+blood+pressure+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation.</a> J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).</li>
<li>Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+long-chain+fatty+acid+uptake+into+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes.</a> Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).</li>
<li>Watkins, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+13C-labeled+fatty+acids+in+term+human+placental+explants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Fraser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+uptake+in+diabetic+rat+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes.</a> Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).</li>
<li>Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+mitochondrial+ATP+production+regulates+endothelial+fatty+acid+uptake+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport.</a> Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).</li>
<li>Mehling, M., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).</li>
<li>Maiullari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+breast+cancer+dynamics+through+modulable+small+vessel+environment+bioreactor+%28sVEB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB).</a> Biomaterials. 323, 123441(2025).</li>
<li>Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabricating+microfluidic+co-cultures+of+immortalized+cell+lines+uncovers+robust+design+principles+for+the+simultaneous+formation+of+patterned%2C+vascularized%2C+and+stem+cell-derived+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue.</a> Small. , e2501834(2025).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie istnieje konflikt interesów.

Ten test oferuje szybką, ilościową i opłacalną metodę pomiaru pochłaniania FA w EC, wykorzystując format płytek 96-dołkowych oraz fluorescencyjne analogi FA długołańcuchowe. Poprzez integrację zarówno pozytywnych, jak i negatywnych kontrol oraz walidację między pierwotnymi (HUVEC) i uwiecznionymi (EA.hy926) EC, protokół ten wykazuje odporność, powtarzalność i szeroką zastosowalność.
Analizy oparte na fluorescencji odegrały kluczową rolę w odkrywaniu parakrynologicznych regulatorów transportu lipidów śródbłonka, jak wspomniano wcześniejw 4,5,7. Te przykłady pokazują, jak standaryzowany system może nadal niezawodnie wyjaśniać regulację transportu lipidów opartą na metabolitach w kontrolowanym środowisku in vitro. Opisany tutaj protokół ustala kluczowe parametry wiarygodnych pomiarów pobierania FA (FA), w tym stosowanie BODIPY-C12 i BODIPY-C16 w wielu stężeniach (0,5-2 μM) oraz z czasami inkubacji (1 min, 5 min i 10 min). Skutecznie wykrył także zwiększoną absorpcję w odpowiedzi na 3-HIB i mleczan oraz zmniejszoną absorpcję po leczeniu niklosamidem, co potwierdza zarówno jego wrażliwość, jak i zakres dynamiczny. Chociaż jest tu zoptymalizowany pod kątem EC (EC), test ten można łatwo dostosować do innych typów komórek, takich jak adipocyty, myorurki czy hepatocyty, z uwzględnieniem dostosowania do stosunków BODIPY: BSA oraz warunków leczenia. Może być również modyfikowany do obrazowania żywych komórek przy użyciu kompatybilnych płytek lub dostosowany do formatu impuls-chase w celu oceny retencji wewnątrzkomórkowej FA, metabolizmu lub wypływu.
W porównaniu z innymi podejściami, ta metoda oferuje wyraźne zalety: jest skalowalna, ilościowa i adaptowalna do różnych długości łańcuchów FA. Ponadto jest opłacalny, obejmuje tylko kilka kroków i wymaga instrumentów nie bardziej złożonych niż zwykły czytnik mikropłyt, co pozwala nowym użytkownikom, w tym studentom, szybko opanować ten protokół. Wreszcie, w przeciwieństwie do metod opartych na mikroskopii jakościowej lub barwników końcowych, takich jak Oil Red O, które odzwierciedlają skumulowaną zawartość lipidów, protokół ten rejestruje pobieranie FA w czasie rzeczywistym bez konieczności utrwalania czy lizy.
