Name: Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj trzy modele in vitro do badania wpływu czynników SASP na proliferację komórek HeLa przy użyciu monitorowania impedancji w czasie rzeczywistym i obrazowania żywych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez Jednostkę Projektu Naukowego Uniwersytetu Gazi (kod grantu: TOA-2021-7321) oraz TUBITAK (kod grantu: 122S564 i 223S969).

<ol><li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication%3A+new+insights+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication: new insights and clinical implications.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced senescence in cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).</li>
<li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+Cells+in+Cancer+Therapy%3A+Friends+or+Foes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes.</a> Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Common+Hallmarks+and+Interconnected+Pathways+of+Aging%2C+Circadian+Rhythms%2C+and+Cancer%3A+Implications+for+Therapeutic+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Research+%28Wash+D+C%29%22%5BJournal%5D)">The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies.</a> Research (Wash D C). 8, 0612(2025).</li>
<li>Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+connection+between+the+cardiac+glycoside-induced+senescent+cell+morphology+and+Rho%2FRho+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).</li>
<li>Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells+and+SASP+in+cancer+microenvironment%3A+New+approaches+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy.</a> Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Heckenbach, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+morphology+is+a+deep+learning+biomarker+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Aging%22%5BJournal%5D)">Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence.</a> Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).</li>
<li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Kuilman, T., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-messaging+secretome%3A+SMS-ing+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress.</a> Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).</li>
<li>Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implication+of+ROCK+2+as+a+potential+senotherapeutic+target+via+the+suppression+of+the+harmful+effects+of+the+SASP%3A+Do+senescent+cancer+cells+really+engulf+the+other+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells.</a> Cell Signal. 84, 110007(2021).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunction+co-culture+model+for+evaluating+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions.</a> Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).</li>
<li>Ozdemir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+glycoside-induced+cell+death+and+Rho%2FRho+kinase+pathway%3A+Implication+of+different+regulation+in+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines.</a> Steroids. 109, 29-43 (2016).</li>
<li>zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain+induces+Rho-dependent+rock+activation+and+membrane+blebbing+in+cultured+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells.</a> Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Simay Demir, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimigratory+effect+of+pyrazole+derivatives+through+the+induction+of+STAT1+phosphorylation+in+A549+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells.</a> J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).</li>
<li>Ariffin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CellProfiler+pipeline+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">The CellProfiler pipeline analysis of cell migration.</a> Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+crossroads+of+aging+and+cancer+through+single-cell+analysis%3A+Implications+for+precision+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology.</a> Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dynamiczne interakcje komórek nowotworowych w mikrośrodowisku są kluczowe dla postępu guza, co wpływa na indukcję przerzutów i rozwój guza wtórnego. Zgłaszano również, że starzejące się komórki nowotworowe i stromalne regulują mikrośrodowiska nowotworowe poprzez czynniki wydzielane z komórek starzejących4. Czynniki te stymulują proliferację komórek, migrację, inwazję, różnicowanie oraz zwiększają oporność na wiele leków 4,13. Dlatego zrozu...

U organizmów wielokomórkowych komórki komunikują się za pomocą sygnalizacji parakrynowej i juxtacrynowej, wymieniając się komunikatami ze swoim mikrośrodowiskiem, wpływając tym samym na zachowania innych osób. Ta komunikacja może odbywać się bezpośrednio, poprzez tunelujące nanorurki i połączenia szczelinowe, lub pośrednio poprzez wydzielanie rozpuszczalnych cząsteczek chemicznych, takich jak cytokiny, czynniki wzrostu i chemokiny, do macierzy zewnątrzkomórkowej. Te mechanizmy sygnalizacyjne odgrywają istotną rolę w regulacji różnych procesów fizjologicznych, w tym rozwoju tkanek i odpowiedzi komórek odpornościowych, a także są powiązane z patogenezą licznych chorób, takich jak nowotwory, HIV, nadciśnienie czy choroba Alzheimera1.
W latach 60. Leonard Hayflick odkrył, że normalne ludzkie fibroblasty mają ograniczoną zdolność do replikacji in vitro2. Ten ograniczony stan proliferacji komórek, który rozwija się w wyniku skracania telomerazy, nazywany jest starzeniem replikacyjnym. Kolejne badania wykazały, że różne formy stresu komórkowego również mogą wywoływać starzenie się komórkowe. Ustalono, że powszechne metody leczenia nowotworów, takie jak chemioterapia i radioterapia, również wywołują starzenie komórkowe zarówno w komórkach nowotworowych, jak i stromalnych, zwane starzeniem wywołanym terapią 3,4. Starzenie się komórkowe i starzenie się to procesy powiązane hierarchicznie; reprezentują one odrębne procesy biologiczne. Nagromadzenie komórek starzących w organizmie przyczynia się do starzenia się poprzez promowanie stanu zapalnego, dysfunkcji tkanek oraz rozwój chorób związanych z wiekiem. Jednak starzenie się obejmuje znacznie szerszy zakres zdarzeń i mechanizmów systemowych w porównaniu do starzeniasię 5.
Komórki starzejące charakteryzują się tym, że ich rozbudowana cytoplazma jest znacznie większa i ma spłaszczoną morfologię w porównaniu do komórek normalnych6. Te komórki starzące się mają zwiększoną aktywność lizosomalną i są pozytywne na aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związaną ze starzeniem się, enzymu lizosomalnego, który pozostaje aktywny nawet przy kwaśnym pH 6,0. Barwienie SA-β-gal jest najczęściej stosowanym biomarkerem do wykrywania komórek starzejących7. Powiększenie i nieregularna morfologia jąder są powszechnie obserwowane w komórkach przechodzących starzenie się. Ponadto komórki te charakteryzują się unikalnymi przekształceniami chromatynowych zwanymi heterochromatycznymi ogniskami związanymi ze stareniem (SAHF), które pośredniczą w nieodwracalnym zatrzymaniu cyklu komórkowego 8,9.
Chociaż starzejące się komórki nowotworowe ostatecznie utraciły zdolność do proliferacji, pozostały żywotne i metabolicznie aktywne. Wiadomo, że komórki starzejące wydzielają także różne czynniki regulujące mikrośrodowisko guza zewnętrznego, zwane fenotypem wydzielniowym związanym ze starzeniem (SASP)10,11. Czynniki SASP obejmują rozpuszczalne czynniki sygnalizacyjne (interleukiny, chemokiny i czynniki wzrostu), wydzielane proteazy oraz wydzielane nierozpuszczalne białka/składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Łącznie te czynniki wywierają szkodliwe efekty parakryniologiczne, w tym sprzyjają proliferacji komórek nowotworowych, migracji, inwazji oraz indukcji przejścia z nabłonka do mezenchymu (EMT)4,12. Ponadto skutki niepożądane wywołane chemioterapią częściowo przypisuje się gromadzeniu komórek starzejących13. Dlatego badanie interakcji między komórkami starzejącymi a niestarzającymi stało się ważnym obszarem badań w kontekście terapii nowotworów. Szczególnie analiza czynników SASP, zwłaszcza ich składu i wpływu na mikrośrodowisko nowotworowe, jest uważana za obiecującą strategię identyfikacji nowych cząsteczek docelowych w terapii nowotworowej oraz odkrywania nowych leków na te cząsteczki.
Techniki kokultury in vitro od dawna są wykorzystywane do badania zrozumienia interakcji międzykomórkowych14. W tym artykule metodologicznym celem było ocenenie możliwej aktywności proliferacyjnej czynników wydzielanych z komórek starzejących się na komórkach nowotworowych niesenescentycznych za pomocą trzech różnych metod. Dodatkowo porównano wyniki uzyskane z trzech różnych metod, a każde z nich krytycznie oceniło ich zalety i wady.
Najpierw stworzono model współhodowli między komórkami HeLa a niestarzalymi komórkami HeLa, aby monitorować możliwe zmiany w proliferacji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym12. System ten składa się z dwóch płyt do oceny interakcji między komórkami. Widok e-plate, który tworzy dolną warstwę, ma powierzchnię, na której zasiewane są komórki docelowe, z mikroelektrodami umieszczonymi na dole płyty. Opór elektryczny wywołany przez adhezję komórek docelowych do tej powierzchni wyrażany jest przez mierzalny parametr Indeks Komórki (CI). Wartość CI jest proporcjonalna do liczby komórek oraz stopnia przyczepności do powierzchni15. Dodatkowo widok e-plate umożliwia morfologiczne badanie komórek pod mikroskopem kontrastu fazowego. Wkładka e-plate, która tworzy górną warstwę, to miejsce, gdzie zasiewane są komórki efektorowe. Spód tej płyty pokryty jest półprzepuszczalną membraną o wielkości poru 0,4 μm. Czynniki wydzielane z komórek efektorowych mogą przechodzić przez błonę i wpływać na komórki docelowe w widoku e-plate. Jeśli ta interakcja stymuluje proliferację komórek, obserwuje się to jako wzrost wartości CI. W ten sposób interakcje między komórkami można oceniać ilościowo.
W drugiej metodzie skoncentrowano podłoża warunkowane zebrane z komórek HeLa i dodano do komórek HeLa niesenescentnych. Potencjalny efekt proliferacyjny na te komórki monitorowano za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym.
W trzeciej metodzie planowano współhodować komórki HeLa starzejące się bezpośrednio i komórki GFP-HeLa niesenescentne w 2D oraz monitorować możliwe zmiany proliferacyjne w komórkach nowotworowych w czasie rzeczywistym pod mikroskopem. 
Celem tego eksperymentu jest stworzenie trzech modeli do badania interakcji między komórkami HeLa starzejących się a niesenescentnych HeLa oraz monitorowanie możliwych zmian w proliferacji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym. Dzięki temu wpływ czynników SASP wydzielanych przez komórki nowotworowe na pozostałe komórki nowotworowe można łatwo zbadać. W związku z tym systematycznie oceniono zalety i ograniczenia tych trzech podejść.

<table><tbody><tr><td>&amp;mikro;-Slajd 8 Wysoko</td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/68883/68883eq1.jpg" style="margin: auto; ">bidi</td><td>80806</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtrów odśrodkowych Amicon Ultra (Ultracel-3K)</td><td>Millipore</td><td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkubator (37 stopni i g; C, 5% CO2)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-Controller 2000 </td><td>Pecon </td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Doksorubicyny</td><td>Tocris</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Tablica E INSERT 16 </td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td>6 465 382 001</td><td></td></tr><tr><td>Tablica E WIDOK 16 </td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td>300 601 140</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td><img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/68883/68883eq2.jpg" style="margin: auto; ">AP Institute, Ankara, Turcja</td><td>HÜ KÜ K Nr: 90061901 </td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 mikroskop fluorescencyjny odwrócony </td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia związany ze starzeniem i beta; -galaktozydaza (SA-β-galon);</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9860 LATA</td><td></td></tr><tr><td>System inkubacji na górze stóp</td><td>Pecon </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temp-controller 2002-2 </td><td>Pecon </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP system </td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wpływu czynników sasp na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

Evaluating the Effect of SASP Factors on the Proliferation of Cancer Cells Using a Comparative Analysis of Three Distinct Methodologies

Komórki nowotworowe wywołane chemioterapią wydzielają także różne czynniki, zwane fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem, aby regulować swoje zewnętrzne mikrośrodowisko. Wcześniejsze badania wykazały, że te czynniki SASP wywierają szkodliwe działanie parakrynowe na otaczające komórki, w tym promujące proliferację, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), angiogenezę i migrację. Wiele technik kokultury in vitro jest szeroko stosowanych do zrozumienia procesów komórkowych wynikających z interakcji poprzez hodowlę tych samych i różnych typów komórek razem. Tutaj badane były potencjalne proliferacyjne efekty czynników SASP wydzielanych przez komórki HeLa starzejące się na komórki HeLa niestarzejące, stosując trzy komplementarne podejścia in vitro . Pierwsze podejście polegało na współhodowli komórek senescentycznych i niesenescentnych w celu zbadania sygnalizacji parakrynologicznej pośredniczonej przez SASP. W drugim podejściu skoncentrowano podłoża warunkowane zebrane z komórek nowotworowych na poziomie starzejącym się i następnie wykorzystano do badania wpływu podłoża warunkowanego z monitorowaniem proliferacji w czasie rzeczywistym. W trzeciej metodzie komórki starzejące i niesenescentyjne były hodowane obok siebie, aby ocenić efekty paradokryniczne SASP poprzez bezpośredni kontakt komórka-komórka. Wszystkie trzy modele eksperymentalne konsekwentnie wykazywały, że czynniki SASP znacząco zwiększają proliferację komórek nowotworowych niesenescentnych. Warto zauważyć, że koprodukcja komórek starzących zwiększyła tempo proliferacji o 64,6%, a trzykrotnie skoncentrowane podłoża warunkowane SASP zwiększyły proliferację o ponad 50% w porównaniu z grupami kontrolnymi. Obrazowanie oparte na fluorescencji wykazało wzrost liczby komórek GFP w warunkach zgodnych z GFP o 49,3%. Metody te łącznie umożliwiły ilościową i jakościową ocenę proliferacyjnych zmian wywołanych przez SASP. Analiza porównawcza tych podejść podkreśla ich zalety i ograniczenia, dostarczając cennych informacji na temat parakrynologicznych efektów komórek starzejących się na przyrost.

Ten reprezentatywny zestaw eksperymentów badał potencjalne efekty fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, pochodzącego z komórek nowotworowych na inne komórki nowotworowe. Dlatego po raz pierwszy potwierdzono, czy leczenie doksorubicyną przez 72 godziny może wywołać starzenie się komórek HeLa za pomocą barwienia SA-β-Gal. W komórkach senescentnych enzym lizosomalny β-galaktozydaza pozostaje aktywny nawet przy niskim pH i rozszczepia chromogeniczny substrat X-gal, tworząc niebieski wysad17<...

Badanie to ocenia proliferacyjne efekty czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem (SASP) pochodzących z komórek HeLa na komórki HeLa niestarzejące, wykorzystując trzy modele in vitro z monitoringiem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej metody były systematycznie porównywane, aby lepiej zrozumieć interakcje komórki w nowotworach.

Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

Chemotherapy-induced senescent cancer cells also secrete various factors, called senescence-associated secretory phenotype, to regulate their ...

Komórki nowotworowe starzejące się wydzielają takie czynniki wpływające na sąsiednie komórki. Przedstawiamy trzy modele in vitro do badania efektów parakrynologicznych i juxtacrynnych sterowanych SASP na proliferację komórek HeLa, monitorowania impedancji w czasie rzeczywistym oraz dynamicznej, kinetycznej i morfologicznej analizy umożliwiającej obrazowanie komórek żywych, ujawniających efekty parakrynowe i mikrośrodowiskowe wykraczające poza tradycyjne testy końcowe. Na początek włącz system analizy komórek w czasie rzeczywistym przed zasiewem komórek.Uruchom oprogramowanie RTCA w wersji 2.0. Kliknij przycisk X Notes i wprowadź szczegóły eksperymentu. Kliknij przycisk Schedule i dodaj dwa kroki, aby nagrywać tło i monitorować proliferację komórek co 15 minut przez 72 godziny.Wybierz pierwszy krok i kliknij Play. Ręcznie dodaj 50 mikrolitrów kompletnego medium do każdego otworu w widoku e-plate. Następnie przemyj zarówno komórki HeLa senescentyjne, jak i niesenescentyjne pięcioma mililitrami sterylnego, podgrzanego PBS.Po saspirowaniu dodaj jeden mililitr podgrzanej 0,05% trypsyny i inkubuj. Zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Następnie wiruj ogniwa w temperaturze 500 G przez 10 minut.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij osady komórkowe w pięciu mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Teraz zasiej niesenescentyjne komórki HeLa do każdego dołka jednej e-płytki w 100 mikrolitrach kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Umieść widok e-plate w kolebce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, aby komórki mogły przyłączyć się do powierzchni płyty w inkubatorze.Wybierz drugi krok i kliknij Play, aby rozpocząć pomiar impedancji. Komórki nasienne w wkładkach e-plate zawierających 60 mikrolitrów kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem w trzech różnych eksperymentalnych konfiguracjach. Utrzymuj wkładkę do e-plate w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin do mocowania.Kliknij Pauza po sześciu godzinach siewania komórek, a następnie delikatnie aspiruj pożywkę hodowlową z każdego dołku w widoku e-plate, aby usunąć surowicę i komórki nieprzylegające. Dwa razy myj studnie z podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 140 mikrolitrów DMEM wolnego od surowicy do każdej jamki w widoku e-plate.Usuń medium. Płucz wkładki e-plate PBS, a następnie dodaj 60 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM. Teraz umieść wkładkę e-plate w widoku e-plate.Delikatnie dociskaj, aż wkład będzie całkowicie zasiany w dołku. Wstaw połączoną płytę do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Kliknij Play, aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym co 15 minut za pomocą oprogramowania.Normalizuj wartości indeksu komórek w momencie połączenia, gdy widok e-plate i wkładka e-plate są łączone i wstawione do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Następnie naciśnij przycisk Analiza danych, aby obliczyć tempo i ilość proliferacji, korzystając z maksymalnego indeksu komórek i danych o nachyleniu uzyskanych z systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Następnie przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego programu statystycznego.Aspiruj pożywkę hodowlową z obu płytek sześciodołowych zawierających komórki HeLa starzące i niesenescentyjne. Umyj komórki dwa razy podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki surowicy i zanieczyszczenia komórkowe. Do każdego dołku należy dodać dwa mililitry bezsurowicowego podłoża DMEM z antybiotykiem, a następnie inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin.Zbieraj podłoże kondycjonowane z każdej studni do rurek sterylnych w laminarnej szafce bezpieczeństwa. Wirówka zebrane podłoże kondycjonowane w 1000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, a następnie wirowanie w 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać klarowany supernatant. Następnie odwiruj kondycjonowane medium za pomocą dwumililitrowych ultraodśrodkowych filtrów w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 60 minut przy 3000 g, aby skoncentrować je do 400 mikrolitrów.Rozcieńcz uzyskany koncentrat świeżym, bezsurowym medium, aby przygotować 1x, 2x i 3x skoncentrowane medium kondicjonowane w sterylnych tubach w laminarnej kabinie bezpieczeństwa. Gdy komórki się przywierzą, delikatnie aspiruj pożywkę z każdego dołka widoku e-plate, aby usunąć surowicę i nieprzywierające komórki, a następnie przemyj PBS. Następnie pipetą podgrzałem 200 mikrolitrów podgrzewanego wcześniej podłoża w temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej grupy.Wstaw widok e-plate do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym i kliknij Play, aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym w odstępach 15 minut przez 48 godzin. Komórki nasienne na mikroszkiełko przesuwają się pod trzy eksperymentalne układy i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze z stężeniem 5% dwutlenku węgla. Po ośmiu godzinach od przyczepienia umyj komórki dwukrotnie podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 200 mikrolitrów bezsurowego medium Dulbecco Modified Eagle's Medium do każdego dołku. Włącz Temp-controller 2002-2 i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Włącz CO2-Controller 2000 i ustaw go na 5% dwutlenku węgla.Włącz źródło światła fluorescencyjnego. Umieść szkiełko na komorze inkubacyjnej na górze sceny. Uruchom oprogramowanie na komputerze.Wybierz cel 20x. Dodaj kanał kontrastu fazowego oraz kanał fluorescencyjny FITC. Za pomocą kontrolera scen zaznacz pozycje dla każdej lokalizacji.Ustaw interwał czasu na 30 minut, a czas akwizycji na 48 godzin, a następnie rozpocznij akwizycję. Policz zielone fluorescencyjne komórki białkowe pozytywne w obu punktach czasowych i oblicz procentowy wzrost do analizy. Leczenie doksorubicyną znacząco wywołało starzenie komórkowe komórek w komórkach HeLa.Ilościowa identyfikacja komórek pozytywnych do SA-beta-gal wykazała istotnie wyższy odsetek w grupie leczonej doksorubicyną w porównaniu do grupy kontrolnej. W pierwszym podejściu komórki HeLa niesenescentyjne współhodowane z komórkami HeLa wykazały znacząco zwiększoną szybkość i pojemność proliferacji w porównaniu z komórkami współhodowanymi z komórkami HeLa niesenescentnymi. Ośrodki warunkowane pochodzące z komórek HeLa w stężeniach 2x i 3x istotnie zwiększyły tempo i zdolność proliferacji komórek HeLa niesenescentnych w porównaniu z ośrodkami warunkowanymi komórek niesenescentnych.W trzecim podejściu, po 48 godzinach współhodowli, komórki HeLa z dodatnim wynikiem GFP wykazały znacząco większy wzrost proliferacji podczas współhodowli z komórkami HeLa w porównaniu do kontrolnych osób niesenescentnych lub wyłącznie GFP.

evaluating-effect-sasp-factors-on-proliferation-cancer-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Poznaj trzy modele in vitro do badania wpływu czynników SASP na proliferację komórek HeLa przy użyciu monitorowania impedancji w czasie rzeczywistym i obrazowania żywych komórek.

Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

Przeglądaj więcej filmów