Name: Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Odkryj elektromechaniczną regulację homeostazy tkanek nabłonkowych za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego. Ta metoda pozwala badać wpływ pól elektrycznych na adhezję, proliferację i ekstruzję komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XJ, PX, FF i TBS dziękują za pomocne rozmowy z dr Xumei Gao, Xinru Yu i innymi członkami grupy z Laboratorium Biofizyki Tkankowej. Dziękujemy Customized Technology Service Facility (CTSF) na Uniwersytecie Westlake za pomoc w przygotowaniu naszego rysunku schematycznego. Prace te były wspierane przez Westlake Education Foundation, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine oraz Research Center for Industries of the Future (RCIF) na Uniwersytecie Westlake.

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Cogan, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+and+recording+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation and recording electrodes.</a> Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+PI3K-%CE%B3+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN.</a> Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).</li>
<li>Saw, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+potential+difference+governs+wound+healing+by+electromechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics.</a> Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).</li>
<li>Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+collective+cell+migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced collective cell migration in vivo.</a> Nat Mater. 24, 452-470 (2025).</li>
<li>Kennard, A. S., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolarity-independent+electrical+response+to+injury+in+zebrafish+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis.</a> Elife. 9, 62386(2020).</li>
<li>Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+keratocyte+galvanotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis.</a> Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).</li>
<li>Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+step+in+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early step in left-right patterning.</a> Cell. 111 (1), 77-89 (2002).</li>
<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+surface+electrical+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li>
<li>Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+ionic+currents+in+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Endogenous ionic currents in embryos.</a> J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).</li>
<li>Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+governing+the+Journal+of+Clinical+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Factors governing the Journal of Clinical Investigation.</a> J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+fields+in+wound+healing-An+overriding+signal+that+directs+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).</li>
<li>Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glabrous+epidermis+in+integrative+and+comparative+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology.</a> Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection-generated+electric+field+in+gut+epithelium+guides+migration+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages.</a> PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+galvanotaxis+assay+in+a+microfluidic+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device.</a> J Vis Exp. (68), e4193(2012).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dimensions+of+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical dimensions of cell signaling.</a> J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+fibroblasts+exposed+to+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields.</a> Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Stoecklin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+design+artificial+3D+microenvironmental+and+rheological+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues.</a> Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).</li>
<li>Khoo, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+patient-derived+circulating+tumor+cells+in+a+microfluidic+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device.</a> Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).</li>
<li>Choudhury, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+epithelial+cells+are+active+mechanosensors+that+drive+physiological+fluid+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps.</a> Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Roy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+rejuvenation+by+mechanical+reprogramming+in+the+National+Academy+of+Sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).</li>
<li>Tao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+creates+a+quiescent+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche.</a> Commun Biol. 6 (1), 43(2023).</li>
<li>Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+differentiation%3A+Perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges.</a> NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).</li>
</ol>

Upewnij się, że wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki i logikę projektowania w celu wytworzenia nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego do przeprowadzania eksperymentów z perturbacją przeznabłonkowego potencjału elektrycznego oraz do badania efektów bioelektrycznych za pomocą metod obrazowania żywych komórek i mechanobiologii. Znaczenie tej metody jest oczywiste w porównaniu z innymi powiązanymi metodami. Na przykład jedna z powiązanych metod wykorzystuje prosty układ mikroprzepływowy o konstrukcji jednokanałowej, który stosuje sta...

Sygnały bioelektryczne są ważnymi czynnikami biofizycznymi przyczyniającymi się do zarządzania zachowaniem komórek. Najbardziej znanym przykładem jest potencjał czynnościowy neuronów i komórek serca, które przesyłają sygnały elektryczne na duże odległości (do metra) i przy wysokich częstotliwościach (do setek Hz)1. Impulsy elektryczne stosowane za pomocą elektrod mogą być wykorzystywane do stymulowania wyzwalania potencjału czynnościowego i są przydatne w badaniach i zastosowaniach medycznych2. Endogenne sygnały bioelektryczne w powolnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój, gojenie się ran i homeostaza 3,4,5,6,7,8 zostały również zmierzone 9,10 w okresie od kilku godzin do dni. Ważnym przykładem są zlewające się warstwy nabłonka, które aktywnie utrzymują różnicę potencjału przeznabłonkowego (TEPD) w zakresie od kilku do kilkudziesięciu miliwoltów 4,11. Cięcie lub zranienie w tych zlewających się warstwach generuje prąd zwarciowy, napędzany przez aktywność elektryczną tkanki12,13. Prądy uzwojone do dziesiątek μA/cm2 i pola elektryczne do setek mV/mm zostały zgłoszone przy użyciu różnych technik. Badania sugerują, że te sygnały elektryczne wytwarzają kierunkową wskazówkę dla komórek do migracji w kierunku ran lub miejsc infekcji, co jest ważne dla procesu gojenia 3,6,14. Ogólnie rzecz biorąc, zarówno statyczne (lub wolno zmieniające się), jak i szybko zmieniające się sygnały elektryczne są ważne i wywołują różne reakcje komórek lub tkanek.