Niemniej jednak należy zauważyć kilka ograniczeń. Zastosowanie dwuwymiarowego systemu statycznej hodowli nie oddaje w pełni złożoności fizjologicznej środowiska naczyniowego. Kluczowe czynniki, takie jak naprężenie ścinające lub lipoliza podlegana LPL, a także interakcje śródbłonkowo-przymięczaszkowe, są nieobecne w tym uproszczonym modelu. Zaawansowane systemy, takie jak mikrofluidyczne lub organoidowe kokultury 3D, lepiej naśladują architekturę in vivo i sygnalizację, choć wymagają większej wiedzy technicznej i infrastruktury16,17. Na przykład mikrofluidyczne bioreaktory zapewniają środowisko, w którym EC mogą naśladować formowanie się mikronaczyń i oddziaływać z innymi typami tkanek, umożliwiając badaczom modelowanie dynamiki parakryny w bardziej fizjologicznych warunkach18. Ponadto najnowsze badania wykazały, że można opracować specjalistyczne systemy do prowadzenia obrazowania fluorescencyjnego na żywo w hodowlach hydrożelowych 3D19. Takie postępy dają pewność, że ten test może zostać pewnego dnia dostosowany do systemów hodowli komórkowych o bardziej reprezentatywnych fizjologicznie, ale konieczna będzie optymalizacja.
Podsumowując, ten test stanowi elastyczną, dostępną i powtarzalną platformę do badania komórkowego pobierania FA w różnych warunkach. Choć najlepiej nadaje się do mechanistycznych badań in vitro , wnioski uzyskane z tego systemu mogą pomóc w przyszłych badaniach z wykorzystaniem bardziej fizjologicznie istotnych modeli transportu lipidów śródbłonka.

Aby składniki odżywcze przenoszone przez krew, takie jak lipidy, dostały się do tkanek metabolicznych, takich jak mięśnie szkieletowe, muszą najpierw przejść przez barierę komórek śródbłonkowych (EC), która tworzy ściany naczyń kapilarnych. Chociaż przez długi czas sądzono, że kwasy tłuszczowe (FA) po prostu dyfundują przez tę barierę, by dotrzeć do tkanek leżących, pojawiające się dowody sugerują, że EC aktywnie regulują ten proces poprzez wyspecjalizowane mechanizmy transportu, które wyewoluowały do przenoszenia hydrofobowych cząsteczek między wodnymi światami pozakomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi1.
We krwi FA występują albo jako wolne kwasy tłuszczowe związane z albuminą (FFA), albo są pakowane w lipoproteiny bogate w trójglicerydy (TRL), takie jak chylomikrony i lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDLs)2. Na powierzchni luminalnej EC lipoproteinowa lipaza (LPL) hydrolizuje TRL, uwalniając FFA do pobierania. W transporcie FA uczestniczy wiele białek, w tym CD36, który faktycznie pobiera FA do komórki; białka transportujące kwasy tłuszczowe (FATP) oraz syntetazy acyl-CoA (ACSL), które pośredniczą w transporcie wektorowym; białka wiążące tłuszcze (FABP), które działają jako lipofilowe chaperony, oraz niezliczone inne, niektóre z nich wciąż nie zostały odkryte i sklasyfikowane 2,3. Tkanka podłoża również wykorzystuje podobne mechanizmy do pochłaniania transportowanego tłuszczu, choć obecne izoformy często różnią się w zależności od typu komórki.
Najnowsze badania wykazały, że EC koordynują się z sąsiednimi komórkami poprzez sygnalizację parakrynoczną, modulując transport FA do tkanek docelowych. Na przykład miocyty szkieletowe wydzielają zbiór czynników parakrynowych, takich jak 3-hydroksyzobutyran (3-HIB), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego B (VEGFB) oraz apelina, aby wspierać transport FA przez pobliskie śródbłonko 4,5,6. Co ciekawe, może być zaangażowany także układ hormonalny, jak to ma miejsce w przypadku insuliny stymulującej adipocyty do uwalniania mleczanu, co również stymuluje EC do pobieraniaFAs 7.
EC działają więc jako modulatorzy bram tłuszczu, co sugeruje, że odgrywają kluczową rolę w zaburzeniach metabolicznych lipidów, takich jak choroby sercowo-naczyniowe czy cukrzyca typu 2. Najnowsze dowody wykazały, że same ECs gromadzą krople lipidowe (LD) w odpowiedzi na przeciążenie tłuszczem, potencjalnie działając jako bufor regulujący dostarczanie kwasów tłuszczowych do tkanek leżącychpod powierzchnią 8,9. W przypadku wysokiego spożycia tłuszczów, jak w przypadku nowoczesnych diet, nadmierne gromadzenie tych LD może przyczyniać się do zaburzeń naczyń i chorób, w tym nadciśnienia10. Ogólnie rzecz biorąc, lepsze zrozumienie, jak EC przyjmują i transportują FA, może dostarczyć nam nowych terapeutycznych metod leczenia chorób przenoszonych przez lipidy.
W niniejszym badaniu opisujemy prosty, szybki i opłacalny test pomiaru pochłaniania FA przez śródbłonek za pomocą fluorescencjowych analogów FA długich łańcuchów BODIPY-C12 i BODIPY-C16. Te odczynniki są stosunkowo tanie i bezpieczne, zwłaszcza w porównaniu z radioaktywnymi lub silnie izotopowymi substancjami FA, które tradycyjnie były używane do pomiaru pobierania tłuszczu przez komórkę11,12. Warto zauważyć, że te odczynniki różnią się od niesprzężonego "wolnego" barwnika BODIPY, który pasywnie gromadzi się w hydrofobowych obszarach komórki, głównie w LDs13. Natomiast sprzężenie BODIPY z alifatycznym łańcuchem FA (np.C12 lubC16) daje cząsteczkę, która strukturalnie naśladuje rodzime długołańcuchowe FA. Ta modyfikacja pozwala na specyficzny pomiar dynamicznego pobierania kwasów tłuszczowych do komórek, zamiast odzwierciedlać wewnątrzkomórkowe magazynowanie lipidów czy tworzenie kropelek.
Kluczową zaletą tego podejścia jest jego elastyczność. Naukowcy mogą wykorzystać inne typy komórek, zmienne czasy inkubacji oraz różne analogi FA sprzężone z BODIPY do badania pobierania zależnego od długości łańcucha, a nawet naturalnie fluorescencyjnych lipidów, takich jak cis-parinaczynowy kwastłuszczowy 14. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewni naukowcom łatwy sposób testowania pochłaniania FA przez komórki w różnych warunkach i utoruje drogę do odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, biologii śródbłonka oraz chorób metabolicznych (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>3-Hydroksizobutyrat (3-HIB)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>26105</td><td>Kontrola dodatnia, końcowe stężenie 5 lub 20 mM</td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta mikropłytka z polistyrenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3603-48EA</td><td>Aby komórki płytkowe mogły być testowane</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Zielone fluorescencyjne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Zielone fluorescencyjne bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9205-50ML</td><td>Wykorzystywane do przygotowania kompleksu Bodipy:BSA</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Rozpuszczalnik dla akcji leków</td></tr><tr><td>Jednorazowe zbiorniki pipetowania</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td>Zawiera różne roztwory do pipetowania na komórki</td></tr><tr><td>Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle' s Medium</td><td>Corning Life Sciences</td><td>10-013-CV</td><td>Nośniki dla komórek EA.hy926</td></tr><tr><td>Komórki EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922&nbsp;</td><td>Uwieczniona linia hybrydowa komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Media dla HUVEC</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodu (FBS) &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>10% suplement w EGM-2 i DMEM</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt fluorescencyjnych</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Każdy czytnik mikropłyt zdolny do pomiarów fluorescencji</td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ml</td><td>Używany do pokrywania płyt w stężeniu 