Name: Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj edycję genomu CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermaphroditum. Metoda umożliwia tworzenie mutantów do badania funkcji genów w symbiozie i zwalczaniu szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Margaret McFall-Ngai i Edwardowi Ruby za korzystanie z ich mikroskopu konfokalnego. Dziękujemy Alexis (Cody) Hargadon i Grischa Chen za szkolenie z mikroskopii konfokalnej oraz Carly R. Myers za pomoc w pozyskiwaniu zdjęć i analizie filmów z drganiami. Dziękujemy również Stephanie Hampton za przydzielenie środków na zakup systemu mikroiniekcji. Carnegie Institution for Science wspierała tę pracę.

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie nicieni przed mikroiniekcją
<ol>
	<li>Przygotuj płytki z pośrodku wzrostu nicieni (NGM) zasiane bakteriami Xenorhabdus griffiniae i Comamonas aquaticus. UWAGA: Hodować nicienie S. hermaphroditum na ich rodzimej symbiotycznej bakterii Xenorhabdus griffiniae przed mikroiniekcją, aby zmaksymalizować wzrost nicieni i odzyskać zwierzęta po wstrzyknięciu bakterii Comamonas aquaticus , aby zwiększyć przeżywalność po wstrzyknięciu14.
	<ol>
		<li>Bakteria pasma X. griffiniae na płytkach agaru z LB-piruwianem (2,5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g tryptonu, 2,5 g chlorku sodu, 0,5 g pirowierianu sodu, 7,5 g agaru w 500 mL wody) i inkubuje przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Bakteria prążkowa C. aquaticus na płytkach agarowych LB i inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię bakterii do inokulacji ciemnego płynnego medium LB (5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu, 5 g chlorku sodu w 1 litrze wody). Hodować kultury bakteryjne przez noc (maksymalnie 16 godzin) z aeracją (X. griffiniae w 30 °C i C. aquaticus w 37 °C).</li>
		<li>Przygotuj agar NGM: (3 g NaCl, 2,5 g peptonu i 20 g agaru dodane do 975 mL wody, z 1 mL cholesterolu, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KPO4 dodane po autoklawingu) 10 mL na 60 mm x 15 mm szalki Petriego.</li>
		<li>Bakterie nasienne: Dodaj kilka kropelek nocnej hodowli bakteryjnej na każdą płytkę agaru NGM, delikatnie potrząśnij, aby rozprowadzić krople bakteryjne w jednym miejscu.</li>
		<li>Inkubuj płytki NGM z nasionami bakterii w temperaturze pokojowej, aby umożliwić agarowi wyschnięcie i rozwój bakterii. UWAGA: Płytki z nasionami X. griffiniae powinny być używane jak najszybciej; Płytki C. aquaticus można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1-2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap nicieni UWAGA: Wybierz stadium J3 hermafrodyty w nocy przed wstrzyknięciem i młodych dorosłych w dniu wstrzyknięcia.<ol>
		<li>Na przygotowanych płytkach NGM z X. griffiniae można zebrać lub podzielić nicienie S. hermaphroditum na kawałki. Inkubuj w temperaturze 25-28 °C, aby zapewnić optymalny wzrost.</li>
		<li>Noc przed mikroiniekcją pobierz stadium J3 hermafrodytów na agar NGM z X . griffiniae. Jak pokazano na Rysunku 1A, stadium J3 szacuje się na podstawie wielkości nicienia oraz morfologii gonad i sromu.</li>
		<li>W dniu mikroiniekcji zbieraj młode dorosłe hermafrodyty (Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie CRISPR-Cas9 do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wybór crRNA CRISPR i magazynowania odczynników<ol>
		<li>Wyodrębnić docelową sekwencję genu z referencyjnego genomu Steinernema hermaphroditum za pomocą BlastP, PRJNA982879.</li>
		<li>Wybierz wczesną sekwencję kodującą ekson, jeśli to możliwe, najlepiej pierwszy egzon, i wprowadź sekwencję do CRISPRScan używając domyślnych ustawień26 , aby wygenerować listę możliwych RNA (crRNA) CRISPR.</li>
		<li>Uderz najwyższe crRNA w genom S. hermaphroditum , aby zapewnić wybór tylko unikalnych crRNA. UWAGA: Opcjonalnie: Potwierdź sekwencję docelowego regionu genomu za pomocą amplifikacji PCR i sekwencjonowania Sangera przed projektowaniem crRNA, aby zapewnić efektywne wiązanie crRNA.</li>
		<li>Przechowuj RNA CRISPR (crRNA) oraz uniwersalne transaktywujące RNA CRISPR (tracrRNA) w ilości 100 μM każda w buforze dupleksowym w -80 °C.</li>
		<li>Przechowuj białko Cas9 w dawce 10 mg/ml w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Przechowuj 1 M KCl w 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie podkładki z 2% agarozy do zastrzyków (adaptacja z Berkowitz i in.27)<ol>
		<li>Roztop 2% agarozy w wodzie w mikrofalówce.</li>
		<li>Przelej 50 μL stopionej agarozy na szkło pokrywowe (48 x 60 mm nr 1). Natychmiast przykryj kroplę agarozy kolejnym szkłem przykrywkowym.</li>
		<li>Pozwól agarozę wyschnąć w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Zdejmij górne szkło pokrywy. Oznacz przednią stronę agarozowej podkładki. UWAGA: Opcjonalnie: Piecz agarozowy podkład w 37 °C przez noc, aby dodatkowo go wysuszyć.</li>
		<li>Przechowuj podkładki z agarozą o stężeniu 2% w temperaturze pokojowej przez miesiące lub lata.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie igły<ol>
		<li>Produkuj igły kwarcowe według następujących parametrów na wyciągarce filamentu laserowego. Stosowany w tym badaniu zastosowano w programie do wyciągania igieł następująco: Ciepło: 700, Włókno: 4, Prędkość: 60, Opóźnienie: 145, Ciągnięcie: 175.</li>
		<li>Usuń igły kwarcowe (przemierzenie: 1,0 mm, średnica: 0,7 mm) tuż przed wstrzyknięciem lub przed terminem i przechowuj je w pudełku na pipety. UWAGA: Alternatywnie, mamy również sukcesy w wstrzykiwaniu igieł borokrzemowych (średnica średnicy: 1,2 mm, średnica: 0,68 mm). Należy zauważyć, że różne rozmiary drutów będą pasować do różnych rozmiarów uchwytów na igły.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja CRISPR-Cas9 i odzyskiwanie nicieni po mikrowstrzyknięciu
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę mikroiniekcji CRISPR-Cas9 (adaptację Wang i in.28)<ol>
		<li>Przygotuj świeże duplexy RNA prowadzące, mieszając wybrane crRNA i uniwersalne tracrRNA w stosunku 1:1, czyli całkowite crRNA do tracrRNA w rurce PCR: crRNA #1 (100 μM) - 1,5 μL crRNA #2 (100 μM) - 1,5 μL tracrRNA (100 μM) - 3,0 μL UWAGA: Jeśli używamy co-CRISPR, crRNA #1 celuje w gen markerowy unc-22 , podczas gdy crRNA #2 może zostać zastąpione inną sekwencją skierowaną na drugi gen zainteresowania.</li>
		<li>Inkubuj rurkę PCR w termocyklerze w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Złóż mieszankę do wstrzykiwania, łącząc następujące składniki, a następnie inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej: Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL 1M KCl - 0,58 μL duplexy gRNA (od kroku 3.1.1) - 2,7 μL</li>
		<li>Wymieszaj trzy razy, przekręcając probówkę PCR, a następnie krótko obróć (10-15 s) w mini wirówce, aby zebrać zawartość probówki. Po końcowym wymieszaniu odkręcaj dłużej, do 1 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj i złam igłę<ol>
		<li>Załaduj igłę 1-2 μL mieszanki wtryskowej za pomocą końcówki mikroładowającej.</li>
		<li>Złóż igłę do uchwytu na pipetę (igłę), a następnie rozbij końcówkę, przeciągając igłę po kawałku taśmy dwustronnej pokrytej olejem halowęglowodorowym. Sprawdź otwarcie igły za pomocą funkcji CLEAN mikrowtryskiwacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrowstrzykiwanie do gonad syncytialnych młodego dorosłego nicienia<ol>
		<li>Przelej małą kroplę oleju z halowęglowodoru na 2% agarozową podkładkę.</li>
		<li>Pod stereoskopem rozcinającym użyj cienkiego (miękkiego) platynowego drutu, aby podnieść młodego dorosłego nicienia hermafrodyta i przemyć go w buforze M9 (na litr: 3 g KH2PO4, 11,3 g Na2HPO4, 5 g NaCl, z 1 ml 1 M MgSO4 dodanym po autoklawingu), aby usunąć bakterie (patrz młody dorosły nicienie na Rysunku 1).</li>
		<li>Przełóż umyty nicienie na agarozową podkładkę i umieść ją w kropli oleju z halowęglowodorem. Użyj miękkiego platynowego drutu, aby delikatnie szczotkować nicienie, aż zwierzę zostanie unieruchomione.</li>
		<li>Ostrożnie umieść podkładkę agarozową na etapie mikroiniekcji. Orientacja syncytium gonada powinna być skierowana na igłę pod kątem około 45°. Zacznij od 5x powiększenia, potem przejdź na 20x i 40x powiększenia dla zastrzyków.</li>
		<li>Upewnij się, że igła przenika przez syncyt, a następnie użyj funkcji CLEAN mikrowtryskiwacza, aby wprowadzić mieszankę do wstrzykiwania przy temperaturze około 99 psi, aż do wyraźnego przepływu gonadalnej wstrzykniętej cieczy, aby umożliwić dostęp odczynników do komórek zarodkowych w syncytium gonad.</li>
		<li>Jeśli drugie ramię gonady jest dostępne, przesuń stopień, aby ustawić igłę do wstrzyknięcia do drugiego ramienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regeneracja nicieni po wstrzyknięciu<ol>
		<li>Bezpośrednio po wstrzyknięciu ponownie zawiesij wstrzyknięte zwierzę w 1-2 μL buforu M9 na agarozowym podkładce.</li>
		<li>Używając cienkiego platynowego drutu, zdejmij wstrzyknięty nicienie z agarozowej podkładki i zmyj olej buforem M9.</li>
		<li>Odzyskanie nicieni na płytkach NGM z trawnikiem bakterii C. aquatica (przygotowanie płytek NGM: patrz krok 1.1), co zwiększa wskaźnik przeżycia nicieni po wstrzyknięciu14. Inkubować w 25 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia izoluj każdego wstrzykniętego nicienia (P0) na pojedynczej płycie NGM zasianej X. griffiniae. Pozwól zwierzętom P0 wydać potomstwo F1 przez noc (składając jaja lub pakując do worków) w celu fenotypowania i genotypowania (patrz krok 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie w celu potwierdzenia nokautów pośredniczonych przez CRISPR-Cas9
<ol>
	<li>Nikotynowy (UWAGA) przesiew F1 pod kątem fenotypu drgającego przy użyciu unc-22 jako markera co-CRISPR<ol>
		<li>Przenieś potomstwo F1 z wstrzykniętych zwierząt P0 do roztworu 2% nikotyny.</li>
		<li>Wybierz pojedyncze drgające zwierzę z miejsca nikotyny i natychmiast przyłóż je na agar NGM z X . griffiniae. Wyizoluj każdy drgający F1 na osobnej płycie i pozwól mu produkować zwierzęta F2 do genotypowania (patrz krok 4.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotypowanie<ol>
		<li>Wybierz osiem potomków F2 lub F3 z każdej linii F1 do genotypowania. Do tych zwierząt należą prawdopodobnie zarówno heterozygotyczne +/mut, jak i homozygotyczne mut/mut. </li>
		<li>Przygotuj świeży bufor do ekstrakcji DNA, dodając 20 μL proteinazy K (10 mg/mL) do 180 μL buforu lizy robaka (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% żelatyny).</li>
		<li>Dodaj nicienie do 10 μL buforu ekstrakcyjnego DNA w probówkach PCR. Inkubować w 65 °C przez 10 minut, następnie w 95 °C przez 15 minut, aby wyodrębnić DNA genomowe.</li>
		<li>Genotypizując nicienie poprzez amplifikację PCR docelowego obszaru Cas9 zgodnie z instrukcjami producenta, używając 1-2 μL lizatu z etapu 4.2.2. Ważne jest, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń, jeśli to możliwe (co najmniej 300 bp), między miejscami cięcia Cas9 a miejscami wiązania podkładu na wypadek dużych wydzieleń. UWAGA: Elektroforeza żelowa agarozowa może być użyta do potwierdzenia skutecznego wzmocnienia przed sekwencjonowaniem.</li>
		<li>Oczyść produkt PCR zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić dokładną analizę śladów sekwencjonowania Sanger.</li>
		<li>Sekwencjonowanie amplikonów PCR wygenerowanych w kroku 4.2.4 za pomocą sekwencjonowania Sangera i analizowanie chromatogramów za pomocą programu ICE29.</li>
		<li>Jeśli w kroku 4.2.6 potwierdzono mutacyjne allele, wróć do oryginalnej płytki drgającej F1 i wyizoluj co najmniej osiem hermafrodytów na poszczególnych płytkach. Pozwól każdemu nicieniu wydać potomstwo, a następnie masowo je genotypować, aby potwierdzić homozygotyczność. Linie homozygotyczne można utrzymywać w laboratorium, zgodnie z krokiem 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Konserwacja linii CRISPR
UWAGA: Istnieją trzy główne metody utrzymania linii. Należą do nich krioprezerwacja oparta na trehalozie i DMSO (krok 5.1), przepuszczanie in vivo przez robaki woskowe (krok 5.2) oraz konserwacja in vitro na płytkach NGM (krok 5.3).
<ol>
	<li>Trehaloza-DMSO kriokonserwacja linii typu dzikiego i mutantów UWAGA: Stosując trehalozowo-DMSO metodę kriokonserwacji4, S. hermaphroditum może być stabilnie przechowywany przez długi czas w temperaturze -80 °C i odzyskiwany na nośniku NGM. Nicienie zamraża się w fiolkach kriogenicznych o pojemności 2 mL. Optymalne zamrożenie osiąga się poprzez stopniowe chłodzenie przy użyciu pojemnika z pianki polistyrenowej.<ol>
		<li>Uprawiaj S. hermaphroditum na NGM zasianym X. griffiniae (patrz krok 1.1), aż większość populacji stanowi J1 lub worek z hermafrodytami. UWAGA: Unikaj zakaźnych stadiów młodocianych (IJ), ponieważ nie mrozą się dobrze przy tej metodzie.</li>
		<li>Zmyj nicienie z płytek agarowych NGM w buforze M9 i zbieraj w stożkowych probówkach o pojemności 15 mL do poziomu 5 mL. Koncentruj przez wirowanie (wystarczy 1372 x g przez 1-2:30 minut).</li>
		<li>Usuń supernatant i przepłucz raz w buforze zamrażającym Trehalosa i DMSO w temperaturze pokojowej 5 mL przez wirowanie, zgodnie z parametrami podanymi w kroku 5.1.2.</li>
		<li>Ponownie zawiesij robaki w buforze zamrażającym Trehalose-DMSO o temperaturze pokojowej 5 mL. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut z rurką na boku. To zwiększa szanse na przeżycie.</li>
		<li>Podawaj 1 mL na probówkę w 4 fiolkach kriogenicznych.</li>
		<li>Umieść fiolki w pudełkach z pianki polistyrenowej w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Tydzień później rozmroz jedną z fiolek.</li>
		<li>Resztę fiolek przełóż do zamrażarek o temperaturze o temperaturze 80°C i przechowuj je na stałe.</li>
		<li>Testowe rozmrażanie lub odzyskiwanie S. hermaphroditum z mrożonych zapasów<ol>
			<li>Wyjmij fiolkę z zamrażarki i pozwól jej całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wylej zawartość płynu na świeżą płytkę NGM. Należy zauważyć, że dodanie bakterii symbiotycznej nie jest konieczne, ponieważ zamrożony zapas zwykle zawiera wystarczającą ilość bakterii symbiotycznych. Robaki powinny zacząć się regenerować w ciągu kilku minut do godzin.</li>
			<li>Obserwuj ruch i rozmnażanie nicieni. Po dniu lub dwóch przenieś kilka nicieni na nowe płytki NGM z X . griffiniae.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie in vivo poprzez Galleria mellonella UWAGA: Dla wzrostu in vivo rozmnażaj linie mutantów S. hermaphroditum przez larwy Galleria mellonella (woskowca) w 5. stadium . Ta metoda jest szczególnie przydatna dla linii, które nie są żywotne po kriochronie. Szczegółowy i podobny protokół naturalnego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych przez owady oraz inne podłoża do wzrostu EPN można znaleźć w (McMullen i in.30). W skrócie:<ol>
		<li>Pozwól nicieniom głodować i stać się IJ-ami na płytkach NGM.</li>
		<li>Użyj bufora M9, aby usunąć IJ-y z płyt NGM.</li>
		<li>Przenieś IJ, aby zainfekować owady Galleria za pomocą pułapki białej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby utrzymać płyty NGM in vitro , postępuj zgodnie z krokami:<ol>
		<li>Nasienki NGM z około 100 μL świeżej płynnej hodowli symbionta S. hermaphroditum , X. griffiniae.</li>
		<li>Pozwól bakteryjnemu plastrowi całkowicie wyschnąć, zanim przeniesiesz nicienie na płytkę.</li>
		<li>Przechowuj płytki w temperaturze 25 °C i przenosi nicienie na świeżo nasione płytki mniej więcej raz w miesiącu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że nie ma konfliktu interesów.

Niekonwencjonalne modele genetyczne zwierząt dają cenne możliwości badania funkcji genów eukariotycznych w kontekstach ekologicznych i fizjologicznych, w których te cechy naturalnie występują, na przykład w obecności gospodarza pasożytniczego lub rodzimego mikrobiomu organizmu. W entomopatogenicznych nicieniu (EPN) manipulacja genetyczna opierała się na niektórych przypadkach podejść opartych na RNAi13,32. Chociaż RNAi umożliwia funkcjonalne badania genetyczne u niektórych ...

Nicienie entomopatogeniczne (EPN) to pasożyty zabijające owady, które tworzą specyficzne dla gatunku wzajemne partnerstwa ze swoimi symbiontami bakteryjnymi1. EPN składają się z dwóch rodzin: Steinermatidae i Heterorhabditidae, które łączą się z bakteriami Gram-ujemnymi z gatunków Photorhabdus i Xenorhabdus, odpowiednio 2,3. W okresie wolnożyjącego, zakaźnego stadium młodocianego (IJ) nicieni Steinernema, bakterie Xenorhabdus są umieszczone w kieszeni jelitowej nicieni zwanej receptacle, a po przeniknięciu żywiciela-owada do hemokola bakterie są uwalniane, po czym się mnożą i zabijają owada przez sesekę 3,4. W tej mutualistycznej relacji bakterie produkują związki przeciwdrobnoustrojowe i owadobójcze, które chronią przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza i zapewniają wsparcie żywieniowe nicieni. W zamian bakterie korzystają z ochrony zapewnianej przez żywicionika przed mikroorganizmami środowiskowymi i ułatwiają ich rozprzestrzenianie się na nowe owady 6,7.
W ciągu ostatnich kilku dekad partnerstwo Steinernema-Xenorhabdus zostało ustanowione jako potężny system eksperymentalny do badania różnych aspektów interakcji pasożytniczych i mutualistycznych, takich jak zachowania poszukiwania żywicielaowadów 3, kolonizacja bakterii u nicieni8 oraz adaptacyjne zachowania bakterii symbiotycznych, które ułatwiają ich przejścia między nicieniem a zwierzętami żywicielamiowadów 9. EPN są również ważnym gatunkiem dla zrównoważonego rozwoju gleby i są wykorzystywane jako organiczne środki zwalczania szkodników w celu zwiększenia produktywności rolniczej10,11.
Pomimo szybkiego rozwoju narzędzi genetycznych u symbiotycznych bakterii Xenorhabdus i Photorhabdus12, spójne narzędzia genetyczne w EPN były rzadkie. Mikroiniekcje gonada zostały z powodzeniem ustanowione zarówno u heterorhabditis, jak i Steinernema nematodes 13,14. Wcześniej mikroiniekcje gonadalne w bakterii Heterorhabditis były stosowane do konsekwentnego dostarczania podwójnie niciowego RNA do wyniszczenia genu u pierwszego pokolenia potomstwa13,15. Ostatnio opracowano edycję genomu CRISPR-Cas9 w Steinernema, dostarczaną za pomocą mikroiniekcji gonad, co doprowadziło do precyzyjnych, stabilnych i dziedzicznych mutacji14.
Jedna z gatunków Steinernema, S. hermaphroditum, została wykazana jako bardzo łatwa do opanowania i ma duży potencjał jako rozwijający się organizm modelowy genetyczny 4,14. Początkowo izolowany z gleby w Indonezji16 i ponownie izolowany w Indiach17, S. hermaphroditum jest konsekwentnie hermafrodytą, z niewielką liczbą samców w każdym pokoleniu, co ułatwia adaptację narzędzi genetycznych klasycznego nicienia modelowego C. elegans4. Ponadto genom S. hermaphroditum został zsekwencjonowany i złożony w chromosomy, co upraszcza identyfikację potencjalnych miejsc docelowych Cas9 i projektowanie primerów18.
Podczas mikroiniekcji EPN mieszanka z odpowiednimi odczynnikami, takimi jak dsRNA, białko Cas9 lub RNA przewodnie, jest dostarczana do gonady nicieni syncytialnej za pomocą igły wyciągniętej z kapilary kwarcu. Odpowiednia objętość i ciśnienie wtrysku powodują widoczny "przepływ" cieczy przez ramię gonada. Ponieważ nicienie te mają parę gonad syncytialnych złożone z jąder linii zarodkowych, które dzielą ten sam cytosol19, podejście mikroiniekcji pozwala na dostęp do wielu komórek zarodkowych do edycji, zanim nastąpi cytokineza, rozdzielając jądra linii zarodkowej na rozwijające się oocyty20. Chociaż mikroiniekcje gonada stanowią spójną technikę modulacji genetycznej u kilku gatunków nicieni niemodelowych 14,21,22,23,24,25, kluczowe jest dostosowanie technik wstrzykiwania do odpowiednich struktur gonad, stadium życiowego i stanu fizjologicznego każdego gatunku nicienia, aby zapewnić sukces i wysoką efektywność podawania. Techniki odzyskiwania po wstrzyknięciu oraz utrzymanie linii mutantów są ważne, aby zapewnić opłacalność tej metody.
Badanie to demonstruje protokół edycji genomu CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum. Mikroiniekcja gonada opisana jest u młodego dorosłego, stadium odporne na mikroiniekcje pod wysokim ciśnieniem i podatne na edycję genów14. Ponadto przedstawiono szczegółowe metody opisujące utrzymanie dziedzicznych i stabilnych linii mutantów, zarówno poprzez kriokonserwację, jak i rozmnażanie przez owady.

<table><tbody><tr><td>Agar (siatka 80-100)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Stosowane także w płytkach LB Pyruvate</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Stosowane także w genotypowaniu</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Igły borokrzemowe</td><td>Światowy Instrument Precyzyjny</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL w etanolu</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe na podkład agarozowy</td><td>Laboratoria badawcze nad mózgiem</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 mm grubości no1</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>DNA Clean i Conkoncentrator-5&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x mikroinjektor z zestawem głowic chwytowych 4, uchwyt na igły rozmiar 0</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larwy 5. stadium Galleria melonella</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>System obrazowania żelowego</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do załadunku żelowego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna (2%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biot</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Primery genotypizacyjne: oligomorfometryka DNA, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Stosowane także w płytach Dark LB, LB Pyruvate&nbsp;</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Gibco Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Stosowane także w płytach Dark LB, LB Pyruvate&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw głowic chwytu 4 rozmiar 1 uchwyt na igły</td><td>Kaliber</td><td>EPE-5196083008</td><td>(w połączeniu z igłą borokrzemową 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Olej halowęglowodowy 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Twardy draty z drutu do codziennej konserwacji</td><td>Badania Tritech</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Wnioskowanie o edycjach CRISPR (ICE)</td><td>Synthego</td><td>Nie ma</td><td>Oprogramowanie używane do analizy sekwencji Sangera w celu identyfikacji indelów</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy wyciągacz igieł P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Dla bufora M9, również stosowany w NGM</td></tr><tr><td>Grot mikroładowarki 2x96ST</td><td>Kaliber</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Adapter montażowy mikromanipulatora dla Zeiss Axio Observer i Axiovert 200</td><td>Badania Tritech</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nikotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Bufor dupleksowy wolny od nukleazy</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka na pipety</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dibazowy (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH dla NGM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Dla bufora M9, również stosowany w NGM</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Igły kwarcowe</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium genom</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>IDT</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Stosowane także w płytach M9, Dark LB, LB Pyruvate</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dibazowy (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Dla bufora M9</td></tr><tr><td>Pirorotroczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Stosowane także w płytkach LB Pyruvanet&nbsp;</td></tr><tr><td>Miękki draty z platyny w kształcie robaka do mikrowstrzyknięcia</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platyna 90%, iryd 10% drut stopowy, średnica 0,002 cala x długość 5 stóp</td></tr><tr><td>Standardowy uchwyt na igły</td><td>Badania Tritech</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereo</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy adapter montażowy mikromanipulatora</td><td>Badania Tritech</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutageneza oparta na crispr-cas9 w nicieniu entomopatogenicznym steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Nicienie entomopatogeniczne (EPN) z rodzajów Steinernema i Heterorhabditis utrzymują wzajemne interakcje z bakteriami symbiotycznymi Xenorhabdus i Photorhabdus , odpowiednio. Razem te pary nicieni-bakterie infekują i zabijają żywicieli owadów, które są głównie larwami z rzędów motyli i chrząsków, tworząc rozstrzygalny system trójdzielny do analizy molekularnych podstaw mutualizmu i pasożytnictwa. Kluczowym krokiem w pełnym wykorzystaniu tego modelu jest opracowanie stabilnych i transgeneracyjnych narzędzi genetycznych u EPN. Tutaj demonstrujemy wiarygodną platformę do edycji genomu CRISPR–Cas9 w rozwijającym się modelu Steinernema hermaphroditum, gatunku łatwym do utrzymywania in vivo i in vitro, który jest wysoce podatny na mikroiniekcje gonada. Co ważne, jej hermafrodytyczne rozmnażanie znacznie usprawnia generowanie i utrzymanie homozygotycznych linii mutantów. Dostarczamy szczegółowy protokół efektywnego, ukierunkowanego rozbicia genów przy użyciu mikroiniekcji kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9. Jako dowód koncepcji zmodyfikowaliśmy zachowany gen związany z mięśniami unc-22, generując charakterystyczny fenotyp drgawki, który potwierdza ukierunkowaną mutagenezę w tym systemie. Ta platforma CRISPR–Cas9 otwiera drzwi do stabilnej manipulacji genetycznej u S. hermaphroditum, takiej jak ekspresja transgenów, i zapewnia ramy, które można rozszerzyć na dodatkowe gatunki EPN o znaczeniu rolniczym i ekologicznym.

Zaprojektowano dwa RNA CRISPR (zidentyfikowane numerem stanowiska Pam – Pam 3 i Pam 5) skierowane na homolog S. hermaphroditum unc-22 w wcześniej opublikowanych stanowiskachPam 14 (Rysunek 2A). Każde crRNA złożyło się z tracrRNA, tworząc jedno RNA prowadzące (sgRNA) i zostało włączone do Cas9, tworząc rybonukleoproteinę opisaną w kroku 3.1. W tym protokole zaprojektowano dwa crRNA, aby celować w ten sam gen; jednak przy zastosowaniu metody co-CRISPR ...

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Pracujemy nad genetyką symbiozy bakterii nicieni, która ma zastosowania rolnicze. Narzędzia genetyczne w bakteriach Xenorhabdus są bardzo dobrze rozwinięte, ale genetyka EPN pozostaje ograniczona, głównie opierając się na badaniach RNAi i EMS. Na początek zdobądź płytki agarowe nicieni nasiane Xenorhabdus griffiniae i Comamonas aquaticus.Na przygotowanych płytkach NGM zawierających Xenorhabdus griffiniae należy zebrać nicienie Steinernema hermaphroditum. Inkubuj je w temperaturze 25 do 28 stopni Celsjusza, aby rosły jak optymalnie. Noc przed mikroiniekcją pobierz hermafrodyty stadia J3 na świeże płytki agarowe NGM z Xenorhabdus griffiniae.W dniu mikroiniekcji wybieraj młode dorosłe hermafrodyty do wstrzyknięcia. Wyodrębnić sekwencję docelowego genu z referencyjnego genomu Steinernema hermaphroditum za pomocą BlastP. Wybierz wczesny kodujący egzon, najlepiej pierwszy egzon, i wprowadź sekwencję do CRISPRscan, używając domyślnych ustawień, aby wygenerować kandydatów RNA CRISPR.Zrzuć najlepsze kandydatskie RNA CRISPR na genom Steinernema hermafroditum, aby upewnić się, że nie ma niecelnych dopasowań. Przechowuj wybrane RNA CRISPR oraz uniwersalne transaktywujące RNA CRISPR o długości 100 mikromolów każde w buforze dupleksowym przy minus 80 stopniach Celsjusza. Roztop 2% agarozy w wodzie w mikrofalówce.Przelej 50 mikrolitrów stopionej agarozy na szklankę pokrywową. Natychmiast przykryj ją drugim szkłem. Po 20 minutach schnięcia zdejmij górną szklankę, a następnie oznacz przednią stronę agarozowego podkładu.Przechowuj agarozowe podkładki w temperaturze pokojowej do długotrwałego użytkowania przez miesiące lub lata. Aby przygotować igły do wstrzyknięcia, wyciągnij włosy kwarcowe za pomocą wyciągacza filamentu laserowego i przechowuj igły w pudełku do przechowywania pipet. Przygotuj świeże duplexy RNA prowadzące, mieszając wybrane crRNA oraz uniwersalne transaktywujące RNA CRISPR w proporcji jeden do jednego.Inkubuj rurkę w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie schódź do temperatury pokojowej do wyżarzonych dwukątów. Złóż mieszankę do zastrzyków, łącząc Cas9, chlorek potasu oraz dupleksy gRNA i inkubuj. Przekręć rurkę PCR trzy razy, aby wymieszać, a następnie krótko obróć przez 10 do 15 sekund w mini wirówce.Po końcowym mieszaniu kręć przez maksymalnie minutę, aby zebrać zawartość. Następnie użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować jeden do dwóch mikrolitrów mieszanki do wtrysku do igły. Zamontuj igłę na uchwytie, rozbij końcówkę, przeciągając po taśmie dwustronnej pod olejem halowęglowym.I sprawdzę rozmiar otworu za pomocą funkcji czyszczenia mikrowtryskiwacza. Na 2% agarozową podkładkę połóż małą kroplę oleju z halowęglem. Za pomocą mikroskopu rozcinającego i miękkiego platynowego drutu podnieś młodego dorosłego hermafrodyta.Umyć go w buforze M9, żeby usunąć bakterie. Przełóż nicienie na agarozową poduszkę i umieść ją w kropli oleju z halowęglowodorem. Użyj miękkiego platynowego drutu, aby delikatnie szczotkować nicienie, aż zostanie unieruchomione.Zamontuj podkładkę na stopniu mikrowtrzykowym. Znajdź jedno ramię gonady i przebij je igłą. Użyj funkcji czyszczenia wtryskiwacza, aby dostarczać mieszankę o sile 99 funtów na cal kwadratowy, aż do momentu, gdy przepływ gonada stanie widoczny, potwierdzając dostęp odczynnika do syncytium.Jeśli jest dostępny, przesuń stopień i wstrzykni drugie ramię gonady w podobny sposób. Bezpośrednio po wstrzyknięciu ponownie zawiesij poddane zwierzę w jednym do dwóch mikrolitrach buforu M9 na podkładce agarozowej. Użyj cienkiego platynowego drutu, aby zdjąć wstrzyknięty robak z podkładki, następnie zmyj olej buforem M9 i przenieś go na płytę NGM z Comamonas aquatica.Inkubuj płytę regeneracyjną w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia izoluj każdego wstrzykniętego nicienia P0 na pojedynczych płytkach NGM zasianych Xenorhabdus griffiniae. Zaprojektowano dwa RNA CRISPR skierowane do homologu Steinernema hermaphroditum unc-22 w wcześniej opublikowanych miejscach PAM.Analiza szarpanych nicieni narażonych na nikotynę wykazała wyraźne różnice w ruchu między mutantami UNC-22 a nicieniami typu dzikiego. Genotypowanie drgającego potomstwa za pomocą PCR wykazało wiele słabych pasm w miejscu docelowym zarówno dla Pam 3, jak i Pam 5. Sekwencjonowanie potwierdziło insercje i usuwanie w docelowym miejscu UNC-22.Moje laboratorium rozszerzyło moją pracę podoktorską w genetyce EPN. CRISPR jest obecnie dostępny u trzech gatunków Steinernema. W tym protokole opracowaliśmy efektywną technikę tworzenia stabilnych, dziedzicznych mutantów z wykorzystaniem edycji genów CRISPR-Cas9.Dzięki stabilnej edycji genów CRISPR-Cas9 możemy rozłożyć na czynniki pierwsze molekularne mechanizmy symbiozy Steinernema-Xenorhabdus.

crispr-cas9-based-mutagenesis-entomopathogenic-nematode-steinernema

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przesiewowe poszukiwanie mutantów z defektami fenotypowymi jest prostą metodą identyfikacji genów funkcjonujących w danym procesie biologicznym. W niniejszym artykule opisujemy sposób hodowli wolnożyjących nicieni (np. Pristionchus pacificus) w warunkach laboratoryjnych i przedstawiamy dwie różne metody mutagenezy: EMS oraz TMP/UV.

Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Poznaj edycję genomu CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermaphroditum. Metoda umożliwia tworzenie mutantów do badania funkcji genów w symbiozie i zwalczaniu szkodników.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Przeglądaj więcej filmów