W sferze wolno zmieniających się sygnałów, jednym z ważnych zjawisk jest napędzany elektrycznie proces migracji określany jako "galwanotaksja". Kontrolowane prądy galwaniczne w płaszczyźnie mogą być stosowane w urządzeniach mikroprzepływowych z prostymi kanałami naśladującymi prądy uzwojone, podczas gdy migracja komórek jest badana jako funkcja gęstości prądu15,16. Stwierdzono, że pola elektryczne o natężeniu 0,1-1000 V/m (odpowiadająca im gęstość prądu 0,1-1000 A/m2) napędzają migrację komórek w wielu typach komórek w tym ustawieniu in vitro 17, podczas gdy szlaki sygnałowe kanoniczne do chemotaksji (migracja komórek kierowana gradientami chemicznymi), takie jak PI3K, są zaangażowane w galwanotaksję 7,18. "Podstawowe" urządzenia mikroprzepływowe do badania galwanotaksji mogą być wytwarzane przy użyciu standardowych technik miękkiej litografii i mikrofabrykacji19. Urządzenia te zazwyczaj składają się z jednokanałowego podłoża polidimetylosiloksanowego (PDMS) połączonego ze szkiełkiem podstawowym (rozmiar przekroju kanału: setki mikrometrów, długość: centymetry). Elektrody używane do dostarczania prądu statycznego są instalowane z dala od obszaru ogniwa i połączone z mostkami solnymi lub bez nich. Połączenie mostka solnego można wykonać poprzez wydrążenie otworów w podłożu PDMS, łączników mikroprzepływowych i rurki wypełnione agarem. Prosty szkiełko (zwykle o grubości 170 μm) pod kanałem obsługuje również obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości podczas eksperymentów z galwanotaksją, co jest kluczową cechą dla badania procesu.
Rola endogennych sygnałów elektrycznych w utrzymaniu homeostazy tkanek jest znacznie mniej zrozumiała niż w gojeniu się ran. Jednym z ważnych powodów jest brak odpowiednich narzędzi do badania tych efektów w nienaruszonych tkankach. Urządzenie mikroprzepływowe do galwanotaksji nie nadaje się do tego celu ze względu na swoją geometrię, która obsługuje tylko prądy elektryczne w płaszczyźnie. W kontekście homeostazy nabłonka potrzebne jest nowe urządzenie do kontrolowania i zakłócania TEPD lub prądów poza płaszczyzną przez zlewającą się warstwę nabłonka. Aby osiągnąć cel, jakim jest zastosowanie względnie jednolitej gęstości prądu jonów w monowarstwie, zaprojektowaliśmy i wyprodukowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe z innowacjami w geometrii urządzenia, wykorzystaniu materiałów i możliwościach pomiarów biomechanicznych in situ 4. Ta ostatnia zdolność jest ważna, ponieważ efekty elektryczne mogą wpływać na zachowanie komórek poprzez sprzężenie ze szlakami biomechanicznymi i mechanobiologicznymi, które można badać za pomocą tej funkcji.
