Name: Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę pomiaru funkcjonalności HDL w osoczu ludzkim do oceny ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Protokół ten umożliwia szybką analizę transportu lipidów w badaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były częściowo wspierane przez Program Badań Wewnętrznych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). Wkład autora NIH jest uznawany za dzieła rządu Stanów Zjednoczonych. Wyniki i wnioski przedstawione w niniejszym artykule są autorem autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają stanowiska NIH ani Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej USA.

Pobieranie krwi odbywa się zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskich z 1975 roku (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), zaktualizowanej w 2013 roku, i powinna być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi świadomej zgody.
1. Przygotowanie fluorescencyjnych fosfolipidowych cząstek lipidowych dawcy
<ol>
	<li>Tworzenie filmu lipidowego UWAGA: Przygotuj i wydawaj roztwory w okapu chemicznym. Noś fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary ochronne. Roztwory chloroformu utylizować w organicznych odpadach chemicznych, roztwory Triton X-100 (bez osocza) w odpadach chemicznych oraz roztwory zawierające osocze w odpadach biologicznych/medycznych.<ol>
		<li>Kup roztwory lipidowe w chloroformie od sprzedawcy lub przygotuj je w laboratorium: 25 mg/mL: 1,2-dimyryztoyl-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC): 10 mg/mL: Cholesterol 1 mg/mL: 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissaminerhodamina B sulfonyl) [LRh-PE] UWAGA: Używaj szklanych rurek z zakręcaną głowką. Zabezpiecz nakrętkę taśmą teflonową. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Określ ilość potrzebnego LC-CSH i przygotuj odpowiednią liczbę szklanych tub. W chemicznym okapie do każdej rurki z borokrzemowego szkła o średnicy 10 mm 150 mm dodaj następujące składniki: 472 μL roztworu DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μL roztworu cholesterolowego (8,8 μmol, 3,39 mg) oraz 305 μL LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Krótko zmieszać wir.</li>
		<li>W chemicznym okapie wysusz mieszaninę lipidową w szklanej rurce pod delikatnym strumieniem N2 przez 1 godzinę, aby utworzyć suchy lipidowy film na dnie rurki. UWAGA: Przepływ N2 powinien powodować jedynie lekkie falowanie powierzchni płynu.</li>
		<li>W badaniach wymagających kilku płytek 96-dołkowych przez dni lub tygodnie, przygotuj dużą partię LC-CSH, którą można alicytać do rurek lub użyć do produkcji gotowych do użytku płytek LC-CSH, przechowywanych w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Zobacz kroki 2.2.1-2.2.2 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokrywanie hydratu krzemianu wapnia fluorescencyjną warstwą lipidową UWAGA: Podczas kontaktu z nawilżaniem krzemianu wapnia należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maseczkę oraz okulary ochronne.<ol>
		<li>Włóż do szklanej rurki z wysuszonymi lipidami stożek papieru wagowego. Dodaj 80 mg hydratu krzemianu wapnia (CSH) w proszku (odczynnika usuwającego lipidy) do szklanej rurki za pomocą stożka papieru wagowego, aby skierować proszek do podstawy probówki. Natychmiast dodaj 2 ml soli fizjologicznej do szklanej rurki zawierającej wysuszone lipidy i CSH. Przykryj górę tubki parafilmem.</li>
		<li>Wiruj ręcznie, aby usunąć większość lipidu z dna szklanej rurki. Włóż szklaną rurkę do otworu wykonanego w platformie styropianowej przymocowanej do górnej części wiru. Przymocuj rurkę do platformy wirowej za pomocą wzmocnionej taśmy. UWAGA: Wstępnie dostosuj prędkość wiru, aby mieszanka mogła przesunąć się mniej więcej do połowy szklanej rury.</li>
		<li>Wiruj przez 10 minut. Po wirowaniu potwierdzić, że na ściance rurki nie pozostał żaden lipid. W razie potrzeby można ręcznie przeprowadzić wiry, aż nie pozostanie żaden lipid. Przenieś całkowitą objętość szklanej rurki do stożkowej rurki plastikowej o pojemności 15 mL, używając pipety o pojemności 1 mL. Opłucz ścianki szklanej dodatkowej soli fizjologicznej 3 mL i przelej do tej samej stożkowej plastikowej rurki o pojemności 15 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie LC-CSH<ol>
		<li>Wiruj plastikową rurkę o pojemności 15 mL zawierającą lipidowy powlekany CSH (LC-CSH) przez 2 minuty w dawce 935 × g w temperaturze 4 °C, aby rozpylić cząstki dawcy. Ostrożnie usuń supernatant przez aspirację próżniową za pomocą długiej, bardzo cienkiej końcówki pipety.</li>
		<li>Zacznij od góry supernatantu i powoli przesuwając końcówkę pipety wzdłuż boku rurki, przechylaj rurkę podczas wyjmowania supernatantu. Zostaw niewielką ilość (≈ 200 μL) soli fizjologicznej, aby zapobiec przypadkowemu zasysaniu LC-CSH z pelletu. Dodaj tyle soli fizjologicznej, by całkowita objętość wynieść 5 mL.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.3.1-1.3.2 cztery razy. Po ostatnim myciu dodaj tyle soli fizjologicznej, aby końcowa objętość wyniosła 2,5 mL. UWAGA: Przechowywać w przygotowaniach LC-CSH w 4 °C przez 2 tygodnie lub w -20 °C lub -80 °C do 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie dużych partii gotowych do użycia płyt LC-CSH UWAGA: To podejście umożliwia przygotowanie płytek pomiarowych o jednolitym składzie odczynników z tej samej partii LC-CSH, minimalizując tym samym zmienność pomiarów między płytami.<ol>
