Name: Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj szybką identyfikację bakterii w produktach mlecznych za pomocą MALDI-TOF MS. Ta metoda łączy kulturomikę z ekstrakcją białek, zapewniając dokładne wyniki w krótszym czasie niż tradycyjne techniki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.S., M.Z. oraz P.P. są członkami Toruńskiego Centrum Doskonałości "W kierunku medycyny spersonalizowanej" działającego przy Inicjatywie Doskonałości-Uniwersytet Badawczy. Badania te zostały finansowo wsparte w ramach projektu LIDER zatytułowanego "Opracowanie metody przygotowawczej izolacji biologicznie aktywnej laktoferyny", DPWP/LIDER-XIII/6/2023, sfinansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Warszawa, Polska).

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja bakterii związanych z nabiałem
<ol>
	<li>Pozyskiwanie kultur bakteryjnych z płynnych lub stałych produktów mlecznych<ol>
		<li>Wybór mediów kulturowych<ol>
			<li>Do izolacji bakterii z próbek mlecznych należy wybrać podłoże hodowlane zgodnie z oczekiwanymi grupami mikroorganizmów, w tym ogólnym medium wzrostowym, podłożem dla bakterii Gram-ujemnych, bakterii kwasu mlekowego (LAB), bakterii tworzących zarodniki, a także wolno rosnących lub wybrednych mikroorganizmów. UWAGA: Aby zmaksymalizować odbudowę zarówno gatunków dominujących, jak i rzadkich, należy szczepić wiele ośrodków równolegle. Zestaw przykładowych podłoży do analizy mikrobiomu z próbek mlecznych przedstawiono w Tabeli 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inokulacja i powłoka<ol>
			<li>Pobierz reprezentatywną próbkę produktu mlecznego i dokładnie wymieszaj.</li>
			<li>Aseptycznie przenieś 1 mL (próbki ciekłe: mleko, śmietanka, maślanka) lub 1 g (próbki stałe: ser, masło) próbki do stożkowej wirówki o pojemności 15 mL zawierającej 9 ml sterylnego płynnego medium (woda peptonowa / 0,85% roztwór NaCl). W przypadku próbek stałych podgrzej ciekłe medium do 40-42 °C przed dodaniem próbki.</li>
			<li>Homogenizuj próbkę, intensywnie wirując przez 30-60 sekund. W przypadku próbek tłuszczowych lub twardych kontynuuj homogenizację, aż uzyska się równomierną zawiesinę.</li>
			<li>Przygotuj serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń, biorąc 1 mL zawiesiny i przelewając ją do kolejnych probówek zawierających 9 mL roztworu sterylnego. Dobrze wymieszaj każde rozcieńczenie. UWAGA: W zależności od rodzaju próbki i przewidywanego poziomu skażenia mikroorganizmów przygotuj rozcieńczenia w zakresie od 10-1 do 10-6. Dla większości próbek wystarczy rozcieńczenie do 10-3 ; Jednak przy analizie świeżego mleka lub sera pleśniowego konieczne będzie przygotowanie dalszych rozcieńczeń. Aby zapewnić dokładną izolację i ułatwić wybór kolonii, optymalna rozcieńczenie inokulacji powinno dawać od 30 do 300 kolonii na płytce. Ten zakres pozwala na wyraźne zróżnicowanie poszczególnych kolonii i minimalizuje ryzyko nakładania się wzrostu, ułatwiając uzyskanie nieskażonych i jednorodnych kultur bakteryjnych do późniejszej analizy. W przypadku niektórych przetworzonych produktów mlecznych (np. maślanki) do bezpośredniego podawania może być użyta nierozcieńczona świeża próbka (np. 0,1 mL).</li>
			<li>Pobierz 0,1 mL próbki lub jej rozcieńczenia i przełóż na powierzchnię wcześniej przygotowanych szalek Petriego zawierających odpowiednie medium agarowe.</li>
			<li>Równomiernie rozprowadzaj inokulum na powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozprowadzacza. Pozwól inokulum wchłonąć się do podłoża przez 15 minut, a potem odwróć płytki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja<ol>
			<li>Inkubacja tlenowa: dla wszystkich badanych próbek inokuluj płytki agarowe APT, M-17, CBL, MPCA i TSA, inkubuj w warunkach aerobowych w temperaturach 37 °C i 30 °C przez 24 godziny. Temperatury inkubacyjne były określane na podstawie optymalnych wymagań wzrostu różnych grup mikroorganizmów, kluczowych dla oceny zarówno jakości higienicznej (30 °C dla mezofilów ogólnych), jak i bezpieczeństwa zdrowia publicznego (37 °C dla patogenów powiązanych z człowiekiem i organizmów wskaźnikowych) produktów mlecznych. UWAGA: Jeśli spodziewany jest intensywny wzrost bakterii tworzących zarodniki, w przypadku TSA preferowany jest krótszy (~12 h) czas inkubacji.</li>