To nowe urządzenie wykazuje wiele innowacyjnych funkcji. Został zaprojektowany z dwiema warstwami zamiast pojedynczego kanału, który można znaleźć w urządzeniach galwanotaksyjnych (innowacja w geometrii), przy jednoczesnym zachowaniu połączenia z komorami elektrod podobnymi do tego w tych ostatnich. Pierwsza warstwa mikroprzepływowa ma kanały kierujące prądy jonowe do (lub od) obszaru tkanki, podczas gdy druga warstwa ma otwór, który kieruje ten prąd prostopadle przez nabłonek znajdujący się na szczycie tej drugiej warstwy mikroprzepływowej (ryc. 1A, B). Techniki mikrowytwarzania są stosowane do wytwarzania wystarczająco cienkich warstw, tak aby możliwe było obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości pomimo układania warstw mikroprzepływowych, które zwiększają grubość próbki. W przypadku innych ważnych innowacji, syntetyczny hydrożel poliakryloamidowy (PA) jest wbudowany w środek urządzenia, co odgrywa kluczową rolę (rysunek 1A,B). Właściwości fizykochemiczne tego żelu, takie jak dostępna chemia do powlekania białek macierzy zewnątrzkomórkowej, przepuszczalność jonów, a także znana elastyczność, są odpowiednio niezbędne do przyłączania i wzrostu komórek, stosowania prądów poza płaszczyzną i pomiaru naprężeń mechanicznych20 podczas stymulacji elektrycznej. Struktury barierowe są włączone do warstwy 1 obszaru tkanki w celu uwięzienia roztworu prekursora żelu PA, tak jak to miało miejsce w poprzednich urządzeniach mikroprzepływowych21 (Figura 1A, B). Wreszcie, ponieważ polimeryzacja żelu PA jest hamowana tlenem na powierzchniach PDMS przepuszczalnych dla tlenu, do produkcji urządzeń stosuje się inny materiał22, który może umożliwić polimeryzację i ścisłe wiązanie żelu PA. Wszystkie innowacyjne funkcje są kluczowe, aby nowe urządzenie działało.
Ogólnie rzecz biorąc, dogłębne badanie statycznych lub wolno zmieniających się sygnałów bioelektrycznych w homeostazie nienaruszonych tkanek jest możliwe dzięki temu nowemu urządzeniu, którego protokół zostanie szczegółowo opisany poniżej. Protokół i wyniki, o których mowa tutaj, koncentrują się na linii komórek nabłonkowych Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), w tym na zdarzeniach komórkowych (proliferacja, śmierć i wytłaczanie oraz migracja) oraz zmianach strukturalnych w tkankach, które są indukowane przez prąd elektryczny. Badania te są również pouczające dla badaczy, którzy są zainteresowani zastosowaniem tej techniki do badania elektrycznej regulacji transportu nabłonkowego i indukcji zdarzeń komórkowych oraz zmian losu komórek w warstwach komórkowych i bardziej złożonych systemach, takich jak komórki pierwotne i organoidy 2D.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu, TPM</td><td>Sigma</td><td>2530850</td><td>Po otwarciu przechowywać pod azotem.</td></tr><tr><td>Probówka Falcon 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Przebij 4 otwory w nasadce probówki falcon o pojemności 50 ml, aby elektroda i rurka mogły przejść przez nasadkę i zanurzyć je w medium. Do zestawu urządzenia mikroprzepływowego potrzebne są co najmniej 2 nasadki.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sinopharm powiedział:</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór akrylamidu, 40%</td><td>Sigma</td><td>79061</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Laboratorium OKO</td><td>OKO-AP</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu, APS</td><td>Aladdin</td><td>A112447</td><td></td></tr><tr><td>Nabój</td><td>-</td><td>-</td><td>Wkład jest wykonany na zamówienie, a projekt odnosi się do materiału dodatkowego. Surowiec to PC Makrolon 2858 Medical Grade, a tutaj można znaleźć więcej szczegółów: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US</td></tr><tr><td>Klipy</td><td>-</td><td>-</td><td>Robert Clip, do rurek&nbsp; o średnicy zewnętrznej 4,5 mm.<a href="https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&amp; pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_ Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5.. & spm=a21xtw.29978518.0.0& skuId=3344063585144"> https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144</a></td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Woda DI Milli-Q</td><td>Mili-Q</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM (wysoka glukoza)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11965092</td><td>DMEM++ to DMEM z dodatkowymi 10%&nbsp; FBS (Sigma-Aldrich) oraz 100&thinsp; jednostek/ml Penicylina-Streptomycyna (Gibco).