		<li>Przygotuj 12 probówek LC-CSH (2,5 mL x 12 probówek), zgodnie z opisaniem w krokach 1.1.1-1.3.2 powyżej. Połącz całą zawartość wszystkich 12 probówek w stożkowej plastikowej tubce o pojemności 50 mL (30 ml objętości całkowitej). Ostrożnie przeprowadzić wir, aby uzyskać jednorodny rozkład cząstek LC-CSH, i podać 6 mL do plastikowej stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Powtórz cztery razy, aby uzyskać łącznie 5 plastikowych stożkowych rurek, z których każda zawiera 6 mL LC-CSH.</li>
		<li>Każda rurka dostarcza wystarczającą ilość LC-CSH do produkcji 5 gotowych do użytku płyt LC-CSH (zawierających 50 μL na odwiert dla wszystkich 96 dołków w jednej płycie). Zobacz kroki 2.2.1-2.2.2 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inkubacja próbek osocza/surowicy z fluorescencyjnymi fosfolipidowymi cząstkami lipidowymi (LC-CSH)
<ol>
	<li>Pojedyncze tablice do natychmiastowego użytku.<ol>
		<li>Pipeta włóż 75 μL soli fizjologicznej do każdego dołka płyty o pojemności 0,3 mL z 96 dołkami, używając tylu dołków, ile potrzeba do analizy zestawu próbek. Pipeta 100 μL soli fizjologicznej do potrójnych dołków kontroli negatywnej (NC) oraz 75 μL soli fizjologicznej do duplikatów dołków z dodatnim kontrolowaniem (PC) (Rysunek 2). Użyj pipety wielokomorowej do podawania.</li>
		<li>Przed podawaniem LC-CSH przerób 15 mL plastikową tubkę z materiału 3 razy, po 10 sekund każda. Używając pipety z pojedynczym dołkiem, rozprowadź 50 μL LC-CSH po prawej stronie dołków zawierających sól fizjologiczną. Szybko podawaj po 50 μL do tylko 3 dołków. Powtórz protokół wiru przed podaniem LC-CSH do kolejnych 3 otworów. UWAGA: Procedura ta jest kluczowa, aby zapewnić, że ciężki LC-CSH, który samoistnie się osadza, jest jednorodnie zawieszony, co pozwala na jednakowe dawkowanie ilości do każdego odwiertu.</li>
		<li>Obróć płytę z 96 odwiertami o 180°, tak aby lewa strona odwiertu była teraz przesunięta w prawo. Pipeta 25 μL próbek plazmy/surowicy wzdłuż prawej strony studni (Rysunek 2). Do dołków PC należy dodać 25 μL referencyjnego standardowego ludzkiego normolipidemicznego osocza/surowicy w organizmie. Całkowita objętość na odwiert dla testu wynosi 150 μL. UWAGA: Procedura ta zapobiega krzyżowemu zanieczyszczeniu osocza/surowicy LC-CSH, ponieważ są one podawane po przeciwnych stronach studni.</li>
		<li>Szczelnie uszczelnij płytkę folią klejącą. Inkubuj szczelną płytę z 96 dołkami w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 1200 obr./min w termomieszaczu. Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytkę z termomieszarki i umieść ją na lodzie. Wiruj płytę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (aby zatrzymać reakcję transferową) przy 935 g , aby rozpylić cząstki dawcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gotowe do użycia tablice LC-CSH<ol>
		<li>Do użytku rozmroz mrożone talerze gotowe do użycia (patrz kroki 1.4.1-1.4.2 dla przygotowania talerzy) na zimno (4 °C do 10 °C) przez 2 godziny (lub noc, jeśli to konieczne). Wirówka przez 2 minuty w temperaturze 4 °C przy 935 × g , aby zebrać cały materiał (125 μL) razem. Ostrożnie usuń folię klejącą, aby nie rozpryskać zawartości dołków.</li>
		<li>Podaj 25 μL próbek osocza/surowicy z soli fizjologicznej i referencyjnego osocza ludzkiego w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków (Rysunek 1) na płytce gotowej do użycia, na lodzie, i zapieczętuj folią klejącą. Inkubuj szczelny 96-dołek w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 1200 obr./min w termomieszaczu. Wyjmij płytę z termomieszacza i włóż do lodu. Wiruj płytę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (aby zatrzymać reakcję transferową) przy 935 × g (aby rozpylić cząstki dawcy).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Podawanie odczynników do studni bez zanieczyszczenia krzyżowego. Podawaj osocze/surowicę i LC-CSH na przeciwległe ściany dołków. Zanieczyszczenie krzyżowe minimalizuje się, jeśli płytka zostanie obrócona o 180° po pierwszym wydaniu LC-CSH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
3. Pomiar fluorescencyjnego wypływu fosfolipidów do osocza/surowicy HDL
<ol>
	<li>Przejście na czarną płytę i pomiar fluorescencji<ol>
		<li>Ostrożnie usuń warstwę klejącą, aby nie ruszyć granulki LC-CSH. UWAGA: Jeśli wystąpi przerwanie granulek, ponownie wiruj.</li>
		<li>Przelej 50 μL supernatantu z 96-dołowej płyty reakcyjnej do wgłębień 96-dołkowej czarnej płyty polistyrenowej o płaskim dnie do pomiarów fluorescencji. Użyj pipety wielokomorowej. UWAGA: Nie zasysaj LC-CSH. Jeśli tak się stanie, wstrzyknij z powrotem do studni i ponownie wiruj.</li>
		<li>Napełnij zbiornik zwykłą solą fizjologiczną. Dodaj 50 μL soli fizjologicznej do każdego dołka za pomocą pipety wielodołkowej.</li>
		<li>Przygotuj 1% TX-100, dodając 90 mL wody destylowanej do 10 mL roztworu zapasowego Triton X-100 10% w plastikowej kolbie Erlenmeyer o pojemności 125 mL. Napełnij zbiornik 1% Triton-X 100.</li>
		<li>Dodaj 100 μL 1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej do każdego dołka i wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy w górę i w dół za pomocą pipety wielodołkowej. Unikaj tworzenia bąbelków. Przebij pęcherzyki powietrzem z pipety transferowej 3 mL.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję lissaminerhodaminy fluorimetrem (wzbudzenie 540 nm / emisja 600 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie wypływu %PE<ol>
		<li>Obliczenie wypływu PE<ol>
			<li>%PE wydzielanie = ([całkowity supernatant w osocze lub surowicy grypy - supernatant NC FLU]/całkowita grypa)) × 100 FLU = jednostki fluorescencyjne; NC = kontrola negatywna. Ponieważ do pomiaru fluorescencji na dołek używa się tylko 50 μL z 150 μL mieszaniny reakcji supernatantowej, należy to skorygować w następujący sposób:</li>
			<li>Całkowity supernatant GRYPA/studnia = Zmierzony poziom GRYPY 50 μL (płytka) × 3</li>
			<li>Całkowita GRYPA na 150 μL mieszaninę/dołek reakcji = Całkowita GRYPA emitowana przez 50 μL LC-CSH. UWAGA: Fluorescencja LC-CSH oblicza się zgodnie z opisaniem poniżej (krok 4.2.5).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Znormalizowane obliczenia wypływu %PE<ol>
			<li>Użyj znormalizowanego wypływu %PE do korekty różnic między testami wykonywanymi w różnych warunkach (np. eksperymenty przeprowadzone w różne dni, różnice w partiach).</li>
			<li>Użyj tego wzoru do obliczenia znormalizowanego %PE efflux: Normalizowany %PE Efflux = Próbka supernatantu %PE efflux value (FLU)/dodatnia referencyjna kontrola supernatant %PE efflux FLU value.</li>
			<li>Użyj identycznego zgromadzonego osocza ludzkiego od zdrowych dawców z prawidłowym profilem lipidowym jako kontroli referencyjnej. Nie ma potrzeby obliczania całkowitej ilości FLU/studni nadmiaru, ponieważ ta wartość jest taka sama zarówno dla próbki, jak i dla źródła.</li>
			<li>Dla próbek potrójnych wklej surowe dane uzyskane w kroku 3.1.6 do arkusza kalkulacyjnego (Tabela Uzupełniająca 1). W przypadku próbek duplikatów wklej surowe dane uzyskane w kroku 3.1.6 do arkusza kalkulacyjnego (Tabela Uzupełniająca 2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Krzywa standardowa LC-CSH
UWAGA: Krzywa standardowa LC-CSH służy do obliczania ilości sygnału fluorescencyjnego PE obecnego w aliquotach LC-CSH na odwiert. Zazwyczaj stosuje się 50 μL LC-CSH/dołek. Ta wartość może być użyta do obliczenia %PE wypływu do HDL w próbce znormalizowanej do całkowitej GRYP (patrz krok 3.2.1) obecnej w mieszance reakcji.
%PE efflux = ((jednostki fluorescencji supernatantu [GRYPA] - nadmiarnik z soli fizjologicznej FLU)/(całkowity LC-CSH FLU)) x 100.
<ol>
	<li>Szeregowe rozcieńczenie LC-CSH<ol>
		<li>Przygotuj 10-krotnie i 100-krotnie rozcieńczone zapasy stockowego LC-CSH (zgodnie z krokami 1.1.1-1.3.3): 10-krotne rozcieńczenie: 100 μL LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100 100-krotne rozcieńczenie: 100 μL 10-krotnie rozcieńczonego LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100</li>
		<li>Podawaj potrójne próbki 10- i 100-krotnie rozcieńczonego LC-CSH do płytki inkubacyjnej z 96 dołkami dla krzywej standardowej (patrz Rysunek 3).</li>
		<li>Dodaj wystarczającą objętość 1% Triton X-100 do odwiertów zawierających LC-CSH, aby uzyskać końcową objętość 200 μL (patrz Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuszczalność LC-CSH do pomiaru fluorescencji<ol>
		<li>Uszczelnij płytę folią klejącą i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 24 °C, potrząsając przy 1200 obr./min. Płyta wirówkowa przez 2 minuty w temperaturze 4 °C przy 935 × g. Ostrożnie usuń taśmę klejącą.</li>
		<li>Używając pipety wielowarstwowej, mieszaj próbki pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Przelej 100 μL LC-CSH na dołek na 96-dołkowy polistyren płytę płaskiego do pomiarów fluorescencji, używając pipety wielodołkowej.</li>
		<li>Do każdej studni dodaj 100 μL o stężeniu 1% Triton-X w temperaturze pokojowej, używając pipety wielowarstwowej. Mieszaj, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję fluorimetrem (wzbudzenie 540 nm/emisja 600 nm).</li>
		<li>Wklej wartości fluorescencji zmierzone za pomocą fluorimetru do szablonu analizy regresji liniowej w Tabeli Uzupełniającej 1 , zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 3. Końcowe stężenia LC-CSH na standardowej płycie pomiarowej krzywej przedstawiono w Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Tablica dla krzywej standardowej LC-CSH. Seryjnie rozcieńczony LRh-PE-oznaczony LC-CSH jest podawany do płytki z 96 dołkami, jak pokazano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>10 razy rozcieńczone</td>
			<td>100-krotnie rozcieńczone</td>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Razem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>Detergent</td>
			<td>Volumy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μL/well)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
			<td>175</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25</td>
			<td>0</td>
			<td>25</td>
			<td>175</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętości odczynników dodawanych do studni płyty inkubacyjnej dla standardowej krzywej LC-CSH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rozpuszczalność</td>
			<td>Sól fizjologiczna</td>
			<td>Razem</td>
			<td>Dodano</td>
			<td>Mierzone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>Volumy</td>
			<td>Volumy</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL/well)</td>
			<td>(μL/well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Objętości odczynników dodawanych do studni płytki pomiarowej dla krzywej standardowej LC-CSH.

<ol><li>Grundy, S. M., et al. 2018 AHA/ACC/AACVPR/AAPA/ABC/ACPM/ADA/AGS/APHA/ASPC/NLA/PCNA guideline on the management of blood cholesterol: A report of the american college of cardiology/american heart association task force on clinical practice guidelines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrundy%2C+SM+%22Circulation%22">Circulation</a>. 139 (25), e1082-e1143 (2019).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+coronary+heart+disease+in+Japanese-American+men+with+mutation+in+the+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+despite+increased+HDL+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels.</a> J Clin Invest. 97 (12), 2917-2923 (1996).</li>
<li>Madsen, C. M., Varbo, A., Nordestgaard, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+high+high-density+lipoprotein+cholesterol+is+paradoxically+associated+with+high+mortality+in+men+and+women%3A+Two+prospective+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Extreme high high-density lipoprotein cholesterol is paradoxically associated with high mortality in men and women: Two prospective cohort studies.</a> Eur Heart J. 38 (32), 2478-2486 (2017).</li>
<li>Ko, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+cholesterol+and+cause-specific+mortality+in+individuals+without+previous+cardiovascular+conditions%3A+The+CANHEART+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein cholesterol and cause-specific mortality in individuals without previous cardiovascular conditions: The CANHEART study.</a> J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2073-2083 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity+is+an+independent+predictor+of+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+patients+with+coronary+artery+disease%3A+A+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity is an independent predictor of all-cause and cardiovascular mortality in patients with coronary artery disease: A prospective cohort study.</a> Atherosclerosis. 249, 116-124 (2016).</li>
<li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+HDL+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional HDL and atherosclerotic cardiovascular disease.</a> Nat Rev Cardiol. 13 (1), 48-60 (2016).</li>
<li>Khera, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+cholesterol+efflux+capacity+and+incident+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">HDL cholesterol efflux capacity and incident cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+assay+for+ABCA1-mediated+cholesterol+efflux+using+bodipy-cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A sensitive assay for ABCA1-mediated cholesterol efflux using bodipy-cholesterol.</a> Journal of Lipid Research. 52 (12), 2332-2340 (2011).</li>
<li>Schachtl-Riess, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+reagents%2C+cell+numbers%2C+and+calculation+method+influence+high-throughput+measurement+of+HDL-mediated+cholesterol+efflux+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lysis reagents, cell numbers, and calculation method influence high-throughput measurement of HDL-mediated cholesterol efflux capacity.</a> J Lipid Res. 62, 100125(2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+uptake+capacity%3A+A+new+measure+of+HDL+functionality+for+coronary+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol uptake capacity: A new measure of HDL functionality for coronary risk assessment.</a> J Appl Lab Med. 2 (2), 186-200 (2017).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+application+of+a+novel+cholesterol+efflux+assay+using+immobilized+liposomes+as+a+substitute+for+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Validation and application of a novel cholesterol efflux assay using immobilized liposomes as a substitute for cultured cells.</a> Biosci Rep. 38 (2), BSR20180144(2018).</li>
<li>Lorkowski, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+fluorescent+assay+for+HDL+function%3A+Low+apolipoprotein+a1+exchange+rate+associated+with+increased+incident+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free fluorescent assay for HDL function: Low apolipoprotein a1 exchange rate associated with increased incident cardiovascular events.</a> J Appl Lab Med. 5 (3), 544-557 (2020).</li>
<li>Denimal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+%27good+cholesterol%27+for+cardiovascular+risk+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22QJM%3A+An+Int+J+Med%22%5BJournal%5D)">Rethinking 'good cholesterol' for cardiovascular risk stratification.</a> QJM: An Int J Med. 117 (4), 243-245 (2023).</li>
<li>Borja, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-apolipoprotein+A-I+exchange+is+independently+associated+with+cholesterol+efflux+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">HDL-apolipoprotein A-I exchange is independently associated with cholesterol efflux capacity.</a> J Lipid Res. 56 (10), 2002-2009 (2015).</li>
<li>Borja, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-apoa-I+exchange%3A+Rapid+detection+and+association+with+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDL-apoa-I exchange: Rapid detection and association with atherosclerosis.</a> PLoS One. 8 (8), e71541(2013).</li>
<li>Remaley, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+specificity+for+lipid+efflux+by+the+human+ABCAI+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein specificity for lipid efflux by the human ABCAI transporter.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (3), 818-823 (2001).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free%2C+high-density+lipoprotein-specific+phospholipid+efflux+assay+predicts+incident+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell-free, high-density lipoprotein-specific phospholipid efflux assay predicts incident cardiovascular disease.</a> J Clin Invest. 133 (18), e165370(2023).</li>
<li>Neufeld, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoA-I-mediated+lipoprotein+remodeling+monitored+with+a+fluorescent+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">ApoA-I-mediated lipoprotein remodeling monitored with a fluorescent phospholipid.</a> Biology (Basel). 8 (3), 53(2019).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> J Lipid Res. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cellular+cholesterol+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cellular cholesterol efflux.</a> J Biol Chem. 289 (35), 24020-24029 (2014).</li>
<li>Oram, J. F., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-mediated+removal+of+cellular+cholesterol+and+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-mediated removal of cellular cholesterol and phospholipids.</a> J Lipid Res. 37 (12), 2473-2491 (1996).</li>
<li>Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+ABCA1+a+lipid+transfer+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Is ABCA1 a lipid transfer protein.</a> Journal of Lipid Research. 59 (5), 749-763 (2018).</li>
<li>Smith, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abca1+mediates+concurrent+cholesterol+and+phospholipid+efflux+to+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Abca1 mediates concurrent cholesterol and phospholipid efflux to apolipoprotein A-I.</a> J Lipid Res. 45 (4), 635-644 (2004).</li>
<li>Ossoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+X+causes+renal+disease+in+LCAT+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein X causes renal disease in LCAT deficiency.</a> PLoS One. 11 (2), e0150083(2016).</li>
<li>Martínez-Beamonte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extra+virgin+olive+oil+high+in+bioactive+compounds+on+atherosclerosis+in+apoe-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of extra virgin olive oil high in bioactive compounds on atherosclerosis in apoe-deficient mice.</a> Mol Nutr Food Res. , (2025).</li>
</ol>

PATENTY: US20220178953A1; WO2020185598A1 (E.B.N., M.S., A.T.R.)
Masaki Sato jest zatrudniony przez Eiken Chemical Co., Ltd.

HDL-C jest kluczowym czynnikiem określającym ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD), a tym samym potrzebę stosowania leczenia obniżającego lipidy lub innych potencjalnych profilaktycznych metodleczenia 1. Funkcja HDL w komórkowym wypływie cholesterolu in vitro okazała się jeszcze lepszym predyktorem wystąpień chorób sercowo-naczyniowych niż HDL-C7. Niestety, ten test komórkowy nie nadaje się do konwersji na wysokoprzepustowy test laboratoryjny kliniczny do rutyno...

Badanie wysokogęstościowego lipoproteinowego specyficznego wydzielania fosfolipidów (HDL-SPE) mierzy funkcjonalność HDL i jest przeznaczone do zastosowań w badaniach biomedycznych oraz laboratoriach diagnostycznych klinicznych, aby (i) uzyskać dalsze informacje na temat mechanizmów leżących u podstaw usuwania lipidów z zmian miażdżycowych przez HDL, (ii) stanowić nową platformę do poprawy oceny ryzyka chorób układu krążenia oraz (iii) opracować nowe terapie do leczenia chorób sercowo-naczyniowych.
HDL-cholesterol (HDL-C) jest ważnym czynnikiem determinującym ryzyko CVD1, jednak jego użyteczność jest ograniczona, ponieważ podwyższone poziomy HDL-C (>80 mg/dL) wiążą się ze zwiększonym ryzykiem CVD 2,3,4,5. Podwyższone poziomy HDL-C mogą oznaczać nagromadzenie dysfunkcyjnego HDL, które ma zmniejszoną zdolność do usuwanialipidów płytki miażdżycowej w tętnicach.
Test zdolności wypływu cholesterolu komórkowego (CEC) był pierwszym testem in vitro opracowanym do pomiaru funkcjonalności HDL. W tym testie hodowlowane makrofagi (mysie lub ludzie), zazwyczaj oznaczane 3 H- lub fluorescencyjnym Bodipy-cholesterolem, są inkubowane z osoczem lub surowicą uszczuploną apoB. Procent wypływu cholesterolu oblicza się na podstawie ilości fluorescencji/radioaktywności powiązanej z komórkami i medium, 7,8,9. Test CEC okazał się lepszym predyktorem incydentu CVD niż HDL-C7. Test CEC nie nadaje się do przekształcenia w rutynowy test diagnostyczny kliniczny, głównie ze względu na wymagania dotyczące hodowli komórkowej i długiego czasu trwania (np. dni). Ponadto test CEC jest ograniczony przez swoją wrodzoną zmienność (np. różne typy komórek, techniki znakowania oraz zubożenie lipoproteiny β, co wpływa na skład HDL10).
Kilka grup badawczych opracowało testy wypływu cholesterolu HDL bez komórek, które służą jako narzędzia do zdobywania nowych informacji o funkcjonowaniu HDL oraz potencjalnego przekształcenia w kliniczny test diagnostyczny w celu lepszej oceny ryzyka CVD11,12. Te testy wypływu zazwyczaj obejmują wiele etapów i wykorzystują cząstkę dawcy lipidów oznaczoną fluorescencyjnym cholesterolem, a podobnie jak test CEC, wymagają albo zużycia lipoprotein β, albo alternatywnie wychwytu cząstek zawierających apoA-I za pomocą przeciwciał anty-apoA-I, aby zmierzyć wypływ cholesterolu HDL w osoczu. Chociaż te alternatywne testy zostały potwierdzone jako powiązane w różnym stopniu z ryzykiem CVD, do tej pory tylko jeden13, oceniający kurs wymiany apoA-I, przewiduje ryzyko Incydentu CVD14. Co ciekawe, kinetyka wymiany apoA-I w osocze i poza nią wykazała niezależne powiązanie z CEC15 i znacznie zmniejszoną u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym16. Ponadto wykazano, że kilka wymiennych apolipoproteinów HDL pośredniczy zarówno w cholesterolu, jak i fosfolipidach z komórek ekspresujących ABCA1 in vitro17.
Opracowaliśmy alternatywne podejście do oceny funkcjonalności HDL18. Prosty, szybki i wiarygodny test opisany tutaj wymaga tylko dwóch składników, mianowicie całych próbek osocza (lub zwierzęcia) lub surowicy (świeżej lub zamrożonej przez rozmrażenie) oraz fluorescencyjnej cząstki dawcy pokrytej lipidami. Test mierzy zdolność apoA-I i innych wymiennych apolipoprotein związanych z HDL w całym osoczu/surowicy do usuwania niewymiennej, grupowo oznaczonej głową fluorescencyjnej fosfatydylethanolaminy (PE) z cząstki dawcy18 pokrytej lipidami (Rysunek 1).
Cząstki dawcy w tym badaniu to kryształy hydratu krzemianu wapnia (CSH) pokryte cholesterolem, fosfolipid fosfatydylocholina (PC) oraz fluorescencja PE. Wymienne apolipoproteiny związane z HDL, głównie apoA-I, uwalniane z cząstek HDL, wiążą się z cząstkami dawcy, a następnie dysocjują się wraz z lipidami cząstek dawcy, w tym fluorescencyjnym PE. W ten sposób HDL, ale nie inne lipoproteiny obecne w całym osoczu/surowicy, pobierają fluorescencyjną PE z cząstek dawcy 18,19. Całe osocze/surowica jest inkubowana z fluorescencyjnymi lipidami pokrytymi hydratami krzemianu wapnia (LC-CSH) oraz solą fizjologiczną w temperaturze 37 °C, z wstrząsaniem przez 1 godzinę. Ponieważ LC-CSH ma około dwukrotnie większą gęstość niż woda, cząstki dawcy są łatwo oddzielane od plazmy przez niskoprędkościową wirówkę.
Procent wypływu PE mierzony w badaniach klinicznych jest zazwyczaj normalizowany przez podzielenie wartości fluorescencji PE nabytej przez HDL w supernatancie mieszaniny reakcji próbki klinicznej przez wartość uzyskaną przez HDL w referencyjnym osoczu kontrolowanym w ludzkim osoczu. Normalizacja do osady referencyjnej jest przeprowadzana w celu skorygowania zmian w przygotowaniu odczynników. W zastosowaniach badawczych % wypływu PE można określić, obliczając fluorescencję supernatantu PE podzieloną przez całkowitą fluorescencję (fluorescencja supernatantów PE + fluorescencja LC-CSH). Wartości pomiarów fluorescencyjnego supernatantu są wklejane do szablonu w plikach arkuszy kalkulacyjnych w celu obliczenia %PE Efflux (Tabela Uzupełniająca 1 dla potrójnych pomiarów oraz Tabela Uzupełniająca 2 dla pomiarów duplikacyjnych). Instrukcje dotyczące wykonywania tych obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym są przedstawione jako pliki uzupełniające (Plik Uzupełniający 1, Plik Uzupełniający 2, Plik Uzupełniający 3, Plik Uzupełniający 4, Plik Uzupełniający 5, Plik Uzupełniający 6, Plik Uzupełniający 7 oraz Plik Uzupełniający 8), a przykładowe obliczenia przedstawiono jako Tabela Uzupełniająca 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Test HDL-SPE. Specyficzne dla HDL wydzielanie fosfolipidów jest badane w płytkach z 96 dołkami. Słone i kryształy hydratów krzemianu wapnia (szare) pokryte lipidami (LC-CSH), w tym niewymienialne lissaminerhodaminowe markerowane fosfatydylethanolaminą (LRh-PE; czerwone warstwy błonowe) oraz do 30 całych próbek osocza/surowicy (żółte; w trzech egzemplarzach) są ładowane na płytki 96-dołkowe. Po mieszaniu przez godzinę w temperaturze 37 °C w termomieszaczu, płytki są krótko wirowane, aby rozpylić cząstki dawcy LC-CSH. Alikwoty supernatantów, zawierające HDL oznaczone specjalnie LRh-PE, są przenoszone na czarną płytkę zawierającą detergent (rozpuszczający Lh-Rh-PE) oraz sól fizjologiczną. Następnie fluorescencja PE jest mierzona fluorimetrem. Sól fizjologiczna (kontrola negatywna; NC), do korekcji tła oraz zebrane zdrowe ludzkie osocze (kontrola pozytywna; PC) do normalizacji płytek, są ładowane zamiast próbki plazmy/surowicy w ostatnim zestawie dołków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyryztoyl-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Research</td><td>850345</td><td>14:0 PC (DMPC) Rozpuszczalność chloroformu</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa)</td><td>Avanti Research</td><td>810150-C</td><td>Roztwór chloroformu LRh-PE</td></tr><tr><td>Folia klejąca</td><td>Biosystemy stosowane&nbsp;</td><td>4306311</td><td>MicroAmp przezroczysta folia klejąca &nbsp;</td></tr><tr><td>Bay Corporation Taśma Teflonowa o wysokiej gęstości 1/2 cala x 520</td><td>Rozwiązania do testów medycznych</td><td>86732</td><td></td></tr><tr><td>Rurki ze szkła borokrzemowego 20 mm i ostre; 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Seria Sorvall X Pro</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>odpowiedni do HPLC i ge; 99.8%</td></tr><tr><td>Proszek cholesterolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td>3&beta;-Hydroksy-5-cholesten, 5-Cholesten-3&beta;-ol</td></tr><tr><td>Papier wagowy szklinowy</td><td>Cole-Palmer</td><td>&nbsp; UX-01338-02</td><td>Do obsługi LC-CSH</td></tr><tr><td>Płytka inkubacyjna</td><td>USA Scientific &nbsp;</td><td>1402-9700</td><td>TempPlate 96 well pół skirt 0,2mL płyty PCR &nbsp;</td></tr><tr><td>Środek usuwający lipidy (LRA)</td><td>Supelco</td><td>13358-U</td><td>LC-CSH</td></tr><tr><td>Tablica pomiarowa</td><td>Greiner bio-one&nbsp;</td><td>655076</td><td>Mikropłytka, PS, 96-dołek, F-DNO (STUDNIA KOMINA),; FLUOTRAC, WIĄZANIE MEDYCZNE</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft 365 MSO&nbsp;</td><td>Wersja 2507</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki MultiFlex Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-550-206</td><td>Dla aspirującego supernatantu podczas płukania LC-CSH</td></tr><tr><td>Czytnik płyt wieloznacznych</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>1420-050</td><td>Victor3 Wallac1420 Licznik Multilabel</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Jakość biologii i innych źródeł;</td><td>114-055-101</td><td>Do wielokrotnego zastosowania &nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cole-Palmer</td><td>HS23452</td><td>Aby zakryć szklaną górę rury podczas wirowania</td></tr><tr><td>Flaszki Erlenmeyera z polikabonami</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-041-8</td><td>Dla 10% roztworu Triton-X</td></tr><tr><td>Zgromadzone osocze ludzkie (krew) Heparyna Li</td><td>Innovative Research Inc</td><td>IPLAWBLIH</td><td>Osocza referencyjna, kontrola dodatnia (PC) &nbsp;</td></tr><tr><td>Surfact-Amps X 100&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>10% Triton X-100, rozcieńczony 10x wodą destylowaną</td></tr><tr><td>Termomieszarka</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>Termomikser C z termoblokiem 96-dołkowym</td></tr><tr><td>Smartblock termomiksera</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td>SmartBlock z 96 studni</td></tr><tr><td>Pipety transferowe (3 mL, Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9CM</td><td>Do usuwania bąbelków z górnej części studni</td></tr><tr><td>Mieszacz wirowy</td><td>Daigger</td><td>3030A</td><td>Uchwyt na szklaną rurkę na górze</td></tr></tbody></table>

testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

High-Density Lipoprotein-Specific Phospholipid Efflux Assay

Poziomy lipoproteiny HDL-cholesterolu (HDL) (HDL-C) w osoczu są obecnie kluczowym wskaźnikiem klinicznej oceny ryzyka chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Usuwanie lipidów płytki nazębnej z komórek oraz osadów zewnątrzkomórkowych w ścianie tętnicy za pomocą HDL jest jedną z kilku funkcji antyaterogetycznych HDL, które mogą tłumaczyć jego odwrotny związek z ryzykiem chorób CVD. Usuwanie cholesterolu komórkowego in vitro za pomocą HDL okazało się ostatnio jeszcze lepszym predyktorem ryzyka chorób układowych niż HDL-C.
HDL składa się z niejednorodnej populacji cząstek, które pełnią różne funkcje. Cząstki HDL zaangażowane w usuwanie miażdżycowych lipidów płytki nazębnej zawierają wymienne apolipoproteiny, głównie apolipoproteiny A-I, które dysocjują się od cząstki, a następnie usuwają lipidy płytki nazębnej. Początkujący HDL powstaje w wyniku rozpuszczania i usuwania zarówno fosfolipidów, jak i cholesterolu z domen komórkowych błony komórkowej generowanych przez ABCA1 za pomocą wymiennych apolipoprotein pochodzących z HDL. Proces ten odgrywa kluczową rolę zarówno w zapobieganiu, jak i regresi blaszki miażdżycowej.
Tutaj opisujemy protokół dla testu fosfolipidowego wypływu bezkomórkowego, specyficznego dla HDL (HDL-SPE), który wcześniej wykazaliśmy jako zdolność do przewidywania ryzyka wystąpienia CVD. Ten test konkretnie mierzy usuwanie niewymiennego fluorescencyjnego fosfolipidu z cząstki lipidu za pomocą apolipoproteiny HDL. Nasze badania kliniczne przypadków i kontrol wykazały, że test HDL-SPE działa tak dobrze, a potencjalnie nawet lepiej niż "złoty standard" testu zdolności wypływu cholesterolu opartego na komórkach, który jest żmudnym i technicznie złożonym testem, który często wykorzystuje radioaktywny cholesterol. 
Celem tego protokołu jest umożliwienie zarówno badaczom podstawowym, jak i klinicznym oceny funkcjonalności HDL w mobilizacji lipidów, za pomocą prostego, standaryzowanego, wolnego od komórek i wysokoprzepustowego testu. Test ten może być wykorzystywany przez podstawowych naukowców do uzyskania informacji o mechanizmach leżących u podstaw wydzielania lipidów podleganych HDL oraz do badania nowych leków terapeutycznych poprawiających funkcjonalność HDL. HDL-SPE może również służyć jako kliniczny test diagnostyczny laboratoryjny do oceny ryzyka CVD.

Metody analityczne
Jak wspomniano powyżej, analizy próbek HDL-SPE mogą być modyfikowane do różnych zastosowań, co pokazano poniżej. Przed przeprowadzeniem badań na próbkach badawczych najpierw przeprowadza się walidację krzywej standardowej, powtarzalność oraz testy stężenia w osoczu, aby opanować wymagane techniki. Po pierwsze, przeprowadzić analizę krzywej standardowej LC-CSH w celu oceny jakości preparatów LC-CSH. Następnie wykonaj test powtarzalności. Na koniec należy wyko...

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Plasma levels of high-density lipoprotein (HDL)-cholesterol (HDL-C) is currently a key metric for the clinical assessment of cardiovascular disease (CVD) ...

Opracowaliśmy test zastępczy do pomiaru usuwania lipidów płytki wieńcowej w arteriach wieńcowych za pomocą HDL, aby ocenić ryzyko choroby wieńcowej. Obecnym wyzwaniem jest opracowanie prostego, szybkiego i solidnego testu napływu lipidów HDL zarówno do badań klinicznych, jak i klinicznych. Na początek dodaj całą potrzebną zawartość do szklanki pod chemicznym okapem i krótko rozwiń mieszankę lipidów, aby wymieszać roztwory.Susz mieszankę w szklanej rurce pod delikatnym strumieniem azotu przez godzinę, aby utworzyć suchą warstwę lipidową na dnie rurki. Aby pokryć hydrat krzemianu wapnia, włóż stożek z papieru wagowego do szklanej rurki zawierającej wysuszone lipidy i dodaj 80 miligramów hydratu krzemianu wapnia do rurki, używając stożka do skierowania proszku do podstawy. Natychmiast dodaj 2 mililitry soli fizjologicznej do probówki i przykryj wierzch parafilmem.Ręcznie przekłucaj szklaną rurkę, aby usunąć większość lipidów z dna. Szklaną rurkę umieść w otworze wykonanym w platformie styropianowej przymocowanej do wiru i przymocuj rurkę do platformy wirującej za pomocą wzmocnionej taśmy. Przeszukaj szklaną rurkę przez 10 minut i popewnij, że na ściance nie pozostał żaden lipid.Przenieś zawartość szklanej rurki do stożkowej rurki plastikowej o pojemności 15 mililitrów za pomocą pipety o średnicy 1 mililitra. Przemyj szklaną tubkę 3 mililitrami soli fizjologicznej i przelej ją do tej samej probówki 15-mililitrowej. Następnie umieść plastikową rurkę o pojemności 15 mililitrów zawierającą lipidowo-pokryty hydrat krzemianu wapnia do wirówki i obróć w temperaturze 935G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Użyj długiej i cienkiej końcówki pipety, aby zasysać supernatant. Zaczynając od góry supernatantu, powoli przesuwaj końcówkę pipety wzdłuż boku rurki, aspirując. Podczas aspiracji lekko przechyl rurkę i pozostawij około 200 mikrolitrów soli fizjologicznej nad pelletem, aby jej nie zakłócać.Następnie dodaj sól fizjologiczną, aby całkowita objętość wyniosła 5 mililitrów. Powtórz wirowanie i usunięcie supernatantu cztery razy. Po końcowym płukaniu dodaj sól fizjologiczną, aby uzyskać całkowitą objętość do 2,5 mililitra. Pipette 75 mikrolitrów soli fizjologicznej do każdego dołku płytki o objętości 0,3 mililitra z 96 dołkami, zgodnie z liczbą dołków potrzebnych do zestawu próbek.Vortex, plastikową rurkę 15-milimetrową zawierającą LC-CSH trzy razy po 10 sekund każda. Używając pipety z jednym dołkiem, wydaj 50 mikrolitrów LC-CSH po prawej stronie dołków zawierających sól fizjologiczną. Po trzech dołkach powtórz protokół wirowania przed wlewem do kolejnych trzech dołków.Obróć płytę z 96 odwiertami o 180 stopni, tak aby lewa strona odwiertu była teraz przesunięta w prawo. Pipeta 25 mikrolitrów próbek osocza lub surowicy wzdłuż prawej strony każdego dołku. Dla dołków z dodatnim kontrolowaniem należy dodać 25 mikrolitrów referencyjnego standardowego ludzkiego osocza lipidemicznego lub surowicy o normie.Następnie szczelnie uszczelnij płytę z 96 dołkami folią klejącą i inkubuj ją w ciemności przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1 200 obrotów na minutę w termomieszaczu. Po inkubacji wyjmij płytkę z termomiesza i umieść ją na lodzie. Wiruj płytę przez dwie minuty w temperaturze 935G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpuścić cząstki dawcy i zatrzymać reakcję transferową.Teraz ostrożnie usuń folię klejową z płyty 96-dołkowej, nie naruszając granulki LC-CSH. Przelej 50 mikrolitrów supernatantu z płyty reakcyjnej do wgłębień czarnej płyty polistyrenowej z płaskim dnem z 96 dołkami za pomocą pipety wielodołkowej. Napełnij zbiornik zwykłą solą fizjologiczną i dodaj 50 mikrolitrów soli fizjologicznej do każdego otworu.Używając pipety wielokomorowej. Przygotuj 1% Triton X-100 w plastikowej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 milimetrów. Napełnij zbiornik przygotowanym 1% Tritonem X-100 i dodaj 100 mikrolitrów tego samego roztworu w temperaturze pokojowej do każdego odwiertu.Delikatnie wykręcaj pipetę w górę i w dół dwa do trzech razy za pomocą pipety wielowarstwowej i przebijaj pęcherzyki powietrza z pipety transferowej o średnicy 3 mililitrów. Na koniec zmierz fluorescencję lissaminy rodaminy za pomocą fluorometru z wzbudzeniem na 540 nanometrów i emisją na 600 nanometrach. Opracowano standardową krzywą za pomocą seryjnie rozcieńczonego LRHPE oznaczonego LC-CSH i wykazała wysoce liniową odpowiedź fluorescencyjną.W badaniu krzywej stężenia w osoczu rosnące objętości zgromadzonej ludzkiej plazmy były podawane w potrójnych dołkach obok kontroli soli fizjologicznej. Krzywa odpowiedzi dawki osocza wykazała doskonałą liniowość między PE, dopływem i objętością osocza, z silną korelacją w zakresie 15-35 mikrolitrów. Nasz prosty i szybki protokół, który przewiduje ryzyko wystąpienia chorób sercowo-naczyniowych, może być wykorzystywany zarówno w badaniach, jak i badaniach diagnostycznych.Nasze wyniki pokazują, że nasz test może wyjaśnić rolę zarówno komórkowych, jak i zewnętrznych lipidów płytki nazębnej w chorobach sercowo-naczyniowych.

high-density-lipoprotein-specific-phospholipid-efflux-assay

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Test oznaczania cholesterolu został opracowany w celu ilościowego określenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych oraz zdolności akceptorów plazmy do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Procedura obejmuje znakowanie komórek cholesterolem, wyrównanie poziomu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych oraz uwalnianie cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Test odpływu cholesterolu

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj metodę pomiaru funkcjonalności HDL w osoczu ludzkim do oceny ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Protokół ten umożliwia szybką analizę transportu lipidów w badaniach klinicznych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów