Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii
19 września 2025
Badanie to ocenia proliferacyjne efekty czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem (SASP) pochodzących z komórek HeLa na komórki HeLa niestarzejące, wykorzystując trzy modele in vitro z monitoringiem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej metody były systematycznie porównywane, aby lepiej zrozumieć interakcje komórki w nowotworach.
Komórki nowotworowe starzejące się wydzielają takie czynniki wpływające na sąsiednie komórki. Przedstawiamy trzy modele in vitro do badania efektów parakrynologicznych i juxtacrynnych sterowanych SASP na proliferację komórek HeLa, monitorowania impedancji w czasie rzeczywistym oraz dynamicznej, kinetycznej i morfologicznej analizy umożliwiającej obrazowanie komórek żywych, ujawniających efekty parakrynowe i mikrośrodowiskowe wykraczające poza tradycyjne testy końcowe. Na początek włącz system analizy komórek w czasie rzeczywistym przed zasiewem komórek.
Uruchom oprogramowanie RTCA w wersji 2.0. Kliknij przycisk X Notes i wprowadź szczegóły eksperymentu. Kliknij przycisk Schedule i dodaj dwa kroki, aby nagrywać tło i monitorować proliferację komórek co 15 minut przez 72 godziny.
Wybierz pierwszy krok i kliknij Play. Ręcznie dodaj 50 mikrolitrów kompletnego medium do każdego otworu w widoku e-plate. Następnie przemyj zarówno komórki HeLa senescentyjne, jak i niesenescentyjne pięcioma mililitrami sterylnego, podgrzanego PBS.
Po saspirowaniu dodaj jeden mililitr podgrzanej 0,05% trypsyny i inkubuj. Zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Następnie wiruj ogniwa w temperaturze 500 G przez 10 minut.
Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij osady komórkowe w pięciu mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Teraz zasiej niesenescentyjne komórki HeLa do każdego dołka jednej e-płytki w 100 mikrolitrach kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem. Umieść widok e-plate w kolebce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, aby komórki mogły przyłączyć się do powierzchni płyty w inkubatorze.
Wybierz drugi krok i kliknij Play, aby rozpocząć pomiar impedancji. Komórki nasienne w wkładkach e-plate zawierających 60 mikrolitrów kompletnego DMEM uzupełnionego antybiotykiem w trzech różnych eksperymentalnych konfiguracjach. Utrzymuj wkładkę do e-plate w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin do mocowania.
Kliknij Pauza po sześciu godzinach siewania komórek, a następnie delikatnie aspiruj pożywkę hodowlową z każdego dołku w widoku e-plate, aby usunąć surowicę i komórki nieprzylegające. Dwa razy myj studnie z podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 140 mikrolitrów DMEM wolnego od surowicy do każdej jamki w widoku e-plate.
Usuń medium. Płucz wkładki e-plate PBS, a następnie dodaj 60 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM. Teraz umieść wkładkę e-plate w widoku e-plate.
Delikatnie dociskaj, aż wkład będzie całkowicie zasiany w dołku. Wstaw połączoną płytę do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Kliknij Play, aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym co 15 minut za pomocą oprogramowania.
Normalizuj wartości indeksu komórek w momencie połączenia, gdy widok e-plate i wkładka e-plate są łączone i wstawione do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Następnie naciśnij przycisk Analiza danych, aby obliczyć tempo i ilość proliferacji, korzystając z maksymalnego indeksu komórek i danych o nachyleniu uzyskanych z systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Następnie przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego programu statystycznego.
Aspiruj pożywkę hodowlową z obu płytek sześciodołowych zawierających komórki HeLa starzące i niesenescentyjne. Umyj komórki dwa razy podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki surowicy i zanieczyszczenia komórkowe. Do każdego dołku należy dodać dwa mililitry bezsurowicowego podłoża DMEM z antybiotykiem, a następnie inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin.
Zbieraj podłoże kondycjonowane z każdej studni do rurek sterylnych w laminarnej szafce bezpieczeństwa. Wirówka zebrane podłoże kondycjonowane w 1000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, a następnie wirowanie w 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać klarowany supernatant. Następnie odwiruj kondycjonowane medium za pomocą dwumililitrowych ultraodśrodkowych filtrów w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 60 minut przy 3000 g, aby skoncentrować je do 400 mikrolitrów.
Rozcieńcz uzyskany koncentrat świeżym, bezsurowym medium, aby przygotować 1x, 2x i 3x skoncentrowane medium kondicjonowane w sterylnych tubach w laminarnej kabinie bezpieczeństwa. Gdy komórki się przywierzą, delikatnie aspiruj pożywkę z każdego dołka widoku e-plate, aby usunąć surowicę i nieprzywierające komórki, a następnie przemyj PBS. Następnie pipetą podgrzałem 200 mikrolitrów podgrzewanego wcześniej podłoża w temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej grupy.
Wstaw widok e-plate do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym i kliknij Play, aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym w odstępach 15 minut przez 48 godzin. Komórki nasienne na mikroszkiełko przesuwają się pod trzy eksperymentalne układy i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze z stężeniem 5% dwutlenku węgla. Po ośmiu godzinach od przyczepienia umyj komórki dwukrotnie podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Dodaj 200 mikrolitrów bezsurowego medium Dulbecco Modified Eagle's Medium do każdego dołku. Włącz Temp-controller 2002-2 i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Włącz CO2-Controller 2000 i ustaw go na 5% dwutlenku węgla.
Włącz źródło światła fluorescencyjnego. Umieść szkiełko na komorze inkubacyjnej na górze sceny. Uruchom oprogramowanie na komputerze.
Wybierz cel 20x. Dodaj kanał kontrastu fazowego oraz kanał fluorescencyjny FITC. Za pomocą kontrolera scen zaznacz pozycje dla każdej lokalizacji.
Ustaw interwał czasu na 30 minut, a czas akwizycji na 48 godzin, a następnie rozpocznij akwizycję. Policz zielone fluorescencyjne komórki białkowe pozytywne w obu punktach czasowych i oblicz procentowy wzrost do analizy. Leczenie doksorubicyną znacząco wywołało starzenie komórkowe komórek w komórkach HeLa.
Ilościowa identyfikacja komórek pozytywnych do SA-beta-gal wykazała istotnie wyższy odsetek w grupie leczonej doksorubicyną w porównaniu do grupy kontrolnej. W pierwszym podejściu komórki HeLa niesenescentyjne współhodowane z komórkami HeLa wykazały znacząco zwiększoną szybkość i pojemność proliferacji w porównaniu z komórkami współhodowanymi z komórkami HeLa niesenescentnymi. Ośrodki warunkowane pochodzące z komórek HeLa w stężeniach 2x i 3x istotnie zwiększyły tempo i zdolność proliferacji komórek HeLa niesenescentnych w porównaniu z ośrodkami warunkowanymi komórek niesenescentnych.
W trzecim podejściu, po 48 godzinach współhodowli, komórki HeLa z dodatnim wynikiem GFP wykazały znacząco większy wzrost proliferacji podczas współhodowli z komórkami HeLa w porównaniu do kontrolnych osób niesenescentnych lub wyłącznie GFP.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia efekty proliferacyjne czynników fenotypu sekrecyjnego związanego ze starzeniem (SASP) pochodzących ze starzejących się komórek HeLa w odniesieniu do niestarzejących się komórek HeLa, z wykorzystaniem trzech modeli in vitro z monitorowaniem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej z metod zostały systematycznie porównane, aby lepiej zrozumieć interakcje międzykomórkowe w nowotworach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
- Proliferacja komórek
Wstęp
- Starzejące się komórki nowotworowe wydzielają czynniki wpływające na komórki sąsiednie.
- Fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem (SASP) odgrywa rolę w mikrośrodowiskach nowotworowych.
- Zrozumienie efektów SASP może dostarczyć wiedzy na temat progresji nowotworu.
- Tradycyjne analizy mogą nie oddawać skutecznie dynamicznych oddziaływań.
Cel badania
- Zbadanie wpływu czynników SASP na niewykazujące cech starzenia komórki HeLa.
- Porównanie różnych modeli in vitro do badania oddziaływań międzykomórkowych.
- Wykorzystanie technik monitorowania w czasie rzeczywistym do analizy dynamicznej.
Zastosowane metody
- W celu zbadania efektów SASP wykorzystano trzy modele in vitro.
- Do analizy kinetycznej zastosowano monitorowanie impedancji w czasie rzeczywistym.
- Obrazowanie żywych komórek pozwoliło na analizę morfologiczną.
- Szczegóły eksperymentalne zapisano za pomocą oprogramowania RTCA.
Główne wyniki
- Dynamiczny monitoring wykazał istotne efekty parakrynne komórek senescentnych.
- Analiza w czasie rzeczywistym wykazała różnice w tempie proliferacji komórek.
- Porównanie metod uwydatniło zalety i ograniczenia każdego z podejść.
- Uzyskano nowe informacje na temat wpływu mikrośrodowiska na zachowanie komórek nowotworowych.
Wnioski
- Czynniki SASP znacząco wpływają na proliferację niezesenescencyjnych komórek HeLa.
- Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym zwiększają zrozumienie oddziaływań międzykomórkowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu poszukiwania celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena efektów parakrynnych i jukstakrynnych indukowanych przez SASP w kontekście proliferacji komórek nowotworowych pozwala rozwiązać kluczowy problem w zrozumieniu wpływów mikrośrodowiska guza na etapie wczesnych odkryć. Analiza porównawcza trzech metodologii in vitro zapewnia wiarygodność prognostyczną dla walidacji celów terapeutycznych oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesach rozwoju leków onkologicznych. Pozyskane informacje wspierają decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka, wyjaśniając wpływ sekretomów komórek senescencyjnych na sygnalizację proliferacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie sygnalizacji parakrynnej pośredniczonej przez SASP oraz jej roli w proliferacji komórek nowotworowych.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez rozróżnianie efektów parakrynnych od jukstakrynnych w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ilościowe wyniki służące do funkcjonalnej walidacji celów oraz wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Ułatwia zwiększenie pewności prognostycznej przy ustalaniu priorytetów dla celów mikrośrodowiskowych do dalszych badań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane modele kokultury oraz pożywki warunkowane dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary proliferacji z wykorzystaniem impedancji w czasie rzeczywistym oraz obrazowania żywych komórek.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów w celu oceny wpływu związków na proliferację napędzaną przez SASP.
- Przygotowuje solidne platformy do wiarygodnej oceny związków w kontekście mikrośrodowiska.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność wyników in vitro z mechanizmami mikrośrodowiskowymi istotnymi dla przebiegu choroby, zaobserwowanymi w modelach przedklinicznych.
- Wsparcie ciągłości translacyjnej poprzez powiązanie efektów SASP z potencjalnymi biomarkerami proliferacji i odpowiedzi terapeutycznej.
- Umożliwienie podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki wyjaśnieniu wpływu mikrośrodowiska na progresję nowotworu.
- Dostarczenie dowodów mechanistycznych wspierających wybór i walidację modelu przedklinicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metodologia porównawcza integruje się z continuum odkryć – od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, umożliwiając rzetelną ocenę czynników mikrośrodowiskowych napędzających proliferację komórek rakowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji pośredniczonej przez SASP i wyjaśnia różnice między mechanizmami parakrynnymi a jukstakrynnymi.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów proliferacji, odpowiednich do przesiewania związków i opracowywania testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary kinetyczne w czasie rzeczywistym oraz pomiary punktu końcowego do statystycznego porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia in vitro z doborem modeli przedklinicznych i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych czynników mikrośrodowiskowych w ramach programów onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy proliferacji i umożliwia skalowalne, powtarzalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie ryzyk mikrośrodowiskowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów onkologicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, systemach kokultur oraz obsłudze aparatury do analizy w czasie rzeczywistym.
- Wymaga dostępu do infrastruktury monitorowania impedancji w czasie rzeczywistym oraz obrazowania żywych komórek.
- Wymaga standaryzacji protokołów analizy i potoków przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać dostosowania do różnych linii komórkowych lub kontekstów mikrośrodowiskowych.
- Zależne od rzetelnej analizy statystycznej w celu zapewnienia powtarzalności i interpretowalności wyników.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:31
Real‐Time Cell Analysis Setup and Background Recording with HeLa Cell Seeding
2:17
E‐Plate Insert Seeding and Real‐Time Cell Proliferation Analysis
4:11
Preparation of Conditioned Media and Real‐Time Cell Proliferation Assay with HeLa Cells
6:15
Real‐Time Monitoring Cell‐Cell Interaction
7:45
Results