</td></tr><tr><td>Obudowa klatka</td><td>Laboratorium OKO</td><td>Silnik H201</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony epi-fluorescencji</td><td>Olympus</td><td>Zobacz materiał IX83</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sinopharm powiedział:</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Sigma</td><td>F8318 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne, 0,1 &mu; L, czerwony (580/605)</td><td>Thermo</td><td>Zobacz materiał F8801 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Komora gazowa</td><td>Laboratorium OKO</td><td>H201-PRIOR-SP200/400/600</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Ręczny mieszalnik gazu</td><td>Laboratorium OKO</td><td>MIKSER 2GF</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Geneticin (Genetyka)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10131027</td><td>GFP&ndash; aktyna i H1&ndash; GFP MDCK utrzymywano przy użyciu pożywek z dodatkiem 0,5 i cienkich mg/ml genetycyny (Gibco) w celu podtrzymania ekspresji genów</td></tr><tr><td>HEPESY</td><td>Sigma</td><td>736459</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sinopharm powiedział:</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Profesjonalistka</td><td>LH-70155</td><td>Wycieraczka laboratoryjna</td></tr><tr><td>Dłuższa śruba</td><td>-</td><td>-</td><td>Niklowana śruba maszynowa z okrągłym, M3 x 10 mm. <a href="https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp; pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_ 1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.& spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0LG31N"> https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n</a></td></tr><tr><td>Złącze mikroprzepływowe</td><td>-</td><td>-</td><td>Złączka prosta z polipropylenu, 1/16"-10-32UNF. <a href="https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&amp; detail_redpacket_pop=prawda& id=555839592609& LTK2=1752310108435I7LDXJ7EKDGU9qhnPHLMJ& ns=1& priceTId=2150470617523101021033708e1a4b& query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4& skuId=3600497427939& spm=a21n57.1.hoverItem.1& utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D& xxc=taobaoSearch"> https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609&ltk2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch</a></td></tr><tr><td>Uchwyt na płytki wielodołkowe</td><td>Laboratorium OKO</td><td>H201-MW-UCHWYT-NZ500</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>N',N'-metylenobisakrylamid, 2%</td><td>Sigma</td><td>110269</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>NOA 73 (wersja angielska)</td><td>Produkty Norland</td><td>17-345</td><td>Klej utwardzany promieniami UV</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, PS (10 000 U/ml)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (150 mm i ostra 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Odporność na co najmniej 80 stopni; C przez 2 h</td></tr><tr><td>Narzędzie Pico Plasma</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Plazma Pico</td><td>Do obróbki plazmą O2</td></tr><tr><td>Czyścik plazmowy</td><td>Plazma Harricka</td><td>PDC-002 (wersja CDC-002)</td><td>Do obróbki plazmą powietrzną</td></tr><tr><td>Naczynie plastikowe (średnica 60 mm, wysokość 15 mm)</td><td>Gniazdo</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe</td><td>Tianjin Aida Hengsheng</td><td>Pt005 powiedział:</td><td>Średnica 0,5 mm, długość 37 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Rain-X Oryginalny Szklany Wodoodporny</td><td>Produkty chemiczne ITW</td><td>800002242</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe prostokątne</td><td>Lotnisko Marienfeld</td><td>0107222</td><td>&nbsp; 1,5 godziny, 24 i ostre; 50 mm2, 170 &MU; m grubości</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe szklane</td><td>Lotnisko Marienfeld</td><td>0111500</td><td>&nbsp; 1,5H, okrągły o średnicy 10 mm</td></tr><tr><td>Krótsza śruba</td><td>-</td><td>-</td><td>Niklowana śruba maszynowa z okrągłym, M3 x 4 mm. <a href="https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp; pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_ 1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.& spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0LG31N"> https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n</a></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH, bez masy</td><td>Thermo</td><td>Numer telefonu A35395</td><td>Roztwór podstawowy SS: 20 mg/ml w bezwodnym DMSO, 2 &mu; L dla każdego; Roztwór roboczy SS: 0,5 mg/ml SS w HEPES (0,1 M, pH 7,4).</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>H052KCM147</td><td>Produktem końcowym jest polidimetylosiloksan, PDMS. Ten zestaw zawiera podstawową żywicę PDMS i środek sieciujący.&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednostka temperatury</td><td>Laboratorium OKO</td><td>H201-T-UNIT-BL</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina, TEMED</td><td>Sigma</td><td>110189</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Wyświetlacz z ekranem dotykowym</td><td>Laboratorium OKO</td><td>OKO-TOUCH</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo-1-trichlorosilan</td><td>Sigma</td><td>78560459</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Certyfikat Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Tygon</td><td>Tygon</td><td>AJK00002</td><td>Średnica zewnętrzna (OD) = 3,2 mm, Średnica wewnętrzna (ID) = 1,6 mm</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa</td><td>Wsparcie</td><td>KD-300DE</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do utwardzania UV LED</td><td>GHUV</td><td>GHS-MFLG</td><td>Źródło światła UV-LED, zakres emisji: 363&ndash; 370 nm, maksymalna gęstość mocy: 230 mW/cm2</td></tr><tr><td>Moduł nawilżający bez wibracji</td><td>Laboratorium OKO</td><td>HM-VF</td><td>Element inkubatora mikroskopowego stage-top</td></tr><tr><td>Widok Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>-</td><td>Obrazowanie bardziej miękkich wyrobów</td></tr><tr><td>Warstwa wafla1</td><td>Narodowy Uniwersytet Singapuru, zakład mikrofabrykacji Instytutu Mechanobiologii</td><td>-</td><td>Wafel jest wykonywany na zamówienie, a projekt nawiązuje do materiału dodatkowego.</td></tr><tr><td>Warstwa wafla2</td><td>Narodowy Uniwersytet Singapuru, zakład mikrofabrykacji Instytutu Mechanobiologii</td><td>-</td><td>Wafel jest wykonywany na zamówienie, a projekt nawiązuje do materiału dodatkowego.</td></tr></tbody></table>

ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Revealing Electromechanical Control of Tissue Homeostasis Using a Two-Layer Microfluidic Device

Na zachowanie i los komórki mają wpływ prądy elektryczne lub pola, które są endogenne lub stosowane zewnętrznie. Statyczne sygnały elektryczne mogą być stosowane w niestandardowych urządzeniach mikroprzepływowych w celu naśladowania środowiska elektrycznego w powolnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój, gojenie się ran i homeostaza. Ważną klasą badań elektryczności komórkowej jest kontrola migracji komórek za pomocą statycznych prądów galwanicznych w płaszczyźnie w prostych kanałach mikroprzepływowych naśladujących prądy uzwojone, o gęstości prądu ~0,1-1000 A/m2. Jednak ze względu na niekompatybilną geometrię urządzenia te nie są odpowiednie do badania efektów elektrycznych w homeostazie tkanek, w której komórki przyjmują polaryzację apiko-podstawową i transnabłonkową różnicę potencjałów (TEPD). W tym miejscu szczegółowo opisujemy unikalne urządzenie oparte na mikroprzepływach, które stosuje fizjologiczne prądy jonowe prostopadłe do płaszczyzny zbiegających się warstw komórek nabłonka, aby zakłócić TEPD i zbadać elektryczną regulację stanów równowagi tkanek. Zestaw jest wykonany z dwuwarstwowego polimeru utwardzanego promieniami UV osadzonego w miękkim podłożu z żelu poliakrylamidowego pokrytego wybranym białkiem o macierzy zewnątrzkomórkowej. To urządzenie mikroprzepływowe zapewnia prawidłową geometrię i przepuszczalne podłoże, aby indukować stosunkowo równomierny prąd jonowy w warstwach komórek w skali centymetrowej. Konfiguracja jest kompatybilna z konfokalnym obrazowaniem żywych komórek i mikroskopią sił trakcyjnych w celu wywnioskowania naprężeń mechanicznych wywołanych prądami transnabłonkowymi. Uderzające jest to, że proliferacja, ekstruzja i migracja komórek są kolektywnie wpływane w zlewającym się nabłonku w zależności od kierunku prądu jonowego, indukując nowy stan tkanki charakteryzujący się różną siłą interakcji komórka-komórka, zdarzeniami komórkowymi (śmierć i proliferacja) oraz strukturami tkankowymi. Elektrycznie kontrolowane zachowanie komórki można rozumieć jako elektrycznie wywołane naprężenie mechaniczne i odpowiedź komórki. To nowatorskie urządzenie mikroprzepływowe i protokół zapewniają narzędzie i dokumentację niezbędną społecznościom mechanobiologii i bioinżynierii do badania efektów elektrycznych w homeostazie tkanek i opracowywania nowych zastosowań inżynierii tkankowej.

Wszystkie przedstawione tutaj wyniki są adaptacją poprzedniej publikacji4; Więcej informacji można znaleźć w tej publikacji.
Protokół ten umożliwia zastosowanie zewnętrznego prądu jonowego lub pola elektrycznego prostopadłego do płaszczyzny komórek lub tkanek. Ta stymulacja elektryczna zaburza endogenną przeznabłonkową różnicę potencjałów elektrycznych (TEPD) i pozwala badać rolę TEPD w regulowaniu zachowania tkanek. Zgodnie z protokołem, komórki MDCK typu dzikiego i ge...

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Cell behavior and cell fate are impacted by electric currents or fields that are endogenous or externally applied. Static electric signals can be applied ...

Stosujemy kontrolowane pola elektryczne, aby zbadać, jak tkanki reagują na sygnały elektryczne, koncentrując się na tym, jak prądy lub pola regulują adhezję, proliferację i ekstruzję komórek, wpływając na homeostazę tkanek. Odkryliśmy, że kierunek fizjologicznie istotnych prądów dyktuje stany tkanek. Pole wierzchołkowe do podstawnego indukowało fenotyp proliferacyjny, podczas gdy pole od podstawowego do wierzchołkowego sprzyja ekstruzji komórek, umożliwiając modulację ogólnej gęstości komórek.Podczas gdy ilościowe badania bioelektryczne od dawna koncentrują się na migracji poprzez grawitaksję, homeostaza tkanek pozostaje niedostępna. Nasz system umożliwia teraz bezpośrednie badanie, w jaki sposób kartony fizjologiczne regulują organizację i utrzymanie tkanek. Nasz protokół integruje mikrofluidykę, elektryczną stymulację tkanek, mikroskopię struktury i sił oraz obrazowanie na żywo w celu zbadania elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek.Nasze prace ujawniły podstawowe zasady sprzęgania elektromechanicznego. Dzięki nowym narzędziom możemy teraz zbadać, w jaki sposób powstają natywne wzorce bioelektryczne i regulują tkanki oraz czy możemy kontrolować złożone zachowanie tkanek poprzez dostrajanie tych elektromechanicznych sygnałów. Na początek umieść czystą warstwę jednej formy polidimetylosiloksanu lub PDMS, twarzą do góry na czystej plastikowej nasadce naczynia i powoli dodaj 500 mikrolitrów płynnego kleju utwardzanego ultrafioletem na formę.Za pomocą szpatułki ostrożnie zwilż wszystkie wystające struktury i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas procesu zwilżania. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do formy PDMS i użyj wycieraczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar kleju utwardzanego ultrafioletem, upewniając się, że górna strona szkiełka nakrywkowego pozostaje czysta i płaska. Utwardź strukturę częściowo pod równomiernie oświetlonym światłem ultrafioletowym o długości fali od 363 do 370 nanometrów.Zetrzyj wszelkie ślady za pomocą 75% etanolu. Następnie mocno przytrzymaj strukturę na płaskiej powierzchni i powoli oderwij formę PDMS od utwardzonej warstwy pierwszej. Następnie umieść czystą warstwę dwóch form PDMS zadrukowaną stroną do dołu na płaskiej płycie PDMS o grubości większej niż 2.5 milimetra.Delikatnie postukaj w elementy formy od góry za pomocą pęsety. Obserwuj interfejs pod funkcjami przyciemniania lub kontrastu optycznego, który potwierdza prawidłowy kontakt. Teraz wypełnij przestrzeń między formą PDMS a płytą płynnym klejem utwardzanym promieniowaniem ultrafioletowym przez działanie kapilarne.Częściowo utwardź strukturę w świetle ultrafioletowym przez 10 sekund, jak pokazano wcześniej. Użyj miękko wyściełanej pęsety, aby delikatnie oderwać kompozytową warstwę kleju utwardzaną ultrafioletem i formę PDMS z płyty PDMS. W razie potrzeby przyciąć nadmiar krawędzi utwardzonej warstwy kleju ostrymi nożyczkami.Następnie umieść warstwę pierwszą przymocowaną do prostokątnego szklanego szkiełka nakrywkowego na płaskiej powierzchni. Wyrównaj warstwę drugą, nadal przymocowaną do formy PDMS, z warstwą pierwszą i mocno dociśnij obie warstwy do siebie, aż pod elementami pojawią się cienie. Utwardź wyrównaną strukturę w świetle ultrafioletowym przez 10 sekund, aby połączyć warstwy pierwszą i dwie w dwuwarstwowy chip mikroprzepływowy, a następnie delikatnie oderwij formę PDMS od połączonego chipa.Natychmiast odpipetować 10 mikrolitrów roztworu prekursora żelu poliakryloamidowego na środek obszaru tkanki bezpośrednio nad szczeliną w warstwie drugiej. Delikatnie dociśnij okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 milimetrów do kropli, aby utworzyć płaski żel. Obserwuj, jak roztwór żelu przepływa do warstwy pierwszej przez szczelinę i zatrzymuje się w rzędzie filarów bariery.Natychmiast utwardź zmontowany chip mikroprzepływowy w świetle ultrafioletowym przez pięć minut. Następnie pozostaw wiór w spokoju na około godzinę, aby żel poliakrylamidowy w pełni zastygł. Następnie inkubować chip mikroprzepływowy w 0,1-molowym buforze HEPES o pH 7,4 przez co najmniej jedną godzinę, aby uwodnić żel i zmniejszyć przyczepność między żelem a szkiełkiem nakrywkowym.Następnie delikatnie użyj ostrej pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe z powierzchni żelu. Umieść wkład z poliwęglanu klasy medycznej na płaskiej powierzchni spodem do góry i wyrównaj wysuszony wiór stroną zadrukowaną do dołu z wkładem. Odpipetuj klej utwardzany promieniami UV w szczelinach między chipem a wkładem, wypełniając je za pomocą efektu kapilarnego i utwardzaj go w świetle UV.Wysterylizuj wyprodukowane urządzenia mikroprzepływowe, umieszczając je w świetle ultrafioletowym o długości od 200 do 280 nanometrów w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotuj wymaganą objętość 50 mikrogramów na mililitr kolagenu jeden roztwór roboczy w 1X DPBS na lodzie. Na lodzie przygotować roztwór roboczy Sulfo-SANPAH rozcieńczając dwa mikrolitry roztworu podstawowego Sulfo-SANPAH, uprzednio rozpuszczonego w bezwodnym dimetylosulfotlenku w 80 mikrolitrach zimnego 0,1 molowego buforu HEPES o pH 7,4 przechowywanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przetrzyj krawędzie żelu poliakrylamidowego chusteczkami laboratoryjnymi, aby wysuszyć go wewnątrz urządzenia. Odpipetować 80 mikrolitrów roztworu roboczego Sulfo-SANPAH na powierzchnię żelu, zapewniając pełne zanurzenie, i umieścić chip w świetle ultrafioletowym na pięć minut, aby aktywować Sulfo-SANPAH. Spłukać żel trzykrotnie zimnym 0,1 molowym buforem HEPES o pH 7,4.Powtórzyć zabieg Sulfo-SANPAH, pipetując 80 mikrolitrów roztworu roboczego SS na żel i naświetlając go światłem ultrafioletowym przez pięć minut. Tym razem spłucz żel trzykrotnie zimnym 1X DPBS. Na koniec nanieś pipetą 100 mikrolitrów kolagenu w jednym roztworze na żel poliakrylamidowy, zapewniając całkowite pokrycie, i pozostaw na godzinę.Spłucz nieprzyłączony kolagen za pomocą 1X DPBS trzy razy, a następnie trzymaj żel zanurzony w 1X DPBS do dalszego użycia. Przymocuj urządzenia do wkładek za pomocą. Następnie przymocuj do uchwytu przeznaczonego do montażu na stoliku mikroskopu do czterech wkładek urządzenia.Dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do każdej głównej studzienki urządzeń i przez kanały usuwania odpadów, aby wypłukać i wymienić 1X DPBS. Następnie włóż elektrody platynowe do probówki zawierającej 45 mililitrów pożywki, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w medium. Przeciągnąć pożywkę hodowlaną przez rurkę Tygon za pomocą strzykawki i mocno ją zacisnąć.Podłącz jeden koniec rurki wypełnionej medium do komory elektrody, a drugi koniec do urządzenia. Teraz przygotuj zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z zaleceniami dotyczącymi trypsynizacji lub przygotowania zawiesiny komórkowej i zasiej 0,1 miliona komórek do głównej studzienki. Zamontuj zestaw na mikroskopie z komorami elektrod po bokach i podłącz miernik źródłowy do komory elektrody.Użyj trzech urządzeń o identycznej rezystancji kanału. Przypisz jedną z nich jako grupę kontrolną. Zastosuj prąd wierzchołkowy do podstawowego do drugiego urządzenia i prąd podstawowy do wierzchołkowego do trzeciego urządzenia.Źródło sygnału elektrycznego w trybie cęgów prądowych i dostarczenie łącznego prądu o natężeniu 20 mikroamperów. Wybierz soczewkę obiektywową 20X do obrazowania całych tkanek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Na koniec wybierz kanał 561 dla kanałów czerwonej fluorescencji i jasnego pola.Wybierz jeden godzinny interwał czasu podczas długotrwałego obrazowania. Stymulację elektryczną zastosowano prostopadle do komórek, aby zakłócić potencjał przeznabłonkowy w celu zbadania jego roli w zachowaniu tkanek pod różnymi kierunkami prądu. Obrazowanie z kontrastem fazowym, prądy wierzchołkowe do podstawowego lub ATB, powodowały rozjaśnienie połączeń komórkowych w ciągu 10 minut od aplikacji, podczas gdy kontrolne i podstawowe do wierzchołkowego, warunki BTA, wykazały niski kontrast i płaskie powierzchnie wierzchołkowe.Prądy ATB wytwarzały wypukłość na zewnątrz na wierzchołkowej powierzchni komórki. Deformacja żelu była silnie uzależniona od kierunku prądu. Prądy ATB ciągnęły żel w górę, podczas gdy prądy BTA ściskały żel w dół.Intensywność złączowej E-kadheryny wzrastała pod prądami BTA, ale znacznie zmniejszała się pod prądami ATB w porównaniu z kontrolą. Intensywność aktyny połączeniowej zmniejszyła się pod prądami ATB, ale nie wzrosła znacząco pod prądami BTA w stosunku do kontroli. Prądy ATB wyzwalały wielokomórkowe ekstruzje żywych komórek w poprzek monowarstwy, podczas gdy prądy BTA zachowywały strukturę jednowarstwową, podobnie jak w przypadku kontroli.Niejednorodność przestrzenna w rozmieszczeniu komórek była znacznie wyższa w przypadku prądów ATB, ale pozostawała niska i jednolita w warunkach BTA i kontrolnych. Tempo proliferacji komórek wzrosło pod wpływem stymulacji ATB, z wyższymi wskaźnikami podziału w czasie. W przeciwieństwie do tego, prądy BTA indukowały więcej zdarzeń śmierci komórki.

revealing-electromechanical-control-tissue-homeostasis-using-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy protokoły wytwarzania i automatyzacji macierzy mikrozaworów opartych na elastomerowym polidimetylosiloksanie (PDMS), które nie wymagają dodatkowej energii do zamknięcia i charakteryzują się precyzyjnymi objętościami zdefiniowanymi fotolitograficznie. Przedstawiono równoległy mieszalnik o objętości subnanolitrowej oraz zintegrowany mikrofluidyczny system perfuzyjny.

Chip mikrofluidyczny sterowany macierzami elastomerowych mikrozaworów

Prezentujemy sposób wykonania prostego urządzenia mikroprzepływowego, które można zintegrować ze standardowymi zestawami do elektrofizjologii, aby w kontrolowany sposób eksponować mikroskalowe powierzchnie skrawka mózgu na działanie różnych neuroprzekaźników.

Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Analiza żywej tkanki w czasie rzeczywistym dostarcza ważnych danych funkcjonalnych i mechanistycznych. W tym artykule opisano protokoły i zmienne krytyczne w celu zapewnienia dokładnego i powtarzalnego generowania danych przez nowatorski i niewymagający pompowania wielokanałowy system fluidyki, który utrzymuje i ocenia szeroką gamę modeli tkanek i komórek.

Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Odkryj elektromechaniczną regulację homeostazy tkanek nabłonkowych za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego. Ta metoda pozwala badać wpływ pól elektrycznych na adhezję, proliferację i ekstruzję komórek.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów