Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Stosujemy kontrolowane pola elektryczne, aby zbadać, jak tkanki reagują na sygnały elektryczne, koncentrując się na tym, jak prądy lub pola regulują adhezję, proliferację i ekstruzję komórek, wpływając na homeostazę tkanek. Odkryliśmy, że kierunek fizjologicznie istotnych prądów dyktuje stany tkanek. Pole wierzchołkowe do podstawnego indukowało fenotyp proliferacyjny, podczas gdy pole od podstawowego do wierzchołkowego sprzyja ekstruzji komórek, umożliwiając modulację ogólnej gęstości komórek.

Podczas gdy ilościowe badania bioelektryczne od dawna koncentrują się na migracji poprzez grawitaksję, homeostaza tkanek pozostaje niedostępna. Nasz system umożliwia teraz bezpośrednie badanie, w jaki sposób kartony fizjologiczne regulują organizację i utrzymanie tkanek. Nasz protokół integruje mikrofluidykę, elektryczną stymulację tkanek, mikroskopię struktury i sił oraz obrazowanie na żywo w celu zbadania elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek.

Nasze prace ujawniły podstawowe zasady sprzęgania elektromechanicznego. Dzięki nowym narzędziom możemy teraz zbadać, w jaki sposób powstają natywne wzorce bioelektryczne i regulują tkanki oraz czy możemy kontrolować złożone zachowanie tkanek poprzez dostrajanie tych elektromechanicznych sygnałów. Na początek umieść czystą warstwę jednej formy polidimetylosiloksanu lub PDMS, twarzą do góry na czystej plastikowej nasadce naczynia i powoli dodaj 500 mikrolitrów płynnego kleju utwardzanego ultrafioletem na formę.

Za pomocą szpatułki ostrożnie zwilż wszystkie wystające struktury i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas procesu zwilżania. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do formy PDMS i użyj wycieraczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar kleju utwardzanego ultrafioletem, upewniając się, że górna strona szkiełka nakrywkowego pozostaje czysta i płaska. Utwardź strukturę częściowo pod równomiernie oświetlonym światłem ultrafioletowym o długości fali od 363 do 370 nanometrów.

Zetrzyj wszelkie ślady za pomocą 75% etanolu. Następnie mocno przytrzymaj strukturę na płaskiej powierzchni i powoli oderwij formę PDMS od utwardzonej warstwy pierwszej. Następnie umieść czystą warstwę dwóch form PDMS zadrukowaną stroną do dołu na płaskiej płycie PDMS o grubości większej niż 2.5 milimetra.

Delikatnie postukaj w elementy formy od góry za pomocą pęsety. Obserwuj interfejs pod funkcjami przyciemniania lub kontrastu optycznego, który potwierdza prawidłowy kontakt. Teraz wypełnij przestrzeń między formą PDMS a płytą płynnym klejem utwardzanym promieniowaniem ultrafioletowym przez działanie kapilarne.

Częściowo utwardź strukturę w świetle ultrafioletowym przez 10 sekund, jak pokazano wcześniej. Użyj miękko wyściełanej pęsety, aby delikatnie oderwać kompozytową warstwę kleju utwardzaną ultrafioletem i formę PDMS z płyty PDMS. W razie potrzeby przyciąć nadmiar krawędzi utwardzonej warstwy kleju ostrymi nożyczkami.

Następnie umieść warstwę pierwszą przymocowaną do prostokątnego szklanego szkiełka nakrywkowego na płaskiej powierzchni. Wyrównaj warstwę drugą, nadal przymocowaną do formy PDMS, z warstwą pierwszą i mocno dociśnij obie warstwy do siebie, aż pod elementami pojawią się cienie. Utwardź wyrównaną strukturę w świetle ultrafioletowym przez 10 sekund, aby połączyć warstwy pierwszą i dwie w dwuwarstwowy chip mikroprzepływowy, a następnie delikatnie oderwij formę PDMS od połączonego chipa.

Natychmiast odpipetować 10 mikrolitrów roztworu prekursora żelu poliakryloamidowego na środek obszaru tkanki bezpośrednio nad szczeliną w warstwie drugiej. Delikatnie dociśnij okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 milimetrów do kropli, aby utworzyć płaski żel. Obserwuj, jak roztwór żelu przepływa do warstwy pierwszej przez szczelinę i zatrzymuje się w rzędzie filarów bariery.

Natychmiast utwardź zmontowany chip mikroprzepływowy w świetle ultrafioletowym przez pięć minut. Następnie pozostaw wiór w spokoju na około godzinę, aby żel poliakrylamidowy w pełni zastygł. Następnie inkubować chip mikroprzepływowy w 0,1-molowym buforze HEPES o pH 7,4 przez co najmniej jedną godzinę, aby uwodnić żel i zmniejszyć przyczepność między żelem a szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie delikatnie użyj ostrej pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe z powierzchni żelu. Umieść wkład z poliwęglanu klasy medycznej na płaskiej powierzchni spodem do góry i wyrównaj wysuszony wiór stroną zadrukowaną do dołu z wkładem. Odpipetuj klej utwardzany promieniami UV w szczelinach między chipem a wkładem, wypełniając je za pomocą efektu kapilarnego i utwardzaj go w świetle UV.

Wysterylizuj wyprodukowane urządzenia mikroprzepływowe, umieszczając je w świetle ultrafioletowym o długości od 200 do 280 nanometrów w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotuj wymaganą objętość 50 mikrogramów na mililitr kolagenu jeden roztwór roboczy w 1X DPBS na lodzie. Na lodzie przygotować roztwór roboczy Sulfo-SANPAH rozcieńczając dwa mikrolitry roztworu podstawowego Sulfo-SANPAH, uprzednio rozpuszczonego w bezwodnym dimetylosulfotlenku w 80 mikrolitrach zimnego 0,1 molowego buforu HEPES o pH 7,4 przechowywanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przetrzyj krawędzie żelu poliakrylamidowego chusteczkami laboratoryjnymi, aby wysuszyć go wewnątrz urządzenia. Odpipetować 80 mikrolitrów roztworu roboczego Sulfo-SANPAH na powierzchnię żelu, zapewniając pełne zanurzenie, i umieścić chip w świetle ultrafioletowym na pięć minut, aby aktywować Sulfo-SANPAH. Spłukać żel trzykrotnie zimnym 0,1 molowym buforem HEPES o pH 7,4.

Powtórzyć zabieg Sulfo-SANPAH, pipetując 80 mikrolitrów roztworu roboczego SS na żel i naświetlając go światłem ultrafioletowym przez pięć minut. Tym razem spłucz żel trzykrotnie zimnym 1X DPBS. Na koniec nanieś pipetą 100 mikrolitrów kolagenu w jednym roztworze na żel poliakrylamidowy, zapewniając całkowite pokrycie, i pozostaw na godzinę.

Spłucz nieprzyłączony kolagen za pomocą 1X DPBS trzy razy, a następnie trzymaj żel zanurzony w 1X DPBS do dalszego użycia. Przymocuj urządzenia do wkładek za pomocą. Następnie przymocuj do uchwytu przeznaczonego do montażu na stoliku mikroskopu do czterech wkładek urządzenia.

Dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do każdej głównej studzienki urządzeń i przez kanały usuwania odpadów, aby wypłukać i wymienić 1X DPBS. Następnie włóż elektrody platynowe do probówki zawierającej 45 mililitrów pożywki, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w medium. Przeciągnąć pożywkę hodowlaną przez rurkę Tygon za pomocą strzykawki i mocno ją zacisnąć.

Podłącz jeden koniec rurki wypełnionej medium do komory elektrody, a drugi koniec do urządzenia. Teraz przygotuj zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z zaleceniami dotyczącymi trypsynizacji lub przygotowania zawiesiny komórkowej i zasiej 0,1 miliona komórek do głównej studzienki. Zamontuj zestaw na mikroskopie z komorami elektrod po bokach i podłącz miernik źródłowy do komory elektrody.

Użyj trzech urządzeń o identycznej rezystancji kanału. Przypisz jedną z nich jako grupę kontrolną. Zastosuj prąd wierzchołkowy do podstawowego do drugiego urządzenia i prąd podstawowy do wierzchołkowego do trzeciego urządzenia.

Źródło sygnału elektrycznego w trybie cęgów prądowych i dostarczenie łącznego prądu o natężeniu 20 mikroamperów. Wybierz soczewkę obiektywową 20X do obrazowania całych tkanek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Na koniec wybierz kanał 561 dla kanałów czerwonej fluorescencji i jasnego pola.

Wybierz jeden godzinny interwał czasu podczas długotrwałego obrazowania. Stymulację elektryczną zastosowano prostopadle do komórek, aby zakłócić potencjał przeznabłonkowy w celu zbadania jego roli w zachowaniu tkanek pod różnymi kierunkami prądu. Obrazowanie z kontrastem fazowym, prądy wierzchołkowe do podstawowego lub ATB, powodowały rozjaśnienie połączeń komórkowych w ciągu 10 minut od aplikacji, podczas gdy kontrolne i podstawowe do wierzchołkowego, warunki BTA, wykazały niski kontrast i płaskie powierzchnie wierzchołkowe.

Prądy ATB wytwarzały wypukłość na zewnątrz na wierzchołkowej powierzchni komórki. Deformacja żelu była silnie uzależniona od kierunku prądu. Prądy ATB ciągnęły żel w górę, podczas gdy prądy BTA ściskały żel w dół.

Intensywność złączowej E-kadheryny wzrastała pod prądami BTA, ale znacznie zmniejszała się pod prądami ATB w porównaniu z kontrolą. Intensywność aktyny połączeniowej zmniejszyła się pod prądami ATB, ale nie wzrosła znacząco pod prądami BTA w stosunku do kontroli. Prądy ATB wyzwalały wielokomórkowe ekstruzje żywych komórek w poprzek monowarstwy, podczas gdy prądy BTA zachowywały strukturę jednowarstwową, podobnie jak w przypadku kontroli.

Niejednorodność przestrzenna w rozmieszczeniu komórek była znacznie wyższa w przypadku prądów ATB, ale pozostawała niska i jednolita w warunkach BTA i kontrolnych. Tempo proliferacji komórek wzrosło pod wpływem stymulacji ATB, z wyższymi wskaźnikami podziału w czasie. W przeciwieństwie do tego, prądy BTA indukowały więcej zdarzeń śmierci komórki.