Name: Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania chrząstek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim. Protokół umożliwia szczegółową analizę morfogenezy podniebienia na poziomie tkankowym i komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Kalidasowi Kohale'owi i jego zespołowi za utrzymanie obiektu rybackiego. SRN przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej (DAE), rządu Indii (nr identyfikacyjny projektu. RTI4003, DAE OM nr 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 z dnia 11.02.2020 r.), program Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) oraz grant na badania nad start-upami Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SRG/2023/001716). Dziękujemy dr Shweta Verma z laboratorium za wnikliwe komentarze. Dziękujemy Swetha Nagarajan i Upal Chatterjee za pomoc w wykonaniu rycin do rękopisu.

Procedury utrzymania danio pręgowanego i procedury eksperymentalne zastosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt, vide odniesienie TIFR/IAEC/2023-1.
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Nośniki E3:<ol>
		<li>Przygotuj 50x bulion 1 mieszając 3,25 g dwuzasadowego fosforanu sodu (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g diwodorofosforanu potasu (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g chlorku sodu (4,084 mM NaCl) i 0,48 g chlorku potasu (0,128 mM KCl) w 1 l wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotuj 50x stock 2 mieszając 2,43 g chlorku wapnia (0,33 mM CaCl2) i 4,07 g siarczanu magnezu (0,33 mMMgSO4) w 1 l wody destylowanej.</li>
		<li>Aby przygotować 500 ml pożywki 1x E3, do 480 ml wody destylowanej, dodaj po 10 ml z podstawowych 1 i 2 (pH = 7,4). UWAGA: Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawice.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami):<ol>
		<li>Podgrzej 100 ml 1x PBS w temperaturze 68 °C. Dodać 4 g PFA i inkubować roztwór w temperaturze 68 °C z okresowym mieszaniem, aż do całkowitego rozpuszczenia PFA. UWAGA: Podczas przygotowywania tego odczynnika należy nosić rękawice i maskę, najlepiej pod wyciągiem, ponieważ PFA jest wysoce toksyczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,05% roztwór MS-222 (powszechnie znany jako trikaina):<ol>
		<li>Przygotuj 4% wywaru z tricainy w E3 i przechowuj w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 10 ml bulionu tricaine, dodaj 0,40 g MS-222 do 7 ml E3. Delikatnie wstrząsnąć probówką z roztworem, aby wymieszać i uzupełnić objętość do 10 ml. Aby przygotować 50 ml 0,05% roztworu tricainy, dodaj 625 μl 4% bulionu do 49,375 ml E3. UWAGA: Podczas przygotowywania tego odczynnika należy nosić rękawiczki i maskę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,4% roztwór podstawowy błękitu alcyjskiego w 70% etanolu<ol>
		<li>Aby przygotować 2 ml roztworu podstawowego, rozpuścić 8 mg błękitu alcian w 1 ml 50% etanolu. Podgrzewać roztwór w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut z okresowym mieszaniem w celu rozpuszczenia. Gdy plama się rozpuści, uzupełnić roztwór do 70% etanolu, dodając 900 μl 100% etanolu i 100 μl wody destylowanej. UWAGA: Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór barwie - 0,02% błękitu alckiego, 200 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 70% etanolu<ol>
		<li>Aby przygotować 5 ml roztworu niebieskiej plamy Alcian, dodaj 1 ml 1 M MgCl2, 3,5 ml 100% etanolu i 250 μl 0,4% bulionu błękitu alkijskiego (8 mg błękitu alcyjskiego w 2 ml 70% etanolu) do 250 μl wody i dobrze wymieszaj. UWAGA: Przygotuj świeży roztwór do barwienia, aby uzyskać najlepsze rezultaty barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór wybielacza:<ol>
		<li>Wymieszać równe objętości 3% nadtlenku wodoru (H2O2) i 2% wodorotlenku potasu (KOH). Aby przygotować 2 ml roztworu wybielacza, wymieszaj 1 ml 3% nadtlenku wodoru i 1 ml 2% wodorotlenku potasu. UWAGA: Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem tego kroku. PonieważH2O2jest wrażliwy na światło, należy go w miarę możliwości chronić przed wystawieniem na działanie światła. Nosić rękawice podczas obchodzenia się zH2,O2 i KOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór I: 20% glicerolu + 0,25% KOH UWAGA: Ponieważ glicerol jest bardzo lepki, należy ostrożnie pipetować. Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawiczki.<ol>
		<li>Aby przygotować 5 ml roztworu I, dodaj 2 ml 50% glicerolu i 625 μl 2% KOH do 2,375 ml wody i dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór II: 50% glicerolu + 0,25% KOH<ol>
		<li>Aby przygotować 5 ml roztworu II, dodaj 3,570 ml 70% glicerolu i 625 μl 2% KOH do 805 μl wody i dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do przechowywania: 50% glicerol + 0,1% KOH<ol>
		<li>Aby przygotować 5 ml roztworu do przechowywania, dodaj 3,570 ml 70% glicerolu i 250 μl 2% KOH do 1,180 ml wody i dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3% agarozy<ol>
		<li>Rozpuść 3 g agarozy w 100 ml wody destylowanej. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,1% PBST (0,1% Animacja 20 w 1x PBS)<ol>
		<li>Aby przygotować 1 l 1x PBS, dodaj 8 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 1,000 ml wody destylowanej. Wymieszać roztwór i dostosować pH do 7,4. Aby uzyskać 500 ml 0,1% PBST, dodaj 5 ml 10% Tween 20 do 495 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,50 μg/ml roztworu DAPI<ol>
		<li>Przygotuj 10 mg / ml bulionu DAPI w 1x PBS. Aby przygotować 10 ml 0,50 μg/ml roztworu DAPI, dodaj 0,50 μl bulionu do 10 ml 1x PBS i energicznie wstrząśnij, aby upewnić się, że DAPI całkowicie się rozpuści. UWAGA: Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawice. Chroń DAPI przed światłem, ponieważ jest wrażliwy na światło. Zapas DAPI może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez ponad rok.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Ustaw pary samców i samic danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych wieczorem przed potrzebnymi zarodkami, przy czym samce i samice ryb są oddzielone barierami.</li>
	<li>Usuń bariery następnego ranka i zbierz zarodki w ciągu 15-20 minut po usunięciu barier. UWAGA: Czas usunięcia bariery jest pomocny w inscenizacji zarodków i larw danio pręgowanego.</li>
	<li>Hodować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną 5 dpf. UWAGA: Pamiętaj, aby wymieniać nośnik E3 na nową partię podgrzanego E3 w temperaturze 28.5 °C raz na 2 dni.</li>
</ol>
3. Barwienie niebieskim alkijskim
UWAGA: Podczas wykonywania tego eksperymentu noś rękawiczki
<ol>
	<li>Znieczulij 20-25 5-dniowych larw danio pręgowanego za pomocą 0,05% trikainy w probówce do mikrowirówki (MCT) o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Po tym, jak larwy przestaną się poruszać, co zwykle trwa ~ 4-5 minut, usuń środek znieczulający i umieść je w 1,5 ml 4% PFA w temperaturze pokojowej (RT) na bujaku przy 60 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Usunąć jak najwięcej utrwalacza za pomocą pipety i dodać 1,5 ml 50% etanolu do próbki. Inkubuj przez 10 minut, kołysząc się z prędkością 60 obr./min przy RT.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej etanolu za pomocą pipety i dodaj 1,5 ml roztworu niebieskiej plamy Alcian.</li>
	<li>Utrwalone larwy należy inkubować w roztworze barwienia przez 18-20 godzin na bujaczku przy 60 obr./min przy temperaturze pokojowej. UWAGA: Inkubacja przez krótszy lub dłuższy czas może prowadzić do tego, że niektóre obszary chrząstki są odpowiednio niedobarwione lub nadmiernie przebarwione. W tym przypadku 18-20 godzin barwienia wydawało się działać najlepiej dla wyraźnej wizualizacji neuro i trzewiowoczaszki 5-dniowej larwy.</li>
	<li>Usuń roztwór plamy, dodaj 1,5 ml wody destylowanej i inkubuj przez 1-2 minuty na bujaczku w temperaturze pokojowej. UWAGA: Barwienie można zatrzymać na tym etapie, aby uwidocznić granice komórek w wypreparowanych chrząstkach. Jednak wadą zatrzymania protokołu barwienia na tym etapie bez wykonania kolejnych kroków oczyszczania jest to, że granice neuro i trzewiowoczaszki nadal pozostaną lekko rozmyte, a precyzyjne wykonanie sekcji staje się trudniejsze.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu wybielacza do próbki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na otwartym powietrzu, bez przykrycia płytki lub studzienek. UWAGA: Nie zakrywaj MCT na tym etapie, ponieważ reakcja między nadtlenkiem wodoru a wodorotlenkiem potasu wytwarza gazowy tlen, który może spowodować pęknięcie pokrywy po zamknięciu.</li>
	<li>Usuń roztwór wybielacza i wykonaj następujące kroki oczyszczania tkanek.<ol>
		<li>Dodać 1,5 ml roztworu I do próbki i trzymać na kołysce z prędkością 60 obr./min przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór I i dodać 1,5 ml roztworu II do próbki i trzymać na kołysce z prędkością 60 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. UWAGA: Etapy oczyszczania pomagają usunąć nadmiar plamy, poprawiając przejrzystość optyczną próbek, a tym samym pomagając w efektywnym przeprowadzaniu sekcji. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie podczas zmiany roztworów, ponieważ wszelkie uszkodzenia mogą wpłynąć na przyszłą analizę ich morfologii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć roztwór II i dodać 1,5-2 ml roztworu do przechowywania. Ze względu na obecność glicerolu wybarwione próbki stopniowo opadają na dno w ciągu 10 minut. UWAGA: Barwione próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ponad rok.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie szkieletu twarzoczaszki
<ol>
	<li>Rozpuść 3% roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej, aż roztwór stanie się klarowny. UWAGA: Nie przegrzewać, ponieważ roztwór może wypłynąć z kolby. Podczas wykonywania tego kroku dokładnie sprawdź rozwiązanie.</li>
	<li>Pokryj szalkę Petriego o średnicy 90 mm 3% agarozą, wlewając stopioną agarozę do momentu, aż jedna trzecia głębokości szalki Petriego zostanie pokryta i pozwól jej zastygnąć. Na tej szalce Petriego zostaną przeprowadzone sekcje. UWAGA: Szalki Petriego z powłoką agarozową można przygotować z tygodniowym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Powłoka agarozowa zapewnia bardziej miękkie podłoże, na którym można przeprowadzić sekcje bez uszkadzania kleszczy.</li>
	<li>Oczyść kleszcze, które mają być używane, 70% etanolem i wytrzyj je czystym kawałkiem standardowej bibułki laboratoryjnej.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś 3-4 barwione larwy wraz z 0,5 ml roztworu do przechowywania na pokrytą agarozą szalkę Petriego. UWAGA: Rozwiązanie do przechowywania zapewnia większą przejrzystość optyczną podczas wykonywania sekcji w porównaniu do wykonywania tego samego w E3.</li>
	<li>Ustaw poplamioną larwę na jej bocznej stronie (ryc. 1A) i ostrożnie zeskrob żółtko z ciała larwy za pomocą kleszczy UWAGA: Rycina 1B przedstawia zarodek, z którego usunięto żółtko. Dobrą praktyką jest przeniesienie zeskrobanego z żółtka zarodka na nową szalkę Petriego przed przystąpieniem do dalszych etapów sekcji, tak aby unosząca się wokół lepka masa żółtka nie przeszkadzała w rozbiorze.</li>
	<li>Po usunięciu żółtka chwyć larwę za ogon jednym kleszczem, a drugą użyj do ostrożnego usunięcia oczu. UWAGA: Rycina 1C przedstawia zarodek z usuniętym żółtkiem i oczami. Oczy należy usuwać z zachowaniem ostrożności, ponieważ ich bliskość do szkieletu twarzoczaszki może przeszkadzać w ich rozwarstwieniu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie pociągnij i uszczypnij mózg i inne tkanki grzbietowe do neurokraniumu. Przytrzymaj larwę nieruchomo jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary kleszczy, aby wykonać nacięcie pośrodku (ryc. 1C, czerwona strzałka), a następnie ściskać tkanki (ryc. 1D). UWAGA: Podczas wykonywania tego kroku należy zachować ostrożność przy usuwaniu tkanek bliżej najbardziej wysuniętych do przodu obszarów neuroczaszki, ponieważ chrząstka może odpaść wraz z nimi.</li>
	<li>Oddziel głowę larwy od reszty ciała. Obszar głowy po tym etapie zawiera przede wszystkim neurokranium i trzewiowoczaszkę połączone ze sobą w dwóch punktach - na przednim i tylnym końcu - wraz z kilkoma małymi niebarwionymi tkankami przyczepionymi do tych struktur twarzoczaszki (ryc. 1E). UWAGA: Trudno jest całkowicie usunąć niezabarwione tkanki bezpośrednio przyczepione do neurokranium i trzewiowoczaszki. Nawet jeśli niektóre szczątkowe tkanki będą obecne, ich obecność nie wpłynie na żadną dalszą analizę kształtu lub rozmiaru, ponieważ są one niebarwione.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć dwa połączenia między neuroczaszką a trzewiowoczaszką, aby je rozdzielić (ryc. 1F, czerwone przerywane linie). Na rycinie 2 przedstawiono obrazy neuroczaszki i trzewiowoczaszki, zarówno w nienaruszonych, jak i wypreparowanych zarodkach.</li>
	<li>Na czystym szkiełku podstawowym dodaj kroplę lub dwie 100% glicerolu. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś wypreparowaną neuroczaszkę lub trzewiowoczaszkę na ten szkiełko. Użyj kleszczyków, aby delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na tych tkankach, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na wszystkich szkiełkach lakierem do paznokci. UWAGA: Szkiełka te można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ponad rok bez utraty plamy.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja wymiarów płytki sitowej
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy podniebienia za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego (ryc. 2D). W przypadku braku kamery klasy naukowej podłącz standardowy smartfon do mikroskopu stereoskopowego, aby uzyskać obrazy.</li>
	<li>W celu określenia ilościowego załaduj obraz podniebienia do FIJI22, a następnie użyj narzędzia linii, aby zmierzyć szerokość i wysokość płytki sitowej w mikronach (patrz rysunek 3A-C) i określić wymiary za pomocą rozdzielczości pikseli kamery.</li>
	<li>Narysuj kontur wokół płytki sitowej i kliknij Analizuj | Ustawianie pomiarów | obszar, aby uzyskać obszar płytki sitowej (ryc. 3D,E).</li>
</ol>

<ol><li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+neural+crest+identity%3A+a+gene+regulatory+recipe%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe.</a> Development. 142 (2), 242-257 (2015).</li>
<li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development%3A+insights+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).</li>
<li>Hammond, N. L., Dixon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+embryogenesis+of+lip+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Revisiting the embryogenesis of lip and palate development.</a> Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).</li>
<li>Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMork%2C+L+%22Craniofacial+development%22">Craniofacial development</a>. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).</li>
<li>Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li>
<li>Selleri, L., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+faces%3A+genetic+and+epigenetic+control+of+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).</li>
<li>Beaty, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+geneenvironment+interaction+in+a+genome+wide+study+of+nonsyndromic+cleft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate.</a> Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).</li>
<li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
<li>Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+orofacial+clefts%3A+crosstalk%2C+pathogenesis+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models.</a> Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).</li>
<li>Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+craniofacial+malformations%3A+interactions+of+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).</li>
<li>Walker, M., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+twocolor+acidfree+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).</li>
<li>Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morpholinobased+screen+to+identify+novel+genes+involved+in+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis.</a> Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+unique+model+system+in+bone+research%3A+the+power+of+genetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Ichthyol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging.</a> J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).</li>
<li>Farmer, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+series+of+Irx+cluster+mutants+reveals+diverse+roles+in+facial+cartilage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development.</a> Development. 148 (16), dev197244(2021).</li>
<li>Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Wnt+pathway+genes+wls%2C+wnt9a%2C+wnt5b%2C+frzb+and+gpc4+in+regulating+convergentextension+during+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis.</a> Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).</li>
<li>Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemicalinduced+craniofacial+anomalies+caused+by+disruption+of+neural+crest+cell+development+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model.</a> Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).</li>
<li>Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+wholemount+bone+and+cartilage+staining+requires+acidfree+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions.</a> Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).</li>
<li>Stenzel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+redundant+roles+for+zebrafish+her+genes+during+mineralization+and+craniofacial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning.</a> Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).</li>
<li>Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+system+for+environmental+health+studies+in+the+grad+classroom%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom.</a> Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).</li>
<li>Cubbage, C. C., Mabee, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+cranium+and+paired+fins+in+the+zebrafish+Danio+rerio+%28Ostariophysi%2C+Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae).</a> J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).</li>
<li>Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+opensource+platform+for+biologicalimage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tuckett, F., MorrissKay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcian+Blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material%3A+effect+of+different+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).</li>
<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140 (1), 76-81 (2013).</li>
<li>Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+AF+%22Craniofacial+development%22">Craniofacial development</a>. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+alizarin+Red+staining+to+detect+chemically+induced+bone+loss+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (178), e63251(2021).</li>
<li>Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+analysis+of+symmetric+structures%3A+quantifying+variation+among+individuals+and+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry.</a> Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Wady rozwojowe twarzoczaszki stanowią większość wszystkich wad wrodzonych u ludzi, często prowadząc do śmiertelności niemowląt. Jednak etiologia leżąca u podstaw większości anomalii twarzoczaszki pozostaje do wyjaśnienia25. Struktury twarzoczaszki są złożone u każdego kręgowca, a z perspektywy studiów licencjackich pierwszym wymogiem jest zatem posiadanie narzędzia edukacyjnego, które zapewnia studentom ogólny przegląd odrębnych struktur w okolicy twarzoczaszki. Jednak dostęp do zarodka ssaków w t...

Chrząstka twarzoczaszki u kręgowców wyłania się z multipotencjalnej populacji komórek zwanej komórkami grzebienia nerwowego czaszki1. Komórki te są najpierw określane na grzbietowych brzegach płytki nerwowej we wczesnych zarodkach, które następnie migrują na duże odległości, aby dotrzeć do obszaru twarzoczaszki i łuków gardłowych przed różnicowaniem 2,3. Mechanizmy sygnalizacyjne, które napędzają tę migrację i różnicowanie, są w dużej mierze zachowane wśród kręgowców 4,5. Mimo to organizacja, rozmiar i kształt poszczególnych elementów chrząstki są różne u różnych gatunków, co prowadzi do różnych morfologii twarzoczaszki6. W szczególności danio pręgowany stał się potężnym systemem modelowym do badania morfogenezy twarzoczaszki, biorąc pod uwagę przezroczystą naturę zarodków aż do stadium larwalnego. Stosując proste procedury barwienia do oznaczania chrząstki, scharakteryzowano morfologię wielu struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego w różnych perturbacjach szlaków sygnałowych 7,8,9, a także gdy zarodki lub larwy są narażone na powszechne zanieczyszczenia obecne w środowisku10. Opisane tutaj barwienie błękitem alcyjskim do oznaczania chrząstki polega na użyciu warunków niekwaśnych standaryzowanych przez Walkera i Kimmela11, które zostały następnie wykorzystane przez wiele laboratoriów danio pręgowanego pracujących nad rozwojem twarzoczaszki 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , w tym opis użytkowania w środowisku licealnym20. Barwienie bezkwasowe zachowuje struktury kostne w stanie nienaruszonym, co pozwala na barwienie chrząstki i kości razem za pomocą odpowiednio błękitu Alcian i czerwieni alizarynowej. Brakuje jednak szczegółowego protokołu barwienia, a także przeprowadzania precyzyjnego preparowania chrząstek twarzoczaszki, zwłaszcza w celu pomocy w podejmowaniu takich badań w warunkach ograniczonych zasobów.
Mimo że struktura szkieletu twarzy u dorosłego danio pręgowanego jest dość złożona, składa się z 43 kości pochodzących z chrząstki21, chrząstka twarzoczaszki u larwy w 5 dni po zapłodnieniu (dpf), która właśnie nabyła zdolność żerowania, jest stosunkowo prosta i można ją szeroko podzielić na neurokranium grzbietowe i brzuszne trzewnoczaszkowe4. Struktury te wspierają mózg, przyczyniają się do pracy aparatu żywieniowego i dają początek chrząstkom podtrzymującym tkanki skrzelowe. Opisany tutaj protokół pozwoli na barwienie chrząstek danio pręgowanego błękitem Alciana, a następnie szczegółową procedurę preparowania neuro i trzewiowoczaszki na odrębne struktury, co ostatecznie umożliwi dokładną charakterystykę kształtu i wielkości różnych chrząstek w tych strukturach. Na przykład mierzymy wymiary przedniego odcinka podniebienia (podniebienie) zwanego płytką sitową, która jest częścią neuroczaszki.

<table><tbody><tr><td>Agarozy</td><td>Nauki biologiczne Lonza</td><td>50004</td><td>Do powlekania szalek Petriego</td></tr><tr><td>Niebieski alcki 8G&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Samolot A3157</td><td>Do barwienia chrząstek</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Olympus</td><td>Zobacz materiał DP28</td><td>Do pozyskiwania obrazów</td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Roche Nauki Przyrodnicze</td><td>10236276001</td><td>Do znakowania jąder</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Honeywell</td><td>32221</td><td>Rozpuszczalnik do barwienia błękitu alcyjskiego</td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td></td><td></td><td>Wersja: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>Dumont</td><td>Do wykonywania sekcji</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MP biomedycyna</td><td>193996</td><td>Do wykonywania mycia i montażu próbek&nbsp;</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>MP biomedycyna</td><td>194057</td><td>Do sporządzania roztworu wybielacza</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>SARD Nauki biologiczne</td><td>SBRC0217</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał M2773</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>MS-222 (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ciągnik hamulcowy A5040</td><td>Do znieczulania larw</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P9541 powiedział:</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P0662</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014 powiedział:</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>Do wykonywania</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Olympus</td><td>SZX61</td><td>Do wykonywania sekcji</td></tr><tr><td>Tween-20 (Kanał Telewizyjny)</td><td>HIMEDIA</td><td>Zobacz materiał TC287</td><td>Detergent stosowany do komórek przepuszczalnych</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Dissection of Zebrafish Craniofacial Tissues Upon Staining with Alcian Blue

Danio pręgowany, ze względu na swoją przezroczystość optyczną, jest doskonałym modelem kręgowców do badania mechanizmów, za pomocą których chrząstki twarzoczaszki tworzą się w zarodku. Chrząstki twarzoczaszki można ogólnie podzielić na dwie grupy, neuroczaszkę i trzewiowoczaszkę, które z kolei można podzielić na liczne grupy chrząstek niezbędnych do podtrzymania mózgu i stanowiących między innymi aparat żywieniowy i oddechowy. Protokół ten najpierw opisuje prostą i ustaloną procedurę barwienia u danio pręgowanego w celu wizualizacji tych grup chrząstek, a następnie metodologię preparowania i oddzielania neuro i trzewności. Z tych sekcji można łatwo uzyskać proste wskaźniki kształtu i wielkości, a w tym protokole wykazano to dla podniebienia, które jest częścią przedniej neurokraniu, tkanki często dotkniętej większością zaburzeń twarzoczaszki u ludzi. Protokół można powielić w prosty sposób nawet w warunkach ograniczonych zasobów, zapewniając w ten sposób cenne narzędzie edukacyjne dla studentów studiów licencjackich, aby zapoznać się z morfologią twarzoczaszki.

Szkielet twarzoczaszki danio pręgowanego jest w pełni chrzęstny po 5 dniach od zapłodnienia (dpf), a zatem może być barwiony przy użyciu błękitu alcyjskiego, który jest podstawowym barwnikiem zdolnym do wiązania się z glikozaminoglikanami obecnymi obficie w chrząstkach23. Powoduje to, że chrząstka jest zabarwiona na niebiesko (ryc. 1), dzięki czemu można ją odróżnić od innych tkanek obecnych w larwie za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego dostępnego w więk...

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Zebrafish, given its optical transparency, is an excellent vertebrate model to study the mechanisms by which craniofacial cartilages form in the embryo. ...

Badamy mechanizmy, dzięki którym podniebienie danio pręgowanego rośnie w czasie, używając ustalonych próbek, a także obrazowania poklatkowego zarodków z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową za pomocą mikroskopii arkuszowej. Nasz protokół jest prosty i łatwy do przestrzegania. Określa szczegółowe kroki do wypreparowania i oddzielenia chrząstek twarzoczaszki pięciodniowej larwy danio pręgowanego.Protokół ten umożliwił dokładną charakterystykę kształtu podniebienia w skali tkankowej i komórkowej, co ostatecznie pozwoliło nam ocenić wpływ antygenów komentujących na morfogenezę podniebienia. Na początek zdobądź od 20 do 25 znieczulonych larw danio pręgowanego i usuń środek znieczulający, gdy larwy przestaną się poruszać. Dodaj 1,5 mililitra 4% aldehydu paraform do probówki i umieść próbkę na kołysce ustawionej na 60 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej na dwie godziny.Za pomocą pipety usuń jak najwięcej utrwalacza z probówki. Następnie dodaj 1,5 mililitra 50% etanolu do próbki i umieść ją na kołysce w temperaturze pokojowej ustawionej na 60 obrotów na minutę na 10 minut. Teraz za pomocą pipety odessać etanol z probówki i dodać 1,5 mililitra roztworu niebieskiego barwnika alcian do próbki.Inkubuj larwy w roztworze barwie przez 18 do 20 godzin w temperaturze pokojowej, kołysząc się z prędkością 60 obrotów na minutę. Następnie usuń roztwór plamy za pomocą pipety i umyj larwy 1,5 mililitra wody destylowanej przez jedną do dwóch minut na bujaczku w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu wybielacza do próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut bez przykrywania probówek.Za pomocą pipety usuń roztwór wybielacza z próbki i potraktuj próbkę roztworami do usuwania tkanek jeden i dwa. Po usunięciu roztworu drugiego dodaj do próbki od 1,5 do dwóch mililitrów roztworu do przechowywania. Ze względu na zawartość glicerolu obserwuj, jak zabarwione próbki stopniowo opadają na dno w ciągu 10 minut.Umieść poplamioną larwę na bocznej stronie na szalce Petriego pokrytej agarozą. Za pomocą kleszczy delikatnie zeskrob żółtko z ciała larw. Po usunięciu żółtka przenieś larwy na świeżą szalkę Petriego, aby uniknąć zakłóceń podczas sekcji, trzymaj larwy w pobliżu tylnej części głowy za pomocą jednej pary kleszczy.W przypadku drugiej pary ostrożnie usuń oczy, nie uszkadzając otaczających struktur czaszki twarzy. Trzymając larwę, wciąż jedną parą kleszczy, wykonaj nacięcie w środku tkanki grzbietowej do neuroczaszki. Następnie uszczypnij i oderwij mózg i związane z nim tkanki.Następnie oddziel głowę larwy od reszty ciała. Powstały obszar głowy powinien obejmować nerw czaszkowy i czaszkę trzewną nadal przyczepioną na przednim i tylnym końcu. Ostrożnie odetnij dwa punkty łączące między czaszką nerwową a czaszką trzewną za pomocą kleszczy, aby całkowicie je rozdzielić.Na koniec umieść jedną lub dwie krople 100% glicerolu na czystym szkiełku podstawowym i przenieś wypreparowaną czaszkę nerwową lub czaszkę trzewną na szkiełko. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczkach, upewniając się, że nie utknęły pęcherzyki powietrza, i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Wypreparowana czaszka nerwowa wykazywała wiele wyraźnie oznaczonych struktur, w tym płytkę sitową, beleczkę i chrząstkę osierdziową, co umożliwiło szczegółową analizę strukturalną.Czaszka trzewna obejmowała chrząstkę Meckla oraz dodatkowe elementy, takie jak czworokąt podniebienia i chrząstki bazylikowe. Barwienie błękitem alcyjskim po pięciu dniach od zapłodnienia umożliwiło wyraźną wizualizację płytki sitowej. Szerokość i długość płytki sitowej były konsekwentnie mierzalne za pomocą analizy obrazu, a długość była znacznie większa niż szerokość i określono ilościowo dane z 15 próbek.Obszar płytki sitowej wyodrębniono z danych obrazowych i potwierdzono poprzez kwantyfikację z wyraźnymi oznaczeniami granicznymi. Na płytce sitowej zaobserwowano wyraźne układy komórkowe z komórkami prostopadłościennymi w okolicy przyśrodkowej i komórkami kolumerowymi w częściach bocznych. Barwienie metodą Dappy pozwoliło na wizualizację pojedynczych jąder komórkowych w obrębie płytki sitowej.

dissection-zebrafish-craniofacial-tissues-upon-staining-with-alcian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj użyliśmy czerwonego barwienia alizaryną, aby pokazać, że ekspozycja na octan ołowiu powoduje zmianę masy kostnej u larw danio pręgowanego. Ta metoda barwienia może być dostosowana do badania utraty kości u larw danio pręgowanego wywołanej przez inne niebezpieczne substancje toksyczne.

Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metodę rozwarstwiania chrząstek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim. Protokół umożliwia szczegółową analizę morfogenezy podniebienia na poziomie tkankowym i komórkowym.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Przeglądaj więcej filmów