Name: Wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi P53 V157F przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T14:57:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Odkryj metodę wielopunktowej fluorescencji tioflawiny T do wykrywania agregacji białek w komórkach raka piersi z mutacją p53 V157F. Technika ta poprawia dokładność pomiaru struktur amyloidopodobnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy z wdzięcznością dziękują za pomoc techniczną udzieloną przez Podstawowe Laboratorium Medyczne na Wydziale Medycyny Uniwersytetu I-Shou. Prace te były wspierane grantami od E-DA Hospital [EDAHJ114001 dla C.-C.C.] oraz National Science and Technology Council na Tajwanie [NSTC 112-2813-C-214-032-B dla B.-H. C]

1. Siewnictwo komórkowe
<ol>
	<li>Aby ocenić żywotność komórek, wymieszaj 10 μL Trypan Blue z 10 μL komórek zawieszonych ponownie w 1x soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS) w rurce mikrowirówki i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Załaduj 10 μL mieszanki na suwak do licznika, a następnie policz aktywne ogniwa za pomocą automatycznego licznika ogniw.</li>
	<li>Na podstawie liczby żywotności należy zasiać 30 000 żywotnych komórek na odwiert na płytę hodowlową z 96 dołkami, z jedną studnią oznaczoną jako kontrolną bez barwienia, a pozostałe trzy do barwienia.</li>
</ol>
2. Inkubacja
<ol>
	<li>Umieść płytkę hodowlę w inkubatorzeCO2 i inkubuj przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie świeżego materiału do bejcowania ThT (1 000x)
<ol>
	<li>Waż 0,02 g (20 mg) proszku ThT i rozpuszczaj go w 5,0 mL wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj, aż proszek całkowicie się rozpuści. UWAGA: Preparat ten daje roztwór bulwarowy 1 000x ThT o końcowym stężeniu 4 mg/mL, co odpowiada 12,5 mM (ThT ma masę cząsteczkową ~318,85 g/mol). Roztwór o stężeniu 4 mg/mL daje 4 g/L. Podzielenie 4 g/L przez 318,85 g/mol daje 0,0125 mol/L, czyli ~12,5 mM).</li>
</ol>
4. Przygotowanie buforu barwiącego ThT z jądrowym kontrastem
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący, dodając do 1 mL 1x DPBS i delikatnie wymieszaj, aby zapewnić jednorodność.<ol>
		<li>Dodaj 1 μL świeżo przygotowanego zapasu 1000x ThT, co daje końcowe stężenie ThT 12,5 μM (1x).</li>
		<li>Dodaj 1 μL roztworu zapasowego Hoechst 33342 o stężeniu 1 mg/mL, co daje końcowe stężenie ~1 μg/mL (=1,6 μM).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie
<ol>
	<li>Usuń podłoże hodowlane z każdego dołku. Do każdego dołka do barwienia dodaj 100 μL przygotowanego bufora barwiącego ThT/Hoechst. Dodaj 100 μL 1x DPBS do kontroli bez barwników.</li>
</ol>
6. Inkubacja
<ol>
	<li>Umieść talerz w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (25 °C) na 30 minut.</li>
</ol>
7. Pranie
<ol>
	<li>Ostrożnie zasysaj lub wyrzucaj roztwór barwiący z każdego dołku, uważając, aby nie zakłócić monowarstwy komórki.</li>
	<li>Dodaj 100 μL 1× DPBS do każdego otworu i pozwól na opcjonalne delikatne 30-sekundowe moczenie.</li>
	<li>Ostrożnie zasysaj lub wyrzuć roztwór DPBS.</li>
	<li>Powtórz mycie, dodając 100 μL świeżego 1x DPBS do każdego dołku, ponownie pozwalając na opcjonalne 30-sekundowe delikatne namoczanie, a następnie wyrzuć roztwór DPBS.</li>
	<li>Po drugim przepłukaniu dodaj 100 μL świeżego 1x DPBS do każdego otworu.</li>
</ol>
8. Pomiar fluorescencji
<ol>
	<li>Przed odczytem sygnału fluorescencyjnego usuń pokrywkę z płyty 96-dołkowej. Mierz fluorescencję jedną z dwóch metod: odczyt jednopunktowy lub czteropunktowy.</li>
	<li>Umieść płytkę z 96 dołkami w czytniku mikropłytek i mierz fluorescencję przy następujących ustawieniach: ThT fluorescencji: Wzbudzenie przy 450 nm, emisja przy 490 nm; Hoechst 33342 fluorescencja: Wzbudzenie przy 360 nm, emisja przy 460 nm; ustawienia czytelnika: Drżenie: 5 sekund przed czytaniem; Kierunek czytania: Najlepszy lektura; Czas integracji: 140 ms; Wysokość odczytu: 1,00 mm; Punkty na well: 1 (koniec końcowy) lub 4 (skan studni); Ustawienie wstudu: (Gęstość: 2; Odstęp punktów: 2,5).</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz agregację białek w następujący sposób: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68921/68921eq1.jpg" style="margin: auto;" /></li>
	<li>Normalizuj intensywność fluorescencji ThT, ustawiając stosunek w komórkach MCF7 na 1 (kontrola bazowa).</li>
</ol>

<ol><li>Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awakening+the+%26%2334%3Bguardian+of+genome%26%2334%3B%3A+Reactivation+of+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Awakening the &#34;guardian of genome&#34;: Reactivation of mutant p53.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+affordable+method+to+create+nonsense+mutation+clones+of+p53+for+studying+the+premature+termination+codon+readthrough+activity+of+ptc124%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124.</a> Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).</li>
<li>Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aggregation+of+mutant+p53+produces+prion-like+properties+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer.</a> Prion. 8 (1), 75-84 (2014).</li>
<li>Kim, S., An, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+p53+isoforms+and+aggregations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Role of p53 isoforms and aggregations in cancer.</a> Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+promotes+cell+growth+and+cancer+cell+metabolism+via+inhibition+of+ampk+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation.</a> Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+in+cancer+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy.</a> J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).</li>
<li>De Oliveira, G. aP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+p53+oligomeric+and+aggregation+states+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer.</a> Biomolecules. 10 (4), 548(2020).</li>
<li>Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+p53+pathways%3A+Mechanisms%2C+structures%2C+and+advances+in+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).</li>
<li>Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+thioflavin+t+with+amyloid+fibrils%3A+Stoichiometry+and+affinity+of+dye+binding%2C+absorption+spectra+of+bound+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye.</a> J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nampt+inhibitor+and+p73+activator+represses+p53+r175h+mutated+HNSCC+cell+proliferation+in+a+synergistic+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner.</a> Biomolecules. 12 (3), 438(2022).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyllides+repress+gain-of-function+p53+mutated+hnscc+cell+proliferation+via+activation+of+p73+and+repression+of+p53+aggregation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).</li>
<li>Wu, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+activity+of+hsp70+inhibitor+and+doxorubicin+in+gain-of-function+mutated+p53+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells.</a> Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).</li>
<li>Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+filter-trap+assay+for+amyloid+fibril+formation+kinetics+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).</li>
<li>Goldsbury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure+and+assembly%3A+Insights+from+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).</li>
<li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibril+specific%2C+conformation+dependent+antibodies+recognize+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils+and+fibrillar+oligomers+that+is+absent+in+prefibrillar+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers.</a> Mol Neurodegener. 2, 18(2007).</li>
<li>Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioflavin+t+as+an+amyloid+dye%3A+Fibril+quantification%2C+optimal+concentration+and+effect+on+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+thioflavin-t+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils.</a> Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).</li>
<li>Yang-Hartwich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+protein+aggregation+promotes+platinum+resistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer.</a> Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).</li>
<li>Lei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+allosteric+mechanisms+of+the+lung-enriched+p53+mutants+v157f+and+r158l%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l.</a> Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edge+effect%3A+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).</li>
<li>Yoshimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+crystal-like+amyloid+fibrils+and+glass-like+amorphous+aggregates+from+their+kinetics+of+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).</li>
<li>Yang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+protein-rich+clusters+host+the+nucleation+of+mutant+p53+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).</li>
<li>Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acidic+and+basic+ph+on+thioflavin+t+absorbance+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence.</a> Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).</li>
<li>Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p53+core+domain+is+a+molten+globule+at+low+ph%3A+Functional+implications+of+a+partially+unfolded+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure.</a> J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).</li>
<li>Ano Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+aggregates+into+prion-like+amyloid+oligomers+and+fibrils%3A+Implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer.</a> J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).</li>
<li>Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+is+essential+for+restoring+cellular+functions+of+temperature-sensitive+p53+mutant+protein+but+not+for+stabilization+and+activation+of+wild-type+p53%3A+Implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy.</a> J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).</li>
<li>Arsic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%94133p53%CE%B2+isoform+pro-invasive+activity+is+regulated+through+an+aggregation-dependent+mechanism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).</li>
<li>Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta133p53alpha+and+delta160p53alpha+isoforms+of+the+tumor+suppressor+protein+p53+exert+dominant-negative+effect+primarily+by+co-aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation.</a> Elife. 14, RP106469(2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podczas zasiewania komórek na płytkach z 96 dołkami często trudno jest osiągnąć równomierny rozkład na powierzchni dołka, ponieważ delikatne potrząsanie lub stuknięcie w płytkę, aby rozprowadzić komórki, nie zawsze jest możliwe. Ten nierówny rozkład może wprowadzać zmienność intensywności sygnału w całej studni. Wielopunktowe odczyty fluorescencji wykazały istotne różnice między różnymi obszarami w tej samej studni, podkreślając tę stronniczość i potencjalne wprowadzenie mylących wyników przy pomiarze tylko jednego punkt...

Gen TP53, który koduje białko supresorowe nowotworowe p53, jest zmutowany w około 50% nowotworów ludzkich 1,2. Takie mutacje nie tylko niwelują funkcje supresyjne nowotworowe p53, ale w niektórych wariantach hotspotów sprzyjają także powstawaniu agregatów podobnych do prionów 3,4. Te zagregowane formy mutanta p53 często zyskują właściwości wzmacniające funkcje, w tym zwiększoną odporność na terapie przeciwnowotworowe 5,6. Dlatego identyfikacja, które mutacje hotspotów p53 są podatne na agregację, jest kluczowe dla opracowania skutecznych strategii leczenia nowotworów z mutacją p53 7,8.
W naszych wcześniejszych badaniach zaobserwowaliśmy, że konkretne mutacje p53 w liniach raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) oraz raka piersi wykazują silne sygnały barwienia Thioflawina T (ThT), wskazujące na obecność zagregowanych białek. ThT to barwnik benzotiaazolowy, który specyficznie wiąże się z β warstwami amyloidu, powodując zwiększoną fluorescencję po wiązaniu9. Na przykład linia komórkowa Detroit 562 HNSCC, która przenosi mutację p53 R175H, wykazywała silne sygnały fluorescencji ThT10. Podobnie dwie inne linie komórkowe HNSCC, TW01 i HONE-1, obie zawierające mutację p53 R280T, również wykazały wyraźne barwienie ThT11. W tych przypadkach sygnały ThT współlokalizowały się z p53, co potwierdza obecność zagregowanego p5310,11.
W komórkach raka piersi MDA-MB-231 (mutacja p53 R280K) i T47D (mutacja p53 L194F) również wykazywały silne barwienie ThT z wyraźną współlokalizacją p53/ThT12. Dla porównania, komórki MCF7, które wykazują dziki typ p53, oraz komórki MDA-MB-468 (mutacja p53 R273H) wykazywały jedynie słabe sygnały ThT12. Podobnie komórki OECM-1 HNSCC z mutacją p53 V173L wykazały niskie poziomy barwienia ThT10.
W porównaniu z innymi metodami wykrywania agregacji białek – takimi jak testy pułapek filtracyjnych, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) czy immunodbarwienie za pomocą przeciwciał specyficznych dla agregatu – analiza fluorescencji ThT oferuje kilka zalet. Jest nieniszcząca, szybka i stosowalna zarówno do komórek żywych, jak i stałych, bez rozległego przetwarzania. Chociaż testy pułapek filtracyjnych skutecznie wychwytują nierozpuszczalne kruszywa, wymagają one surowej denaturacji i nie nadają się do stosowania w żywych komórkach13. TEM umożliwia bezpośrednią wizualizację morfologii włókien, ale jest pracochłonny i o niskiej przepustowości14. Immunobarwienie specyficzne dla agregatów umożliwia wykrywanie in situ przy użyciu przeciwciał zależnych od konformacji, choć dostępność i swoistość przeciwciał mogą ograniczać15. Dla porównania, fluorescencja ThT – zwłaszcza w połączeniu z wielopunktowym odczytem na płytkach – oferuje proste, ilościowe i przestrzennie wiarygodne podejście do wykrywania struktur bogatych w β arkuszy lub podobnych do amyloidu.
Praktyczne względy są również kluczowe dla powtarzalności. Fluorescencja ThT koreluje liniowo ze stężeniem amyloidu w szerokim zakresie stężeń (0,2-500 μM), a sygnał szczytowy zwykle osiąga się przy 20-50 μM, w zależności od białka – choć samofluorescencja ThT może pojawić się przy ≥5 μM, a wyższe stężenia mogą wpływać na kinetykę agregacji16. Dlatego zaleca się zazwyczaj działające stężenie ThT na poziomie około 10-20 μM, aby zrównoważyć czułość przy jednoczesnym minimalizowaniu potencjalnych efektów na procesy agregacji16. W naszym protokole zapas 1 000x ThT (12 mM) jest rozcieńczany w stosunku 1:1 000, aby uzyskać stężenie robocze około 12. μM, które mieści się w tym zalecanym zakresie.
ThT preferencyjnie wiąże się z amyloidowymi strukturami bogatymi w β arkusze, które są charakterystyczne dla włókien amyloidowych. Ta specyficzność wynika z interakcji barwnika z architekturą krzyżową β włókien amyloidowych, gdzie powierzchnie utworzone przez β-nici stanowią miejsca wiązania dla ThT. W konsekwencji ThT może nie wykrywać skutecznie innych nieprawidłowo złożonych lub nieamyloidowych agregatów, które nie wykazują tej struktury bogatej w β arkusze17. Dlatego choć ThT jest cennym narzędziem do identyfikacji włókien amyloidowych, zaleca się stosowanie komplementarnych metod walidacji – takich jak współlokalizacja z immunofluorescencją p53 lub podejścia biofizyczne – aby zweryfikować tożsamość i swoistość wykrytych agregatów10,18.
Badania predykcyjne struktury sugerują, że mutacja p53 V157F przyjmuje konformację bardziej podatną na agregację niż białko typu dzikiego19. W tym badaniu porównaliśmy sygnały fluorescencji ThT między komórkami raka piersi Hs578T, które zawierają mutację V157F podatną na agregację, a komórkami raka piersi MCF7 wyrażającymi dziki typ p53. Za pomocą wielopunktowego testu barwienia ThT opartego na czytniku płytowym staraliśmy się ocenić skłonność do agregacji p53 V157F w porównaniu do dzikiego typu p53.

<table><tbody><tr><td>Płyta hodowla z 96 dołkami</td><td>Po prostu</td><td>PC396-0100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwny przesuw</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny Licznik Komórek Komórkowych Hrabiny II FL</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Po prostu</td><td>CC704-0500</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Eppendorfa</td><td>Po prostu</td><td>PC101-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AAT Bioquest</td><td>17530</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>735-0391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi p53 v157f przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny t

Detection of Aggregation-Prone Behavior in Mutant P53 V157F Breast Cancer Cells Using Multipoint Thioflavin T Fluorescence

Supresor nowotworowy p53, zakodowany przez gen TP53 , odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilności genomowej. Mutacje TP53 , szczególnie warianty hotspot, występują w około 50% nowotworów ludzkich i mogą prowadzić do utraty funkcji supresyjnych nowotworów lub nabycia właściwości zyskujących funkcje, w tym agregacji w struktury przypominające priony.
W tym badaniu oceniliśmy tendencję agregacji mutacji p53 V157F w komórkach raka piersi Hs578T w porównaniu z komórkami MCF7 wyrażającymi dziki typ p53. Agregację białek oceniono za pomocą barwienia Thioflavin T (ThT), a następnie fluorescencji ilościowej w 96-dołkowych testach płytkowych. Komórki były barwione roztworem ThT/Hoechst, myte i analizowane za pomocą czytnika mikropłyt przy określonych parametrach wzbudzenia i emisji. Analiza ilościowa z wykorzystaniem pomiarów fluorescencji pojedynczych i czteropunktowych wykazała, że komórki Hs578T wykazywały wzrost intensywności fluorescencji ThT o 3,20 do 4,26 razy w porównaniu do MCF7, co wskazuje na istotnie podwyższone poziomy agregatów bogatych w β arkuszy lub podobnych do amyloidu. Pomiary wielopunktowe potwierdziły powszechną i stałą obecność agregatów białkowych na powierzchni dołku. Wyniki te wspierają zastosowanie wielopunktowego odczytu płytek do dokładnego wykrywania agregacji białek w testach komórkowych.

Aby zbadać obecność agregatów białkowych bogatych w β arkusze w komórkach raka piersi, linie komórkowe MCF7 i Hs578T zostały poddane barwieniu ThT, a następnie kwantyfikacji fluorescencji. Jak pokazano na Rysunku 1, komórki zostały zasiane do czterech dołków płyty z 96 dołkami, z jednym odsłonem oznaczonym jako kontrolny bez barwienia. Pozostałe trzy studnie zostały zabarwione ThT zgodnie ze standardowym protokołem. Fluorescencję mierzono dwoma podejściami: (1) odczytem pojedynczego punktu p...

Komórki raka piersi Hs578T zawierające mutację p53 V157F wykazują istotnie wyższą fluorescencję tioflawiny T w porównaniu z komórkami MCF7, co wskazuje na zwiększoną agregację białek. Pomiary fluorescencji wielopunktowej poprawiają dokładność i niezawodność wykrywania agregatów bogatych w β arkusze, podkreślając znaczenie mutacji p53 podatnych na agregację w badaniach nad rakiem oraz opracowywaniu strategii terapeutycznych.

Wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi P53 V157F przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny T

The tumor suppressor p53, encoded by the TP53 gene, plays a central role in maintaining genomic stability. TP53 mutations, particularly hotspot variants, ...

Badanie to analizuje skłonność do agregacji mutanta p53 V157F w komórkach raka piersi oraz ocenia wielopunktowe odczyty płytek pod kątem wykrywania. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują dokładne wykrywanie agregacji p53, ilościowe określenie struktur amyloidowych oraz zapewnienie spójnego pomiaru na powierzchniach testów komórkowych. Na początek weź 10 mikrolitrów trypan blue w rurce mikrowirówki.Dodaj 10 mikrolitrów komórek zawieszonych w DPBS do tej samej rurki i dokładnie wymieszaj zawartość, aby zapewnić jednorodność. Załaduj 10 mikrolitrów przygotowanej mieszanki na podkładkę, aby policzyć żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Na podstawie liczby żywotności należy nasiono 30 000 żywotnych komórek na odwiert do płyty hodowli 96 dołków.Oznacz jedną studnię jako kontrolną bez barwienia i wyznacz pozostałe trzy dołki do barwienia. Waż 0,02 grama proszku Tioflawiny T lub THT na wagi. Dodaj proszek do pięciu mililitrów wody zdejonizowanej i dokładnie wymieszaj, aż proszek całkowicie się rozpuści.Następnie dodaj składniki barwiące do jednego mililitra DPBS. Dodaj do rurki roztwory THT i Hoechst i delikatnie mieszaj, aby zapewnić jednolitość. Teraz usuń podłoże hodowlane z każdego dołku płyty hodowli 96 dołków.Do każdego odwiertu barwiącego dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego bufora THT i buforu barwiącego Hoechst, a następnie 100 mikrolitrów DPBS do niebarwionego dołka kontrolnego. Umieść płytkę hodowlę w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Ostrożnie aspiruj lub odrzucaj roztwór barwiący z każdej dołki, nie naruszając jednowarstwy komórkowej.Następnie dodaj 100 mikrolitrów DPBS do każdego otworu i zostawij na 30 sekund. Następnie wyrzuć DPB. Po powtórzeniu procesu mycia dodaj 100 mikrolitrów świeżego DPBS do każdego otworu.Usuń pokrywkę z płyty hodowli 96 dołków przed odczytem sygnału fluorescencyjnego. Włóż płytę hodowli z 96 dołkami do czytnika mikropłyt. Zmierz fluorescencję THT z wzbudzeniem na 450 nanometrów i misję na 490 nanometrów oraz zmierz fluorescencję Hoechst 33342 z wzbudzeniem na 360 nanometrów i misję na 460 nanometrów.Wybierz pożądany obszar odczytu, a następnie ustaw parametry czytnika, w tym potrząsanie przez pięć sekund przed odczytem – przekierowanie góry oraz czas integracji 140 milisekund. Po uzyskaniu danych fluorescencyjnych wykonaj obliczenia w celu uzyskania wartości agregacji białek. Na koniec normalizacja intensywności fluorescencji THT poprzez ustawienie stosunku w komórkach MCF7 jako jednego, aby służyć jako bazowa kontrola. Pomiary wykonywano zarówno metodą pojedynczej, jak i czteropunktowej na dołkach barwionych i niebarwionych w komórkach MCF7 i Hs578T.Komórki raka piersi Hs578T wykazały 3,2-krotny wzrost intensywności fluorescencji tioflawiny T w porównaniu z komórkami MCF7 stosowanymi metodą jednopunktowego odczytu. Przy użyciu metody średniej odczytu czteropunktowej komórki Hs578T wykazały 3,86-krotny wzrost fluorescencji tioflawiny T w porównaniu do komórek MCF7. Fluorescencja tioflawiny T w komórkach Hs578T była konsekwentnie podwyższona we wszystkich czterech punktach pomiarowych w porównaniu do komórek MCF7.Protokół ten umożliwia dokładne wykrywanie agregacji białek w kontekstach komórkowych za pomocą barwienia tioflawiną T, w połączeniu z niezawodnymi metodami wielopunktowego odczytu płytek fluorescencyjnych.

detection-aggregation-prone-behavior-mutant-p53-v157f-breast-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół poprawy skuteczności wykrywania hybrydyzacji fluorescencji międzyfazowej in situ na rozmazach szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem mnogim.

Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

Odkryj metodę wielopunktowej fluorescencji tioflawiny T do wykrywania agregacji białek w komórkach raka piersi z mutacją p53 V157F. Technika ta poprawia dokładność pomiaru struktur amyloidopodobnych.

Wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi P53 V157F przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny T (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi P53 V157F przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny T

Przeglądaj więcej filmów