0,1% roboczym</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Hoechst 33342</td><td>Nauki o życiu</td><td>62249</td><td>Barwienie jądrowe dla normalizacji komórek (4 &m; M)</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2519A</td><td>Pierwotne komórki śródbłonka człowieka</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>VWR</td><td>76627-768</td><td>Do pipetowania na płytę 96-dołkową</td></tr><tr><td>Niclosamide &nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3510-50G</td><td>Kontrola ujemna, 1 &mu; M&nbsp; Ostateczna koncentracja</td></tr><tr><td>PBS, z wapniem i magnezem</td><td>Fisher Scientific</td><td>21031CV</td><td>Używany do przygotowywania zabiegów i jako bufor płukania (z BSA)</td></tr><tr><td>PBS, bez wapnia i magnezu</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-508</td><td>Do rozcieńczania żelatyny, barwienia Hoechst i ogólnych myć</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>1% suplementu w EGM-2 i DMEM</td></tr><tr><td>L-mleczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-5G</td><td>Kontrola dodatnia, końcowe stężenie 5 lub 20 mM</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>Stosowany w 0,08% do tłumienia fluorescencji zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Systemy filtrów próżniowych, membrana PES 500ml, 0,45&mikro; m</td><td>GenClone</td><td>25-227</td><td>Aby sterylizować roztwór żelatyny</td></tr></tbody></table>

ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Quantification of Endothelial Fatty Acid Uptake using Fluorescent Fatty Acid Analogs

Komórki śródbłonkowe (EC) odgrywają kluczową rolę w regulacji transportu kwasów tłuszczowych (FA) z krwiobiegu do tkanek metabolicznych, jednak narzędzia do wiarygodnego i skalowalnego pomiaru pobierania EC FA pozostają ograniczone. Przedstawiamy tutaj szybki, ilościowy i opłacalny test mierzący pobieranie FA w EC z wykorzystaniem analogów fluorescencyjnej FA (BODIPY-C12 i BODIPY-C16), które umożliwiają badanie dynamiki pobierania specyficznej dla długości łańcucha w formacie płytek 96-dołkowych. Protokół obejmuje pozytywne (3-hydroksyzobutyran, mleczan) i ujemne (niklosamid) kontrole i jest walidowany zarówno w liniach pierwotnych (HUVEC), jak i uwiecznionych (EA.hy926) w liniach EC. Test wykrywa pochłanianie FA zależne od czasu i dawki, a wyniki są normalizowane do liczby komórek za pomocą barwienia jądrowego Hoechst i korygowane pod kątem tła odpowiednimi kontrolami. Może być adaptowany do różnych typów komórek, metod obrazowania oraz warunków eksperymentalnych, w tym obrazowania z żywymi komórkami oraz formatów impuls-chase. W porównaniu do tradycyjnego barwienia lipidowego lub radioaktywnych znaczników znaczniących, ta metoda oferuje lepsze bezpieczeństwo, szybkość i wszechstronność, jednocześnie rejestrując dynamiczne pobieranie FA w komórkach żywych. Ten test stanowi solidną podstawę do badania regulacji transportu lipidów śródbłonka i jego wkładu w choroby metaboliczne.

Jak pokazano na Rysunku 1, ten test wykorzystuje format płyty 96-dołkowy, gdzie EC są zasiewane bezpośrednio do odwiertów. FAs oznaczane przez BODIPY są sprzężone z albuminą surowicy bydłej (BSA) i stosowane zarówno w studniach eksperymentalnych, jak i kontrolnych. Przed leczeniem FA EC mogą być manipulowane za pomocą farmakologicznych zabiegów lub zaburzeń genetycznych, takich jak transfekcja siRNA czy edycja genów CRISPR. Co istotne, takie manipulacje pozwalają również na zastosowanie odpowiednich pozytywnych i ujemnych kontroli, aby zapewnić wiarygodność testu.
Po inkubacji BODIPY-C12 w stężeniu 0,5 μM, 1 μM i 2 μM przez 1 minutę, 5 minut i 10 minut zarówno w HUVEC, jak i komórkach EA.hy926, zaobserwowano wyraźny, zależny od dawki i czasu zależny od dawki i czasu (Rysunek 2). Aby uwzględnić potencjalne zmiany liczby komórek na dołek, wartości BODIPY-C12 zostały znormalizowane do barwienia jądrowego Hoechsta i zmierzone fluorescencyjnym. Autofluorescencja tła została skorygowana za pomocą studni kontrolnych bez BODIPY i bez Hoechsta.
Aby zweryfikować powtarzalność i zakres testu, znane modulatory metabolizmu kwasów tłuszczowych zostały przetestowane w ECs EA.hy926 z użyciem BODIPY-C12 (Rysunek 3). Leczenie 1-godzinne ze zwiększającym stężeniem mleczanu (0 mM, 5 mM, 20 mM) lub 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) zwiększało pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki, potwierdzając ich rolę jako pozytywnych regulatorów pobierania substancji organicznej. Z kolei wcześniej wykazano, że związek niklosamid może hamować pobieranie kwasów tłuszczowych poprzez rozdzielanie mitochondriów15. Podobne wyniki powtórzono tutaj, ponieważ 30 minut leczenia niklosamidem (1 μM) znacząco zmniejszyło sygnał BODIPY-C12 w porównaniu do kontroli pojazdu, potwierdzając jego użyteczność jako kontroli ujemnej. Chociaż dane te są normalizowane do Hoechst, aby uwzględnić różnice w liczbie komórek, żadne z tych zabiegów nie zmieniło żywotności komórek ani wartości fluorescencji Hoechst.
Aby ocenić adaptacyjność testu do różnych analogów kwasów tłuszczowych, HUVEC-om podano BODIPY-C16, który można uznać za zastępstwo dla bardzo długołańcuchowego kwasu tłuszczowego, a jego przyjmowanie zmierzono po 5-minutowych inkubacjach (Rysunek 4). Zaobserwowano, że leczenie mleczanem (0 mM, 10 mM, 20 mM) zwiększało sygnał BODIPY-C16 w zależności od dawki, podczas gdy niklosamid (1 μM) zmniejszał sygnał, odzwierciedlając wyniki obserwowane w BODIPY-C12.
Podsumowując, ten test umożliwił solidne i powtarzalne określenie wchłaniania FA zarówno w pierwotnych (HUVEC), jak i uwiecznionych (EA.hy926) EC. Ponadto wyniki te pokazują wszechstronność testu w zakresie FA o różnej długości łańcucha, a także potwierdzają ważność zarówno pozytywnych, jak i negatywnych kontroli.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat testu pobierania kwasów tłuszczowych z użyciem kwasów tłuszczowych znakowanych przez BODIPY. Komórki śródlijkowe są zasiewane do czarnej, przezroczystej płytki z 96 dołkami i inkubowane analogami kwasów tłuszczowych sprzężonych z BODIPY, aby umożliwić pobieranie w obrębie. Po inkubacji fluorescencja zewnętrzna jest tłumiona Trypanowym Blue, a sygnał wewnątrzkomórkowy mierzony jest za pomocą odczytu fluorescencyjnego mikropłytkowego czytnika z dołem. Po pomiarze fluorescencji stosuje się barwnik jądrowy Hoechsta w celu ilościowego określenia liczby komórek w celu normalizacji. Leczenie farmakologiczne lub zaburzenia genetyczne mogą być stosowane przed inkubacją BODIPY-FA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Ilościowa analiza pobierania BODIPY-C12 w komórkach śródbłonka pierwotnego i uwiecznionego. (A) Zależny od czasu i koncentracji wzrost pobierania BODIPY-C12 w HUVEC po inkubacji trwającej 1 minę, 5 minut i 10 minut przy 0,5 μM, 1 μM i 2 μM BODIPY-C12 złożonych odpowiednio do 0,25 μM, 0,5 μM i 1 μM wolnego od FA. (B) Komórki EA.hy926 wykazywały podobne, zależne od czasu i dawki pobieranie BODIPY-C12 w identycznych warunkach. Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane są pokazywane jako średnia ± SD. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą dwukierunkowej metody ANOVA, aby ocenić wpływ czasu, koncentracji i ich interakcji, a następnie przeprowadzono test post hoc Tukeya dla wielu porównań. Istotne główne efekty zaobserwowano dla czasu (p < 0,0001), stężenia (p < 0,0001) oraz ich interakcji (p = 0,0443). Statystycznie istotne porównania parowe zidentyfikowane przez test Tukeya są przedstawione na wykresie słupkowym następująco: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Walidacja testu z użyciem pozytywnych i negatywnych kontrol w EA.hy926. (A) 1-godzinne leczenie mleczanem (0 mM, 5 mM, 20 mM) zwiększyło pobieranie BODIPY-C12 w sposób zależny od dawki. (B) 1-godzinne 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) podobnie zwiększono pobieranie FA (HIB). (C) 30-minutowe leczenie niklosamidem (1 μM) istotnie złagodziło pobieranie BODIPY-C12 w porównaniu do kontroli pojazdu (DMSO). Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. We wszystkich eksperymentach inkubowano 2 μM BODIPY-C12 (złożony do 1 μM BSA wolnego od kwasów tłuszczowych) przez 5 minut. Statystyki dla (A) i (B) zostały określone za pomocą jednokierunkowej ANOVA, z testem Dunnetta dla wielu porównań, a dla C za pomocą niesparowanego dwustronnego testu T Studenta. p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Walidacja testu za pomocą BODIPY-C16 w HUVEC. (A) Leczenie mleczanem (0 mM, 10 mM, 20 mM przez 1 godzinę) zwiększa przyjmowanie BODIPY-C16 w zależności od dawki. (B) Leczenie niklosamidem (1 μM przez 1 godzinę) istotnie zmniejszyło sygnał BODIPY-C16 w porównaniu z kontrolą leczoną pojazdem. Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. We wszystkich eksperymentach inkubowano 2 μM BODIPY-C16 (złożony do 1 μM BSA bez kwasów tłuszczowych) przez 5 minut. Statystyki dla (A) zostały wyznaczone za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem Dunnetta dla wielu porównań, a dla B za pomocą niesparowanego dwustronnego testu T Studenta. *p < 0,05, ***p < 0,001 i ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Endothelial cells (ECs) play a central role in regulating fatty acid (FA) transport from the bloodstream into metabolic tissues, yet tools to quantify EC ...

Składniki odżywcze przenoszone przez krew, takie jak kwasy tłuszczowe, muszą przekroczyć barierę śródbłonkową kapilary, aby dostać się do tkanek metabolicznych za pomocą słabo poznanych mechanizmów. Wyjaśnienie tych procesów może ujawnić nowe cele terapeutyczne w leczeniu chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca typu 2. Odkryliśmy, że mięśnie skalpela i tkanka tłuszczowa regulują pobieranie i transport lipidów śródbłonka za pomocą metabolitów parakrynowych, częściowo kontrolowanych także przez układ hormonalny.Również odkryliśmy, że mitochondrialne ATP niespodziewanie przyczyniają się do pobierania tłuszczu przez śródbłonek, mimo że są znane jako uzależnione od glikolitycznego ATP. Korzystając z testu opisanego w tym protokole, planujemy głębiej zbadać molekularne mechanizmy leżące u podstaw pobierania i transportu kwasów tłuszczowych śródbłonka, w tym tego, jak mogą być one regulowane przez inne tkanki. Na początek przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 0,1%, dodając 25 mililitrów 2% żelatyny do 475 mililitrów PBS.Dokładnie wymieszaj roztwór żelatyny i sterylizuj filtrem za pomocą 0,2-mikrometrowego filtra próżniowego lub autoklawu. Za pomocą pipety dodaj 100 mikrolitrów roztworu żelatyny 0,1% do każdego dołka czarnej, przezroczystej płytki z 96 dołkami na dnie. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut lub na noc.Po inkubacji usuń nadmiar roztworu żelatyny z wcześniej powlekanej płytki z 96 dołkami. Umyj talerz PBS raz. Następnie pipetą wszczep 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołku, używając gęstości zasiewniczej, która pozwala komórkom osiągnąć zbieg do następnego dnia.Przygotuj roztwory 20 milimolarowych 3-hydroksyzobutyranu i mleczanu jako dodatnie kontrole. Do kontroli negatywnej użyj jednego mikrotrzonowcowego niklosamidu. Następnie pipetuję roztwory do osobnej płytki z 96 dołkami.Raz umyj komórki śródbłonka podgrzanym dwuwartościowym PBS, pipetując pod ostrym kątem, aby nie zakłócać komórek pokrytych płytami. Dodaj 50 mikrolitrów odpowiedniego odczynnika do leczenia na dołek i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 lub 60 minut. Aby przygotować kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY, wymieszaj 2-mikromolowy roztwór kwasów tłuszczowych BODIPY z 1 mikromolarowym BSA wolnym od kwasów tłuszczowych w PBS.Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut przed użyciem. Następnie do każdego dobrze obtraktowanego składnika dodaj 50 mikrolitrów przygotowanego kompleksu kwasów tłuszczowych BSA i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przygotuj roztwór BSA bez kwasów tłuszczowych o pojemności 1 mikromolara w PBS jako bufor do płukania i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza.Usuń kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY z dołków i przemyj całą płytę dwukrotnie 50 mikrolitrami wcześniej podgrzanego buforu do płukania, wykonując każde płukanie przez 1,5 minuty. Następnie do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów 0,08% trypanowego niebieskiego, aby stłumić fluorescencję zewnątrzkomórkową. Za pomocą czytnika mikropłytek natychmiast zmierz fluorescencję wewnątrzkomórkową.Po usunięciu roztworu trypan blue z dołków delikatnie umyj komórki PBS. Do każdego dołku dodaj 4 mikrogramy na mililitr barwnika Hoechst rozcieńczonego w 10% media. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie umyj talerz raz PBS, żeby usunąć nadmiar barwnika. Następnie dodaj świeży PBS do każdego dołka i zmierz fluorescencję Hoechst za pomocą czytnika mikropłytek. W komórkach HUVEC i EA.hy926 sygnał BODIPY-C12 wewnątrzkomórkowy wzrósł istotnie przy wyższych stężeniach kwasów tłuszczowych BODIPY po jednej minucie, pięciu minutach i 10 minutach inkubacji.Leczenie laktanem przez godzinę zwiększało pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki przy stężeniach 5 milimolowych i 20 milimolowych. Leczenie 3-hydroksizobutyranem znacząco zwiększyło również pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki, z najwyższym wychwytem 20 milimolowym. Leczenie jednym mikrotrzonowcem niklosamidem przez 30 minut spowodowało istotne zmniejszenie wychwytu BODIPY-C12 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.Po pięciominutowej inkubacji BODIPY-C16 w HUVEC, leczenie mleczanem na 10 milimolowych i 20 milimolowych znacząco zwiększyło wchłanianie w zależności od dawki. Leczenie 1 mikrotrzonowcem niklosamidem istotnie zmniejszyło wychwyt BODIPY-C16 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.

quantification-endothelial-fatty-acid-uptake-using-fluorescent-fatty

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy technikę ex vivo do pomiaru wyczerpania zewnątrzkomórkowego analogu glukozy w pobranych narządach myszy. Polega na inkubacji tkanki myszy w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie deoksyglukozę, która jest pobierana przez komórki. Wychwyt analogu glukozy można pośrednio określić, mierząc fluorescencję inkubowanej pożywki.

Pomiar zubożenia analogu glukozy we fluorescencji zewnątrzkomórkowej: zastępcza technika pomiarowa do oceny wychwytu glukozy w narządach myszy ex vivo

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania dynamiki kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika BAS FRET. Ten czujnik kwasu żółciowego stanowi unikalne narzędzie do badania (regulacji) transportu kwasów żółciowych i aktywacji FXR w szerokim zakresie typów komórek.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Tradycyjne metody oceny różnicowania adipogennego są tanie i łatwe w użyciu, ale nie są specyficzne dla zmian w ekspresji genów. Opracowaliśmy test do ilościowego określania różnicowania komórek mezenchymalnych w dojrzałe adipocyty przy użyciu markera specyficznego dla linii. Test ten ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i medycynie klinicznej.

Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Poznaj metodę ilościowej identyfikacji pochłaniania kwasów tłuszczowych w komórkach śródbłonka naczyniowego przy użyciu fluorescencyjnych analogów BODIPY. Ta technika pozwala badać metabolizm lipidów i potencjalne cele terapeutyczne chorób metabolicznych.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów