Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych
15 sierpnia 2025
Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.
Składniki odżywcze przenoszone przez krew, takie jak kwasy tłuszczowe, muszą przekroczyć barierę śródbłonkową kapilary, aby dostać się do tkanek metabolicznych za pomocą słabo poznanych mechanizmów. Wyjaśnienie tych procesów może ujawnić nowe cele terapeutyczne w leczeniu chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca typu 2. Odkryliśmy, że mięśnie skalpela i tkanka tłuszczowa regulują pobieranie i transport lipidów śródbłonka za pomocą metabolitów parakrynowych, częściowo kontrolowanych także przez układ hormonalny.
Również odkryliśmy, że mitochondrialne ATP niespodziewanie przyczyniają się do pobierania tłuszczu przez śródbłonek, mimo że są znane jako uzależnione od glikolitycznego ATP. Korzystając z testu opisanego w tym protokole, planujemy głębiej zbadać molekularne mechanizmy leżące u podstaw pobierania i transportu kwasów tłuszczowych śródbłonka, w tym tego, jak mogą być one regulowane przez inne tkanki. Na początek przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 0,1%, dodając 25 mililitrów 2% żelatyny do 475 mililitrów PBS.
Dokładnie wymieszaj roztwór żelatyny i sterylizuj filtrem za pomocą 0,2-mikrometrowego filtra próżniowego lub autoklawu. Za pomocą pipety dodaj 100 mikrolitrów roztworu żelatyny 0,1% do każdego dołka czarnej, przezroczystej płytki z 96 dołkami na dnie. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut lub na noc.
Po inkubacji usuń nadmiar roztworu żelatyny z wcześniej powlekanej płytki z 96 dołkami. Umyj talerz PBS raz. Następnie pipetą wszczep 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołku, używając gęstości zasiewniczej, która pozwala komórkom osiągnąć zbieg do następnego dnia.
Przygotuj roztwory 20 milimolarowych 3-hydroksyzobutyranu i mleczanu jako dodatnie kontrole. Do kontroli negatywnej użyj jednego mikrotrzonowcowego niklosamidu. Następnie pipetuję roztwory do osobnej płytki z 96 dołkami.
Raz umyj komórki śródbłonka podgrzanym dwuwartościowym PBS, pipetując pod ostrym kątem, aby nie zakłócać komórek pokrytych płytami. Dodaj 50 mikrolitrów odpowiedniego odczynnika do leczenia na dołek i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 lub 60 minut. Aby przygotować kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY, wymieszaj 2-mikromolowy roztwór kwasów tłuszczowych BODIPY z 1 mikromolarowym BSA wolnym od kwasów tłuszczowych w PBS.
Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut przed użyciem. Następnie do każdego dobrze obtraktowanego składnika dodaj 50 mikrolitrów przygotowanego kompleksu kwasów tłuszczowych BSA i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przygotuj roztwór BSA bez kwasów tłuszczowych o pojemności 1 mikromolara w PBS jako bufor do płukania i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza.
Usuń kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY z dołków i przemyj całą płytę dwukrotnie 50 mikrolitrami wcześniej podgrzanego buforu do płukania, wykonując każde płukanie przez 1,5 minuty. Następnie do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów 0,08% trypanowego niebieskiego, aby stłumić fluorescencję zewnątrzkomórkową. Za pomocą czytnika mikropłytek natychmiast zmierz fluorescencję wewnątrzkomórkową.
Po usunięciu roztworu trypan blue z dołków delikatnie umyj komórki PBS. Do każdego dołku dodaj 4 mikrogramy na mililitr barwnika Hoechst rozcieńczonego w 10% media. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie umyj talerz raz PBS, żeby usunąć nadmiar barwnika. Następnie dodaj świeży PBS do każdego dołka i zmierz fluorescencję Hoechst za pomocą czytnika mikropłytek. W komórkach HUVEC i EA.hy926 sygnał BODIPY-C12 wewnątrzkomórkowy wzrósł istotnie przy wyższych stężeniach kwasów tłuszczowych BODIPY po jednej minucie, pięciu minutach i 10 minutach inkubacji.
Leczenie laktanem przez godzinę zwiększało pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki przy stężeniach 5 milimolowych i 20 milimolowych. Leczenie 3-hydroksizobutyranem znacząco zwiększyło również pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki, z najwyższym wychwytem 20 milimolowym. Leczenie jednym mikrotrzonowcem niklosamidem przez 30 minut spowodowało istotne zmniejszenie wychwytu BODIPY-C12 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.
Po pięciominutowej inkubacji BODIPY-C16 w HUVEC, leczenie mleczanem na 10 milimolowych i 20 milimolowych znacząco zwiększyło wchłanianie w zależności od dawki. Leczenie 1 mikrotrzonowcem niklosamidem istotnie zmniejszyło wychwyt BODIPY-C16 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.
Przegląd
Ten protokół szczegółowo opisuje in vitro test do pomiaru wchłaniania lipidów komórkowych w komórkach śródbłonka, wykorzystujący analogi fluorescencyjne kwasów tłuszczowych BODIPY. Metoda jest wydajna i adaptowalna, dostarczając wglądów w metabolizm lipidów.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Biologia komórkowa
- Metabolizm lipidów
- Funkcja komórek śródbłonka
Wprowadzenie
- Kwasy tłuszczowe muszą przekraczać barierę śródbłonka, aby wejść do tkanek metabolicznych.
- Mechanizmy tego procesu nie są dobrze poznane.
- Zrozumienie tych mechanizmów może prowadzić do nowych celów terapeutycznych dla chorób metabolicznych.
- Poprzednie ustalenia wskazują, że tkanki mięśniowe i tłuszczowe regulują wchłanianie lipidów przez śródbłonek.
Cel Badania
- Wyjaśnienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw wchłaniania kwasów tłuszczowych przez śródbłonek.
- Zbadanie, w jaki sposób wchłanianie lipidów jest regulowane przez inne tkanki.
- Wykorzystanie in vitro testu do szczegółowej analizy metabolizmu lipidów.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie płyt 96-dołowych powlekanych żelatyną do hodowli komórek.
- Wykorzystanie analogów kwasów tłuszczowych BODIPY do pomiaru wchłaniania lipidów.
- Inkubacja komórek śródbłonka z różnymi substancjami.
- Pomiar fluorescencji wewnątrzkomórkowej w celu określenia ilości wchłaniania lipidów.
Główne Wyniki
- Zwiększony sygnał BODIPY-C12 przy wyższych stężeniach kwasów tłuszczowych.
- Laktat i 3-hydroksizobutrylan zwiększały wchłanianie BODIPY-C12 w sposób zależny od dawki.
- Leczenie niklozydem istotnie zmniejszało wchłanianie kwasów tłuszczowych.
- Wchłanianie BODIPY-C16 również zwiększało się pod wpływem laktatu.
Wnioski
- Test zapewnia wiarygodną metodę badania wchłaniania lipidów w komórkach śródbłonka.
- Wyniki sugerują potencjalne regulacyjne role metabolić parakrynnych.
- Dalsze badania mogą ujawnić nowe spostrzeżenia dotyczące mechanizmów chorób metabolicznych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying endothelial fatty acid uptake with fluorescent analogs addresses a critical gap in early metabolic disease research by enabling robust, scalable measurement of lipid transport dynamics. This assay supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, directly informing portfolio decisions for metabolic and vascular disease programs. Its adaptability and quantitative outputs position it as a reusable platform for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of endothelial lipid transport mechanisms relevant to metabolic disease.
- Supports functional target validation by quantifying chain length-specific fatty acid uptake.
- Facilitates mechanistic de-risking through use of positive and negative controls.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and triage of early targets.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, high-throughput 96-well format for reproducible FA uptake measurement.
- Enables assay scalability and platform reuse across primary and immortalized endothelial cell lines.
- Supports robust compound evaluation with time- and dose-dependent uptake readouts.
- Improves safety and speed compared to radiolabeled tracer methods.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling endothelial transport in metabolic contexts.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting live-cell and pulse-chase formats.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of endothelial lipid handling.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying regulatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, target validation, and translational research in metabolic and vascular disease pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative FA uptake measurements clarify endothelial transport pathways and regulatory mechanisms.
- Screening: High-throughput, reproducible outputs enable compound and pathway screening in validated cell systems.
- Analytics: Fluorescence-based readouts and normalization to cell number provide robust, comparable data across conditions.
- Translational Research: Adaptability to live-cell and pulse-chase formats supports biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Platform versatility allows adaptation to diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in endothelial lipid transport studies.
- Operational Value: Standardizes FA uptake quantification with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and fluorescence-based quantification.
- Needs access to microplate readers and compatible imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of controls and normalization protocols.
- Adaptable to various cell types and imaging modalities with protocol optimization.
- Limitations include dependence on analog uptake fidelity and cell line-specific responses.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:59
Gelatin Coating of 96-Well Plate and Cell Seeding
2:06
Treatment Reagent Preparation and Application
3:23
Fluorescence Quenching and Intracellular Signal Detection
4:07
Hoechst Nuclear Staining for Cell Normalization
4:43
Results
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-07-07T20%253A58%253A27.244Z&w=384&q=75)
