Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów
30 grudnia 2025
Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.
Pracujemy nad genetyką symbiozy bakterii nicieni, która ma zastosowania rolnicze. Narzędzia genetyczne w bakteriach Xenorhabdus są bardzo dobrze rozwinięte, ale genetyka EPN pozostaje ograniczona, głównie opierając się na badaniach RNAi i EMS. Na początek zdobądź płytki agarowe nicieni nasiane Xenorhabdus griffiniae i Comamonas aquaticus.
Na przygotowanych płytkach NGM zawierających Xenorhabdus griffiniae należy zebrać nicienie Steinernema hermaphroditum. Inkubuj je w temperaturze 25 do 28 stopni Celsjusza, aby rosły jak optymalnie. Noc przed mikroiniekcją pobierz hermafrodyty stadia J3 na świeże płytki agarowe NGM z Xenorhabdus griffiniae.
W dniu mikroiniekcji wybieraj młode dorosłe hermafrodyty do wstrzyknięcia. Wyodrębnić sekwencję docelowego genu z referencyjnego genomu Steinernema hermaphroditum za pomocą BlastP. Wybierz wczesny kodujący egzon, najlepiej pierwszy egzon, i wprowadź sekwencję do CRISPRscan, używając domyślnych ustawień, aby wygenerować kandydatów RNA CRISPR.
Zrzuć najlepsze kandydatskie RNA CRISPR na genom Steinernema hermafroditum, aby upewnić się, że nie ma niecelnych dopasowań. Przechowuj wybrane RNA CRISPR oraz uniwersalne transaktywujące RNA CRISPR o długości 100 mikromolów każde w buforze dupleksowym przy minus 80 stopniach Celsjusza. Roztop 2% agarozy w wodzie w mikrofalówce.
Przelej 50 mikrolitrów stopionej agarozy na szklankę pokrywową. Natychmiast przykryj ją drugim szkłem. Po 20 minutach schnięcia zdejmij górną szklankę, a następnie oznacz przednią stronę agarozowego podkładu.
Przechowuj agarozowe podkładki w temperaturze pokojowej do długotrwałego użytkowania przez miesiące lub lata. Aby przygotować igły do wstrzyknięcia, wyciągnij włosy kwarcowe za pomocą wyciągacza filamentu laserowego i przechowuj igły w pudełku do przechowywania pipet. Przygotuj świeże duplexy RNA prowadzące, mieszając wybrane crRNA oraz uniwersalne transaktywujące RNA CRISPR w proporcji jeden do jednego.
Inkubuj rurkę w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie schódź do temperatury pokojowej do wyżarzonych dwukątów. Złóż mieszankę do zastrzyków, łącząc Cas9, chlorek potasu oraz dupleksy gRNA i inkubuj. Przekręć rurkę PCR trzy razy, aby wymieszać, a następnie krótko obróć przez 10 do 15 sekund w mini wirówce.
Po końcowym mieszaniu kręć przez maksymalnie minutę, aby zebrać zawartość. Następnie użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować jeden do dwóch mikrolitrów mieszanki do wtrysku do igły. Zamontuj igłę na uchwytie, rozbij końcówkę, przeciągając po taśmie dwustronnej pod olejem halowęglowym.
I sprawdzę rozmiar otworu za pomocą funkcji czyszczenia mikrowtryskiwacza. Na 2% agarozową podkładkę połóż małą kroplę oleju z halowęglem. Za pomocą mikroskopu rozcinającego i miękkiego platynowego drutu podnieś młodego dorosłego hermafrodyta.
Umyć go w buforze M9, żeby usunąć bakterie. Przełóż nicienie na agarozową poduszkę i umieść ją w kropli oleju z halowęglowodorem. Użyj miękkiego platynowego drutu, aby delikatnie szczotkować nicienie, aż zostanie unieruchomione.
Zamontuj podkładkę na stopniu mikrowtrzykowym. Znajdź jedno ramię gonady i przebij je igłą. Użyj funkcji czyszczenia wtryskiwacza, aby dostarczać mieszankę o sile 99 funtów na cal kwadratowy, aż do momentu, gdy przepływ gonada stanie widoczny, potwierdzając dostęp odczynnika do syncytium.
Jeśli jest dostępny, przesuń stopień i wstrzykni drugie ramię gonady w podobny sposób. Bezpośrednio po wstrzyknięciu ponownie zawiesij poddane zwierzę w jednym do dwóch mikrolitrach buforu M9 na podkładce agarozowej. Użyj cienkiego platynowego drutu, aby zdjąć wstrzyknięty robak z podkładki, następnie zmyj olej buforem M9 i przenieś go na płytę NGM z Comamonas aquatica.
Inkubuj płytę regeneracyjną w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia izoluj każdego wstrzykniętego nicienia P0 na pojedynczych płytkach NGM zasianych Xenorhabdus griffiniae. Zaprojektowano dwa RNA CRISPR skierowane do homologu Steinernema hermaphroditum unc-22 w wcześniej opublikowanych miejscach PAM.
Analiza szarpanych nicieni narażonych na nikotynę wykazała wyraźne różnice w ruchu między mutantami UNC-22 a nicieniami typu dzikiego. Genotypowanie drgającego potomstwa za pomocą PCR wykazało wiele słabych pasm w miejscu docelowym zarówno dla Pam 3, jak i Pam 5. Sekwencjonowanie potwierdziło insercje i usuwanie w docelowym miejscu UNC-22.
Moje laboratorium rozszerzyło moją pracę podoktorską w genetyce EPN. CRISPR jest obecnie dostępny u trzech gatunków Steinernema. W tym protokole opracowaliśmy efektywną technikę tworzenia stabilnych, dziedzicznych mutantów z wykorzystaniem edycji genów CRISPR-Cas9.
Dzięki stabilnej edycji genów CRISPR-Cas9 możemy rozłożyć na czynniki pierwsze molekularne mechanizmy symbiozy Steinernema-Xenorhabdus.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje inżynierię genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas9 u Steinernema hermaphroditum, nicienia entomopatogennego i rozwijającego się modelu genetycznego. Technologia ta jest przydatna do tworzenia mutantów w celu wyjaśnienia funkcji genów w biologii nicieni, istotnych dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Mikrobiologia
- Entomologia
Wstęp
- CRISPR-Cas9 jest potężnym narzędziem do edycji genomu.
- Steinernema hermaphroditum służy jako organizm modelowy do badania nicieni.
- Zrozumienie funkcji genów może dostarczyć wiedzy na temat relacji symbiotycznych.
- Nicienie entomopatogenne są ważne dla biologicznej kontroli szkodników.
Cel badania
- W celu zademonstrowania zastosowania CRISPR-Cas9 u nicieni.
- W celu stworzenia mutantów do funkcjonalnej analizy genów.
- W celu zbadania podłoża genetycznego interakcji mutualistycznych i pasożytniczych.
Zastosowane metody
- Techniki edycji genomu CRISPR-Cas9.
- Generowanie i charakterystyka mutantów.
- Analiza funkcji genów w biologii nicieni.
- Ocena zachowań symbiotycznych i pasożytniczych.
Główne wyniki
- Skuteczne zastosowanie CRISPR-Cas9 u Steinernema hermaphroditum.
- Stworzenie żywotnych mutantów o zmiennych funkcjach genów.
- Wgląd w mechanizmy genetyczne leżące u podstaw relacji symbiotycznych.
- Potencjalne implikacje dla strategii zwalczania szkodników.
Wnioski
- System CRISPR-Cas9 jest skuteczny w inżynierii genomu nicieni.
- Mutanty dostarczają cennych informacji na temat funkcji genów.
- Niniejsze badanie pogłębia zrozumienie biologii nicieni oraz ich zastosowań.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Edycja genomu oparta na systemie CRISPR-Cas9 u Steinernema hermaphroditum umożliwia precyzyjną analizę genetyczną mechanizmów mutualistycznych i pasożytniczych u nicieni entomopatogennych. Platforma ta wspiera funkcjonalną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć, co ma bezpośrednie przełożenie na badania translacyjne w biotechnologii rolniczej i ekologicznej. Zdolność do generowania i utrzymywania stabilnych linii mutantów przyspiesza badania i rozwój (B&R) oparte na hipotezach oraz selekcję projektów w ramach portfela nowych celów bioaktywnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ukierunkowaną przerwanie funkcji genów w celu wyjaśnienia szlaków biologicznych leżących u podstaw interakcji nicieni z gospodarzem oraz nicieni z bakteriami.
- Wspiera walidację funkcjonalną genów kandydackich zaangażowanych w mutualizm i pasożytnictwo.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez generowanie obserwowalnych fenotypów powiązanych ze specyficznymi edycjami genetycznymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze i priorytetyzacji dalszych celów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia genetycznie podatny system do opracowywania i walidacji testów fenotypowych u nicieni.
- Umożliwia powtarzalne generowanie linii mutantów dla znormalizowanych procesów przesiewowych.
- Wspiera ilościową ocenę funkcji genów poprzez obserwowalne wyniki fenotypowe.
- Usprawnia opracowywanie testów, wykorzystując rozmnażanie hermafrodytyczne do szybkiego ustanowienia linii homozygotycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie manipulacji genetycznych z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad zwalczaniem szkodników rolniczych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania genów do walidacji funkcjonalnej w systemach istotnych ekologicznie.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie bioaktywnych celów dla zastosowań translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma CRISPR-Cas9 pozycjonuje S. hermaphroditum jako wszechstronny model dla wczesnych odkryć, od badań wstępnych po walidację przedkliniczną w badaniach nad biologią i symbiozą nicieni.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ukierunkowaną mutogenezę i walidację fenotypową.
- Screening: Zapewnia powtarzalne linie mutantów do standaryzacji testów i ilościowych odczytów.
- Analityka: Umożliwia pomiar wyników fenotypowych, takich jak fenotyp drgań (twitching), w celu porównania funkcji genów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Stanowi pomost między etapem odkryć a badaniami przedklinicznymi w modelach zwalczania szkodników i symbiozy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielorazowy zestaw narzędzi genetycznych do prowadzenia ciągłych badań nad genomiką funkcjonalną EPN oraz gatunków pokrewnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne i powtarzalne schematy manipulacji genetycznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym inwestowanie w R&D w obszarze nowych celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych w zastosowaniach rolniczych i ekologicznych.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest biegłość w technikach mikroiniekcji oraz edycji genomu CRISPR-Cas9.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do mikroiniekcji oraz infrastruktury biologii molekularnej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie utrzymania linii mutantów i walidacji fenotypowej.
- Adaptacja do innych gatunków EPN może wymagać optymalizacji protokołu.
- Walidacja fenotypowa jest zależna od obserwowalnych i mierzalnych wyników, takich jak fenotyp drgań (twitching phenotype).
