Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości
30 września 2025
Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.
Opracowaliśmy test zastępczy do pomiaru usuwania lipidów płytki wieńcowej w arteriach wieńcowych za pomocą HDL, aby ocenić ryzyko choroby wieńcowej. Obecnym wyzwaniem jest opracowanie prostego, szybkiego i solidnego testu napływu lipidów HDL zarówno do badań klinicznych, jak i klinicznych. Na początek dodaj całą potrzebną zawartość do szklanki pod chemicznym okapem i krótko rozwiń mieszankę lipidów, aby wymieszać roztwory.
Susz mieszankę w szklanej rurce pod delikatnym strumieniem azotu przez godzinę, aby utworzyć suchą warstwę lipidową na dnie rurki. Aby pokryć hydrat krzemianu wapnia, włóż stożek z papieru wagowego do szklanej rurki zawierającej wysuszone lipidy i dodaj 80 miligramów hydratu krzemianu wapnia do rurki, używając stożka do skierowania proszku do podstawy. Natychmiast dodaj 2 mililitry soli fizjologicznej do probówki i przykryj wierzch parafilmem.
Ręcznie przekłucaj szklaną rurkę, aby usunąć większość lipidów z dna. Szklaną rurkę umieść w otworze wykonanym w platformie styropianowej przymocowanej do wiru i przymocuj rurkę do platformy wirującej za pomocą wzmocnionej taśmy. Przeszukaj szklaną rurkę przez 10 minut i popewnij, że na ściance nie pozostał żaden lipid.
Przenieś zawartość szklanej rurki do stożkowej rurki plastikowej o pojemności 15 mililitrów za pomocą pipety o średnicy 1 mililitra. Przemyj szklaną tubkę 3 mililitrami soli fizjologicznej i przelej ją do tej samej probówki 15-mililitrowej. Następnie umieść plastikową rurkę o pojemności 15 mililitrów zawierającą lipidowo-pokryty hydrat krzemianu wapnia do wirówki i obróć w temperaturze 935G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Użyj długiej i cienkiej końcówki pipety, aby zasysać supernatant. Zaczynając od góry supernatantu, powoli przesuwaj końcówkę pipety wzdłuż boku rurki, aspirując. Podczas aspiracji lekko przechyl rurkę i pozostawij około 200 mikrolitrów soli fizjologicznej nad pelletem, aby jej nie zakłócać.
Następnie dodaj sól fizjologiczną, aby całkowita objętość wyniosła 5 mililitrów. Powtórz wirowanie i usunięcie supernatantu cztery razy. Po końcowym płukaniu dodaj sól fizjologiczną, aby uzyskać całkowitą objętość do 2,5 mililitra. Pipette 75 mikrolitrów soli fizjologicznej do każdego dołku płytki o objętości 0,3 mililitra z 96 dołkami, zgodnie z liczbą dołków potrzebnych do zestawu próbek.
Vortex, plastikową rurkę 15-milimetrową zawierającą LC-CSH trzy razy po 10 sekund każda. Używając pipety z jednym dołkiem, wydaj 50 mikrolitrów LC-CSH po prawej stronie dołków zawierających sól fizjologiczną. Po trzech dołkach powtórz protokół wirowania przed wlewem do kolejnych trzech dołków.
Obróć płytę z 96 odwiertami o 180 stopni, tak aby lewa strona odwiertu była teraz przesunięta w prawo. Pipeta 25 mikrolitrów próbek osocza lub surowicy wzdłuż prawej strony każdego dołku. Dla dołków z dodatnim kontrolowaniem należy dodać 25 mikrolitrów referencyjnego standardowego ludzkiego osocza lipidemicznego lub surowicy o normie.
Następnie szczelnie uszczelnij płytę z 96 dołkami folią klejącą i inkubuj ją w ciemności przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1 200 obrotów na minutę w termomieszaczu. Po inkubacji wyjmij płytkę z termomiesza i umieść ją na lodzie. Wiruj płytę przez dwie minuty w temperaturze 935G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpuścić cząstki dawcy i zatrzymać reakcję transferową.
Teraz ostrożnie usuń folię klejową z płyty 96-dołkowej, nie naruszając granulki LC-CSH. Przelej 50 mikrolitrów supernatantu z płyty reakcyjnej do wgłębień czarnej płyty polistyrenowej z płaskim dnem z 96 dołkami za pomocą pipety wielodołkowej. Napełnij zbiornik zwykłą solą fizjologiczną i dodaj 50 mikrolitrów soli fizjologicznej do każdego otworu.
Używając pipety wielokomorowej. Przygotuj 1% Triton X-100 w plastikowej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 milimetrów. Napełnij zbiornik przygotowanym 1% Tritonem X-100 i dodaj 100 mikrolitrów tego samego roztworu w temperaturze pokojowej do każdego odwiertu.
Delikatnie wykręcaj pipetę w górę i w dół dwa do trzech razy za pomocą pipety wielowarstwowej i przebijaj pęcherzyki powietrza z pipety transferowej o średnicy 3 mililitrów. Na koniec zmierz fluorescencję lissaminy rodaminy za pomocą fluorometru z wzbudzeniem na 540 nanometrów i emisją na 600 nanometrach. Opracowano standardową krzywą za pomocą seryjnie rozcieńczonego LRHPE oznaczonego LC-CSH i wykazała wysoce liniową odpowiedź fluorescencyjną.
W badaniu krzywej stężenia w osoczu rosnące objętości zgromadzonej ludzkiej plazmy były podawane w potrójnych dołkach obok kontroli soli fizjologicznej. Krzywa odpowiedzi dawki osocza wykazała doskonałą liniowość między PE, dopływem i objętością osocza, z silną korelacją w zakresie 15-35 mikrolitrów. Nasz prosty i szybki protokół, który przewiduje ryzyko wystąpienia chorób sercowo-naczyniowych, może być wykorzystywany zarówno w badaniach, jak i badaniach diagnostycznych.
Nasze wyniki pokazują, że nasz test może wyjaśnić rolę zarówno komórkowych, jak i zewnętrznych lipidów płytki nazębnej w chorobach sercowo-naczyniowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokoły pomiaru usuwania fluorescencyjnych fosfolipidów z cząsteczek lipidowych dawców przez lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) w ludzkiej osoczu lub surowicy. Badanie wykazuje, że taki pomiar funkcjonalności HDL może pozwolić na przewidzenie ryzyka wystąpienia chorób sercowo-naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Funkcjonalność lipoprotein wysokiej gęstości (HDL)
- Metabolizm lipidów
Wstęp
- HDL odgrywa kluczową rolę w transporcie i metabolizmie lipidów.
- Pomiar funkcjonalności HDL może dostarczyć informacji o stanie układu sercowo-naczyniowego.
- Obecne metody oceny funkcjonalności HDL mogą być złożone i czasochłonne.
- Istnieje potrzeba opracowania prostszych testów do oceny roli HDL w usuwaniu lipidów.
Cel badania
- Opracowanie testu zastępczego do pomiaru usuwania lipidów pośredniczonego przez HDL.
- Ocena ryzyka choroby wieńcowej poprzez analizę funkcjonalności HDL.
- Stworzenie szybkiego i wiarygodnego testu napływu lipidów do HDL do zastosowań badawczych i klinicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszanin lipidowych pod dygestorium chemicznym.
- Mieszanie w wstrząsarzu wirującym (vortexowaniu) i suszenie mieszanin lipidowych w celu utworzenia suchego filmu lipidowego.
- Powlekanie krzemianu wapnia hydratu do analizy.
- Dodawanie soli fizjologicznej i uszczelnienie mieszaniny do analizy.
Główne wyniki
- Opracowany test skutecznie mierzy usuwanie lipidów zapśredniczone przez HDL.
- Wyniki wskazują na korelację między funkcjonalnością HDL a ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych.
- Metoda ta nadaje się zarówno do zastosowań badawczych, jak i klinicznych.
- Do powszechnego zastosowania testu niezbędna jest jego dalsza walidacja.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do oceny funkcjonalności HDL.
- Wyniki potwierdzają potencjał pomiarów HDL w przewidywaniu ryzyka sercowo-naczyniowego.
- Dalsze prace skupią się na dopracowaniu testu w celu szerszego zastosowania.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test specyficznego dla HDL odpływu fosfolipidów (HDL-SPE) odpowiada na krytyczną potrzebę standaryzowanej, wysokoprzepustowej oceny funkcjonalnej HDL w przewidywaniu ryzyka chorób układu krążenia (CVD). Umożliwiając niezawodną, bezkomórkową kwantyfikację mobilizacji lipidów pośredniczonej przez HDL, test ten wspiera wczesnoetapową walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków sercowo-naczyniowych. Jego wartość prognostyczna oraz prostota operacyjna sprawiają, że stanowi on wielokrotnego użytku platformę zarówno dla badań podstawowych, jak i rozwoju translacyjnych biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie zależnego od HDL odpływu lipidów jako mechanistycznego czynnika ochrony przed miażdżycą.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie usuwania lipidów zapśredniczonego przez apolipoproteiny.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych przy wyborze kandydatów do terapii modulujących HDL.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowany, bezkomórkowy system do wysokoprzepustowego badania funkcjonalności HDL.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników odpowiednich do opracowywania i optymalizacji testów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę związków lub leków biologicznych zwiększających zależny od HDL odpływ lipidów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez korelację funkcji HDL z ryzykiem CVD.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji celowanych w HDL.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w modelach przedklinicznych, koncentrując się na funkcjonalnych punktach końcowych mobilizacji lipidów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda HDL-SPE integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjnym opracowywaniem biomarkerów do oceny ryzyka CVD.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie efektu wypływu lipidów napędzanego przez HDL w celu wyjaśnienia hipotez mechanistycznych w miażdżycy.
- Przesiewy: Zapewnienie gotowości i powtarzalności testu do oceny związków chemicznych lub biologicznych.
- Analityka: Dostarczanie ilościowych wyników opartych na fluorescencji do porównywania warunków oraz analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Powiązanie funkcjonalnej oceny HDL ze strategiami biomarkerów klinicznych w przypadku CVD.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonowanie jako skalowalna, ustandaryzowana platforma do wielokrotnego zastosowania w różnych programach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad HDL.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność zarówno w procesach badawczych, jak i klinicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu funkcjonalnego przesiewania na wczesnym etapie opracowywania leków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów modulujących HDL.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biochemii lipidów oraz obsługi analiz opartych na fluorescencji.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury laboratoryjnej, w tym fluorometrów i wirówek.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia porównywalności i powtarzalności danych.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych typów próbek osocza lub surowicy, jednak może wymagać optymalizacji dla różnych macierzy biologicznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego obchodzenia się z próbkami oraz kontroli warunków analizy w celu zapewnienia integralności danych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Preparation of Fluorescent Phospholipid-Labeled Donor Lipid Particles
2:58
Incubation of Plasma/Serum Samples with Fluorescent Phospholipid-Labeled Donor Lipid Particles (LC-CSH)
4:39
Measurement of Fluorescent Phospholipid Efflux to Plasma/Serum HDL
5:55
Results
6:36
Conclusion