			<li>Inkubacja beztlenowa: dla wszystkich badanych próbek inokulować płytki MRS Agar, inkubować w warunkach beztlenowych w 37 °C i 30 °C przez 24-72 godziny, codziennie kontrolując wzrost mikroorganizmów. Temperatury inkubacji zostały określone zgodnie z krokiem 3.1. UWAGA: Warunki beztlenowej inkubacji można osiągnąć poprzez umieszczenie płytek w szczelnych pojemnikach z saszetkami generującymi atmosferę beztlenową, które eliminują tlen i zapewniają odpowiednią atmosferę dla wzrostu bakterii beztlenowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskanie czystych kultur<ol>
			<li>Po wysybaniu inspekcja płytek i wybieranie pojedynczych kolonii na podstawie ich cech morfologicznych (np. rozmiar, kształt, kolor, faktura).</li>
			<li>Oczyszcz wybrane kolonie poprzez subkulturę (rozmazywanie) na tym samym medium agarowym, używając pętli mikrobiologicznej o pojemności 1 μL i przy tych samych warunkach inkubacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium kulturowe</td>
			<td>Aplikacja</td>
			<td>Warunki hodowli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptyczny agar sojowy (TSA)</td>
			<td>Ogólne podłoże do hodowli szerokiego spektrum bakterii</td>
			<td>30–37 °C, 24–48 h, aerobowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar krwi (BLA; z 5% krwi owcy)</td>
			<td>wzbogacone, różnicowanie hemolizy, przydatne dla Streptococcus, Listeria, Bacillus</td>
			<td>30–37 °C, 24–48 h, aerobowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS agar (de Man, Rogosa i Sharpe agar)</td>
			<td>selektywne dla Lactobacillus i innych LAB Dodaj 1% Tween-80, aby wspierać wzrost L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus lub L. acidophilus.</td>
			<td>30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar M17</td>
			<td>selektywny dla Lactococcus, Streptococcus thermophilus</td>
			<td>30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APT agar (uniwersalny agar Tween 80)</td>
			<td>selektywny dla LAB i niektórych Bifidobacteria</td>
			<td>30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Scheadlera</td>
			<td>selektywne i wzbogacające, izolacja anaerobów, w tym Bifidobacterium, Clostridium</td>
			<td>30–37 °C, 48–72 h, beztlenowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar CBL (Chiński niebieski agar laktozowy)</td>
			<td>Nośnik różnicowy, dla bakterii koliformnych i innych bakterii fermentujących laktozę</td>
			<td>37 °C, 24–48 h, aerobowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk Plate Count Agar (MPCA)</td>
			<td>uniwersalne, dla całkowitej liczby bakterii mezofilnych tlenowych</td>
			<td>30–37 °C, 24–48 h, aerobowe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista sugerowanych podłoży do analizy mikrobiomu próbek mlecznych przy określonych warunkach hodowli.
2. Przygotowanie próbek bakteryjnych do analizy MS
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotuj rozwiązanie macierzy MALDI UWAGA: Najczęściej stosowanym związkiem matrycowym jest HCCA, α-cyjano-4-hydroksycynaminowy kwas cynynowy. Ten związek jest fotoczuły, więc przygotuj i przechowuj matrycę w ciemnych pojemnikach lub z dala od światła.<ol>
		<li>Przygotuj mieszankę rozpuszczalników w następujących proporcjach: 50% acetonitrylu (HPLC), 47,5% wody (HPLC) oraz 2,5% kwasu trifluoroctowego (TFA).</li>
		<li>Rozpuszcz matrycę w mieszance rozpuszczalnika do końcowego stężenia około 10 mg/mL (lub do nasycenia – aż nierozpuszczone kryształy pozostaną widoczne).</li>
		<li>Jeśli roztwór nie jest przezroczysty (kryształy pozostają), roztwór należy wirować lub filtrować (np. przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm), aby uzyskać przezroczystą ciecz. UWAGA: Przechowywanie w lodówce jest dozwolone przez krótki czas, pod warunkiem ograniczonej liczby cykli odmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zidentyfikować bakterie za pomocą SM, należy użyć jednej z trzech procedur przygotowania próbek:<ol>
		<li>Bezpośredni transfer kolonii – Stosuj tę najprostszą i najszybszą metodę w przypadku dobrze rosnących, nieopornych na lizę bakterii, takich jak większość bakterii Gram-ujemnych.<ol>
			<li>Za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki przenieś niewielką ilość (~1 μL) wyhodowanej kolonii na miejsce na płytce MALDI.</li>
			<li>Rozsmaruj materiał bakteryjny bezpośrednio na wyznaczonym miejscu na tarczy docelowej MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę.</li>
			<li>Po wyschnięciu nałóż na miejsce 1 μL roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstracja kwasem mrówkowym na celu – Zastosowanie dla trudno zidentyfikowanych bakterii (np. Gram-dodatnie, drożdże), których ściany komórkowe utrudniają uwalnianie białek bez dodatkowego przetwarzania.<ol>
			<li>Pobierz niewielką ilość biomasy bakteryjnej z jednej kolonii bakterii za pomocą jednorazowej pętli mikrobiologicznej lub sterylnej wykałaczki.</li>
			<li>Rozsmaruj materiał bakteryjny bezpośrednio na wyznaczonym miejscu na tarczy docelowej MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę.</li>
			<li>Nałóż na rozmazany materiał bakteryjny 1 μL roztworu 70% kwasu mrówkowego i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Po wyschnięciu nałóż na miejsce 1 μL roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstrakcja białka w tubce (metoda etanolowo-mrówkowa) – Stosuj tę metodę dla trudnych do zidentyfikowania mikroorganizmów, w tym niektórych bakterii Gram-dodatnich, drożdży i mykobakterii.<ol>
			<li>Za pomocą sterylnej pętli lub wymazu przenieś 1-3 kompletne kolonie z płytki hodowli agarowej do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 300 μL sterylnej wody.</li>
			<li>Dodaj 900 μL etanolu absolutnego, aby dostosować końcowe stężenie etanolu do około 75%. Wymieszaj lub zacznij przez kilka sekund.</li>
			<li>Wiruj próbkę przez 2 minuty w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa).</li>
			<li>Ostrożnie odrzucaj supernatant, nie naruszając granulki komórkowej. UWAGA: W przypadku szczepów śluzowych zaleca się dodatkowe wirowanie w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Zostaw rurkę z pelletem otwartą, aż cały resztkowy etanol wyparuje (5-10 minut, temperatura pokojowa).</li>
			<li>Dodaj 20-50 μL 70% kwasu mrówkowego (FA) do suszonego pelletu komórkowego. Mieszaj przez pipetowanie lub wirowanie, aż granulat zostanie całkowicie ponownie zawiesowany. UWAGA: Objętość powinna być proporcjonalna do ilości materiału biologicznego.</li>
			<li>Dodaj równą objętość acetonitrylu (ACN) do zawiesiny kwasu mrówkowego. Mieszaj ostrożnie.</li>
			<li>Wiruj w 15 000 x g przez 2 minuty (temperatura pokojowa).</li>
			<li>Przelej 1 μL supernatantu na wyznaczone miejsce na tarczy MALDI.</li>
			<li>Pozwól miejsca całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Nałóż na wysuszone miejsce próbki 1 μL roztworu matrycy α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA).</li>
			<li>Pozwól matrycy całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej przed analizą MS (Rysunek 1). UWAGA: 70% kwasu mrówkowego:; powoduje oparzenia. Uchwyt w okapie spalinowym. Acetonitryl: łatwopalny i toksyczny. Trzymaj się z dala od płomieni i unikaj wdychania/kontaktu. Kwas trójfluorooctowy (TFA): Silny, i lotny; Unikaj kontaktu skórnego/wzrokowego i wdechu. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne. Obchodz się wszystkimi odczynnikami w okapu, aby uniknąć wdychania. Unikaj kontaktu ze skórą i wzrokami; Pracuj z dala od otwartych ogniów. Zbieraj kwaśne i organiczne odpady rozpuszczalne w wyraźnie oznakowanych, kompatybilnych pojemnikach, aby prawidłowo się utylizować.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68993/68993fig1v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Drzewo decyzyjne wizualizujące proces wyboru odpowiedniej procedury przygotowania próbki do identyfikacji izolatów bakteryjnych za pomocą techniki MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68993/68993fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
3. Pozyskiwanie widm i identyfikacja mikroorganizmów z wykorzystaniem techniki MS
<ol>
	<li>Wzorcowanie UWAGA: Aby precyzyjnie wyznaczyć masę w MS, przed analizą nieznanych próbek należy skalibrować instrument według odpowiednich standardów. Prawidłowa kalibracja instrumentów jest kluczowa dla wiarygodnej identyfikacji.<ol>
		<li>Przygotować punkty kalibracyjne na płycie docelowej MALDI zawierające 1 μL: (a) Standardu Bakteryjnego (BTS), zawierającego ekstrakt Escherichia coli DH5 alfa, obejmującego zakres masowy od 3,6 do 17 kDa (dla MBT Biotyper); (b) Mikrobiologiczny kalibrator zawierający ekstrakt białkowy E. coli ATCC 25922, rybonukleazę i mioglobinę, obejmujący zakres masowy od 3,6 do 17 kDa (dla EXS2600 układu). Pozwól wyschnąć na powietrzu i nałożyć na wysuszone plamy kalibratora 1 μL roztworu matrycy HCCA, podobnie jak w przypadku przygotowania próbki.</li>
		<li>Załaduj do instrumentu płytę docelową MALDI zawierającą przygotowane próbki i punkty kalibrowe. Przeprowadź analizę plam kalibracji w trybie kalibracyjnym (automatycznym).</li>
		<li>Sprawdź kalibrację, aby upewnić się, że dokładność masy mieszczy się w akceptowalnych granicach w zakresie (100 ppm) w określonym zakresie mas (2-20 kDa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie widm UWAGA: Podczas kalibracji instrumentu pobierane są widma masowe z każdego przygotowanego miejsca próbki.<ol>
		<li>Ogólne parametry akwizycji<ol>
			<li>Spektrometr mas należy obsługiwać w liniowym trybie dodatnim jonów.</li>
			<li>Ustaw zakres detekcji masy od 2 000 do 20 000 m/z (2-20 kDa).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Używaj następujących ustawień specyficznych dla instrumentów<ol>
			<li>Napięcia źródła jonowego: źródło jonowe 1 (IS1) przy 20 kV, źródło jonowe 2 (IS2) przy 18 kV, napięcie obiektywu 9 kV. Napięcie przyspieszające może wynosić do 25 kV.</li>
			<li>Napięcie detektora: Ustawione na około 2,65 kV.</li>
			<li>Ustawienia ekstrakcji impulsowych jonów: 100 ns, opóźniony czas ekstrakcji stały na 230 ns.</li>
			<li>Ustawienia mocy lasera: dostosowywanie ręcznie, aby uzyskać najlepszą jakość widma (biorąc pod uwagę liczbę sygnałów i natężenie sygnału), zazwyczaj w zakresie od 40% do 65% minimalnej wymaganej mocy.</li>
			<li>Liczba strzałów na widmo: uzyskanie wystarczającej liczby strzałów laserowych z różnych obszarów każdego punktu, aby uzyskać sumę widma o dobrym stosunku sygnału do szumu (S/N)→ (a) średnio 200 strzałów, wykonanych w 50 krokach z 4 różnych obszarów każdego miejsca lub (b) akwizycja w 500 krokach strzału – 50 strzałów z dziesięciu różnych pozycji punktu docelowego w trybie AutoXecute.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Strategia pomiaru próbki<ol>
			<li>Mierz kilka punktów na izolat (co najmniej 2 punkty na izolat).</li>
			<li>Pobieraj widma w replikacji dla każdego miejsca, aby zapewnić spójność i dokładność wyników → pomiaru w duplikacie, dążąc do określonej liczby łącznych widm na próbkę (co najmniej 4 widma na próbkę co najmniej → replikacjach technicznych). UWAGA: Próbki biologiczne (co najmniej 3) poddane w celu uzyskania replikacji biologicznych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Identyfikacja mikroorganizmów i analiza danych
UWAGA: Identyfikacja organizmu odbywa się poprzez porównanie uzyskanego profilu białka (specyficznego białkowego "odcisku palca" mikroorganizmu) z bazą danych referencyjną, a uzyskana korelacja pozycji sygnału i intensywności służy do wygenerowania wartości dopasowania, która opisuje poziom pewności, z jakim badany organizm został dopasowany do odpowiadającego mu mikroorganizmu referencyjnego. Identyfikacja mikroorganizmów, porównując przetworzone widma z bazami referencyjnymi.
<ol>
	<li>Przetwarzanie widm<ol>
		<li>Używaj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania widm: (a) flexAnalysis dla systemów biotypowych MALDI lub (b) EX-Accuspec dla systemów EXS2600.</li>
		<li>Zastosuj metodę Savitzky'ego-Golaya jako algorytm wygładzania (szerokość 2 m/z, 10 cykli).</li>
		<li>Wykonaj korekcję bazową, aby usunąć szum tła za pomocą algorytmu TopHat (próg S/N = 2, szerokość filtra TopHat 0,2 Da ).</li>
		<li>Użyj trybu centroidu jako algorytmu wykrywania pików (próg S/N = 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównanie baz danych i interpretacja wyników<ol>
		<li>Przeładowanie przetworzonych widm mas nieznanych izolatów na platformę identyfikacji mikroorganizmów MALDI. Następnie sprawdź dokumenty. UWAGA: W tych badaniach użyto następującego oprogramowania: Biotyper wersja 4.1.100, Ex-Accuspec wersja V1. W przypadku oprogramowania MALDI Biotyper zaleca się tworzenie głównych widm (MSP) na podstawie surowych widm, aby zapewnić najlepszą niezawodność dopasowania.</li>
		<li>Oceń wyniki identyfikacji zgodnie z progami standardowymi producenta. UWAGA: Dla MALDI Biotyper i EXS2600 wartości punktowe to: 2,300-3,000: wysoce prawdopodobna identyfikacja gatunku; 2.000-2.299: pewna identyfikacja rodzaju, prawdopodobna identyfikacja gatunku; 1,700-1,999: prawdopodobna identyfikacja rodzaju; 0,000-1,699: niewiarygodna identyfikacja. Podczas oceny wyników identyfikacji uzyskanych z platformy wsparcia MALDI Biotyper wykorzystują Kategorie Spójności: A- Gatunek Spójny → najlepsze dopasowanie, a wszystkie pozostałe dopasowania o równie wysokiej wartości (>1,999) wskazują na ten sam gatunek; B - Zgodny rodzaj → najlepsze dopasowanie oraz inne dopasowania o podobnych wartościach (1,700 - 1,999) wskazują na ten sam rodzaj, ale mogą się różnić na poziomie gatunkowym; C- Brak spójności → wymagania dotyczące spójności gatunkowej lub rodzajowej nie zostały spełnione.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Savage, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+bacterial+identification+systems+for+species+identification+of+bacteria+isolated+from+bovine+mastitis+and+bulk+tank+milk+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+PathogDis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three bacterial identification systems for species identification of bacteria isolated from bovine mastitis and bulk tank milk samples.</a> Foodborne PathogDis. 14 (3), 177-187 (2017).</li>
<li>Holt, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolt%2C+JG+%22Bergey%27s+manual+of+determinative+bacteriology%22">Bergey's manual of determinative bacteriology</a>. , 9th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2000).</li>
<li>Franco-Duarte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+chemical+and+biological+methods+to+identify+microorganisms-from+past+to+present%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Advances in chemical and biological methods to identify microorganisms-from past to present.</a> Microorganisms. 7 (5), 130(2019).</li>
<li>Czeszewska-Rosiak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+usefulness+of+the+MALDI-TOF+MS+technique+in+the+determination+of+dairy+samples%27+microbial+composition%3A+Comparison+of+the+new+EXS+2600+system+with+MALDI+Biotyper+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The usefulness of the MALDI-TOF MS technique in the determination of dairy samples' microbial composition: Comparison of the new EXS 2600 system with MALDI Biotyper platform.</a> Arch. Microbiol. 206, 172(2024).</li>
<li>Wilson, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+agreement+among+biochemical+methods%2C+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%2C+and+16S+rRNA+sequencing+for+identification+of+microorganisms+isolated+from+bovine+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Test agreement among biochemical methods, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, and 16S rRNA sequencing for identification of microorganisms isolated from bovine milk.</a> J Clin Microbiol. 57 (3), e01381-e01418 (2019).</li>
<li>Barreiro, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+communication%3A+Identification+of+subclinical+cow+mastitis+pathogens+in+milk+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> J Dairy Sci. 93 (12), 5661-5667 (2010).</li>
<li>Vithanage, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-level+discrimination+of+psychrotrophic+pathogenic+and+spoilage+gram-negative+raw+milk+isolates+using+a+combined+MALDI-TOF+MS+proteomics-bioinformatics-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Species-level discrimination of psychrotrophic pathogenic and spoilage gram-negative raw milk isolates using a combined MALDI-TOF MS proteomics-bioinformatics-based approach.</a> J Proteome Res. 16 (6), 2188-2203 (2017).</li>
<li>Ashfaq, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+MS+for+identification+of+environmental+bacteria%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Manage%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF MS for identification of environmental bacteria: A review.</a> J Environ Manage. 305, 114359(2022).</li>
<li>Sugajski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sources+of+lactic+acid+bacteria+with+potential+antibacterial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New sources of lactic acid bacteria with potential antibacterial properties.</a> Arch Microbiol. 204 (349), 1-13 (2022).</li>
<li>Lagier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rebirth+of+culture+in+microbiology+through+the+example+of+culturomics+to+study+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota.</a> Clin Microbiol Rev. 28 (1), 237-264 (2015).</li>
<li>Złoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturomics+approach+to+identify+diabetic+foot+infection+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Culturomics approach to identify diabetic foot infection bacteria.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9574(2021).</li>
<li>Bilen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+culturomics+to+the+repertoire+of+isolated+human+bacterial+and+archaeal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The contribution of culturomics to the repertoire of isolated human bacterial and archaeal species.</a> Microbiome. 6 (94), 1-11 (2018).</li>
<li>Bourassa, L., Butler-Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+for+microorganism+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry for microorganism identification.</a> Method Microbiol. 42, 37-85 (2015).</li>
<li>Janiszewska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+sample+preparation+methods+on+the+MALDI-TOF+MS+identification+of+spore-forming+bacillus+species+from+food+samples%3A+A+closer+look+at+Bacillus+licheniformis%2C+Peribacillus+simplex%2C+Lysinibacillus+fusiformis%2C+Bacillus+flexus%2C+and+Bacillus+marisflavi%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Implications of sample preparation methods on the MALDI-TOF MS identification of spore-forming bacillus species from food samples: A closer look at Bacillus licheniformis, Peribacillus simplex, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus flexus, and Bacillus marisflavi.</a> ACS Omega. 8 (38), 34982-34994 (2023).</li>
<li>Valentine, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+microorganism+identification+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (1), 58-64 (2005).</li>
<li>Wragg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Biolog+GEN+III+MicroStation+semi-automated+bacterial+identification+system+with+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+and+16S+ribosomal+RNA+gene+sequencing+for+the+identification+of+bacteria+of+veterinary+interest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Biolog GEN III MicroStation semi-automated bacterial identification system with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and 16S ribosomal RNA gene sequencing for the identification of bacteria of veterinary interest.</a> J Microbiol Methods. 105, 16-21 (2014).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół poświęcony identyfikacji mikroorganizmów w produktach mlecznych stanowi istotny postęp w stosunku do tradycyjnych metod, zapewniając optymalny konsensus co do szybkości, niezawodności i opłacalności. Niemniej jednak niektóre kluczowe kroki w ramach protokołu wymagają szczególnej uwagi. Po pierwsze, faza izolacji i hodowli jest fundamentem. Podłoże hodowlane i warunki inkubacji muszą odpowiadać oczekiwanej różnorodności mikroorganizmów i obciążeniu. Uzyskanie czystych hodowli jest kluczowe, często wymagając subku...

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowej metodologii monitorowania bezpieczeństwa mikroorganizmów różnych produktów mlecznych, w tym masła, sera, mleka i śmietanki, poprzez wykorzystanie MS do profilowania bakteryjnego proteomicznego. To podejście, łączące nowoczesną kulturologię z zoptymalizowanymi procedurami przygotowywania próbek, ma być szybkim, niezawodnym i solidnym narzędziem dla laboratoriów bezpieczeństwa żywności i kontroli jakości. Uzasadnienie stworzenia i zastosowania tej metodologii wynika z ograniczeń standardowych metod identyfikacji mikroorganizmów. Przez wiele lat laboratoria weterynaryjne i diagnostyczne żywności polegały na konwencjonalnych testach biochemicznych badających wzrost i metabolizm bakterii na nośnikach różnicowych hodowli, a następnie wykonywano różne testy enzymatyczne1. Chociaż te metody, często oparte na standardowych wytycznych takich jak Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, są stosunkowo niedrogie i mogą dostarczać zarówno danych ilościowych, jak i jakościowych, są pracochłonne i czasochłonne, wymagają intensywnego przygotowania ośrodka, rozcieńczania próbki, powłokowania, inkubacji, liczenia kolonii, izolacji oraz szczegółowych kroków charakteryzacji 2,3.
Wprowadzenie komercyjnych systemów półautomatycznych i zautomatyzowanych, takich jak Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek i Biolog MicroPlates, usprawniło identyfikację mikroorganizmów za pomocą testów biochemicznych, zmniejszając tym samym koszty i czas realizacji. Jednak systemy te mają pewne wady, takie jak słaba powtarzalność, brak wpisów w odpowiednich bazach danych oraz trudności w określaniu zmienności fenotypowych między szczepami, szczególnie dla bakterii niefermentujących lub szczepów w obrębie gatunku o drobnych różnicach biochemicznych, co może prowadzić do błędnych wyników in vitro 4. W związku z tym SM rozwinęła się jako silna alternatywa, obecnie powszechna w mikrobiologii klinicznej i zyskująca na popularności w laboratoriach diagnostyki weterynaryjnej oraz kontroli jakości mleka. To podejście zostało uzupełnione przez szybkość, dokładność i opłacalność wykrywania kilku mikroorganizmów:1. Liczne badania wykazały, że SM zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację mikroorganizmów z mleka, dając szybsze i tańsze wyniki niż komercyjne systemy testów biochemicznych 5,6,7. Podczas gdy testy biochemiczne mogą wystarczyć do identyfikacji na poziomie rodzaju lub grupy, diagnoza na poziomie gatunku często wymaga bardziej zaawansowanych metod, takich jak sekwencjonowanie RS (RS) lub 16SrRNA 8. Rzeczywiście, MS jest uważany za obiecującą platformę do elastycznej i niezawodnej identyfikacji izolatów mikroorganizmów żywnościowych, spełniając różnorodne wymagania laboratoriów mikrobiologicznych żywności dzięki prostym protokołom i znacznie skróconemu czasie analizy, co zwiększa bezpieczeństwo żywności 4,5. Koszty operacyjne są minimalne dzięki niskiemu zużyciu odczynników, a obsługa próbek pozwala na większą automatyzację i wysoką przepustowość8. Należy jednak zauważyć, że użyteczność tej metody zależy z natury od wybranych warunków wzrostu mikroorganizmów (w tym typu podłoża hodowlanego) oraz pokrycia gatunków w bazie referencyjnej, które są uznawane za kluczowe czynniki ograniczające jej użyteczność.
MS odgrywa istotną rolę w mikrobiologii żywności, identyfikując i rozróżniając patogenne bakterie kwasu mlekowego (LAB) przenoszone przez żywność oraz inne bakterie fermentujące9. Jego zastosowanie obejmuje współczesne gatunki kultururomiki, umożliwiając identyfikację wszystkich kolonii mikroorganizmów uprawianych na podłożu hodowlanym oraz ułatwiając pozyskiwanie informacji o jednostkach tworzących kolonie (CFU)7. To podejście zostało już skutecznie zastosowane do odkrywania tak złożonych społeczności mikroorganizmów, jak te występujące w jelitach ludzkich, zaangażowane w infekcje cukrzycowych stóp lub związane z drogami moczowymi, ożywiając metody zależne od kultury w praktykach mikrobiologicznych10,11.
Protokół ten ma na celu poprowadzenie laboratoriów w skutecznym wdrażaniu MS do rutynowej oceny bezpieczeństwa mikroorganizmów w produktach mlecznych, odpowiadając na potrzeby branży dotyczące niezawodnej identyfikacji mikroorganizmów w praktycznym czasie realizacji (TAT) odpowiednim dla procesów produkcyjnych. Protokół określa kluczowe kroki, w tym (1) izolację mikroorganizmów z płynnych (mleko, śmietanka, serwatka) i stałych (masło, ser) produktów mlecznych przy użyciu wybranych odpowiednich podłoży hodowlanych (de Man, Rogosa i Sharpe agar - MRS agar, agar M-17, All-Purpose Tween 80 agar - APT agar, China Blue Lactose agar - CBL agar, Milk Plate Count Agar - MPCA, Tryptic Soy Agar - TSA) oraz dostosowane warunki inkubacji; (2) ustandaryzowane procedury przygotowywania próbek do analizy MS, oferujące opcje takie jak bezpośredni transfer kolonii, ekstracja kwasu mrówkowego na miejscu oraz ekstrakcja białek etanolu/kwasu mrówkowego w tubce, dostosowana do różnych typów bakterii i procesów laboratoryjnych; oraz (3) systematyczną analizę MS, w tym kalibrację instrumentów, definiowanie optymalnych parametrów pozyskiwania widm oraz wytyczne dotyczące interpretacji danych, w tym ocenę wartości wyników i sprawdzenie spójności dla pewnego przypisania taksonomicznego. Dzięki uporządkowanemu i zweryfikowanemu podejściu protokół ten ma na celu zwiększenie dokładności i efektywności monitorowania mikroorganizmów w przemyśle mleczarskim, co ostatecznie przyczynia się do poprawy jakości żywności i zdrowia publicznego.

<table><tbody><tr><td>70% kwasu mrówkowego</td><td>Chempur</td><td>115676307</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrylu</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00014.1011</td><td></td></tr><tr><td>APT agar</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10453.0500</td><td></td></tr><tr><td>Standard testów bakteryjnych</td><td>Bruker Daltonik GmbH</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>CBL Agar (chiński niebieski agar laktozowy)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.02348.0500</td><td></td></tr><tr><td>Columbia Blood Agar&nbsp;</td><td>Oksoid</td><td>CM0331B</td><td></td></tr><tr><td>Agar M17</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milk Plate Count Agar (MPCA)</td><td>Oksoid</td><td>CM0681</td><td></td></tr><tr><td>MRS Agar (de Man, Rogosa i Sharpe Agar)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10660.0500</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 celuje w polerowaną stal BC</td><td>Bruker Daltonik GmbH</td><td>8280800</td><td></td></tr><tr><td>Woda Peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70179</td><td></td></tr><tr><td>Agar Scheadlera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91019</td><td></td></tr><tr><td>Owcza krew</td><td>Biomaksima</td><td>SL0160-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy (TSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Merck KGaA</td><td>1.15333.2500</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Cyjano-4-hydroksycynamowa</td><td>Bruker Daltonik GmbH</td><td>8201344</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia maldi

Evaluation of Microbial Safety of Dairies using Bacterial Proteomic Profiling via MALDI Approach

Przedstawiamy protokół wykorzystujący metodę identyfikacji laserowej desorpcji/jonizacji z zakresu czasu przelotu (MALDI-TOF MS, dalej "MS") do monitorowania obecności mikroorganizmów w różnych produktach mlecznych (masło, mozzarella, mleko, śmietana) z wykorzystaniem podejścia proteomicznego, nowoczesnych metod kulturomicznych oraz różnych procedur przygotowywania próbek, które można wprowadzić do laboratoriów kontroli jakości żywności jako post, niezawodne i solidne narzędzie do monitorowania bezpieczeństwa mikroorganizmów. Obejmuje etap izolacji mikroorganizmów, pobieranie rosnących kolonii, procedury przygotowywania próbek (komórki nienaruszone, pobieranie na miejscu i w tubie), ustawianie parametrów analizy MS, generowanie i zbieranie widm MS (odcisków palców białek), a na końcu taksonomię za pomocą platformy MS, a następnie interpretację i wizualizację danych. Ta metoda, potwierdzona licznymi badaniami, zapewnia bardziej wiarygodną i opłacalną identyfikację mikroorganizmów z mleka w porównaniu z komercyjnymi systemami testów biochemicznych. Wyróżnia się jako obiecujący postęp w mikrobiologii żywności, spełniając różnorodne wymagania laboratoriów dzięki prostym protokołom i znacznie skróconemu czasie analizy. Przedstawiony protokół odpowiada na potrzeby przemysłu spożywczego, zapewniając niezawodną identyfikację mikroorganizmów w odpowiednim czasie realizacji (TAT), który jest dobrze dostosowany do procesów produkcyjnych.

Podejście kulturowe Podejście kulturowe to strategia mająca na celu maksymalne zróżnicowanie warunków uprawy mikroorganizmów, aby zwiększyć szanse na izolowanie m.in. rzadkich, trudnych do uprawy lub wcześniej nieopisanych gatunków12. Pozwala to uzyskać znacznie szerszy obraz bioróżnorodności mikroflory obecnej w różnych próbkach, np. próbkach żywności. Zwiększona różnorodność mikroorganizmów można zaobserwować już na etapie wizualnej oceny kolonii, które różnią się morfologi...

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

We present a protocol using the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS, hereinafter referred to as ...

Opracowaliśmy protokół przygotowania i izolacji społeczności mikroorganizmów z różnych codziennych produktów, takich jak mleko, śmietana, masło i ser. Po wyizolowaniu ten mikroorganizm można szybko i dokładnie zidentyfikować za pomocą MALDI-TOF MS. Optymalizacja warunków hodowli pozostaje kluczowym wyzwaniem, podobnie jak luki w bazie danych oraz wymagająca ekstrakcja bakterii Gram-dodatnich i tworzących zarodniki. Na początek pobierz reprezentatywną próbkę produktu mlecznego i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednolitość.Aseptycznie przenieś jeden mililitr lub jeden gram próbek stałych do stożkowej wirówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej dziewięć mililitrów sterylnego płynnego medium. Intensywnie przeszukaj probówkę przez 30 do 60 sekund, aby ujednolicić próbkę. Następnie przygotuj serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń poprzez przelanie jednego mililitra ujednoliconej zawiesiny do kolejnych probówek, z których każda zawiera dziewięć mililitrów roztworu sterylnego.Dokładnie wymieszaj każdą rozcieńczenię poprzez wirowanie lub potrząsanie w wirze. Następnie należy pobrać 0,1 mililitra oryginalnej próbki lub jednego z przygotowanych rozcieńczeń i przenieść ją na powierzchnię przygotowanej miski Petriego zawierającej odpowiedni medium agarowy. Używając sterylnego rozprowadzacza, równomiernie rozłóż inokulum na powierzchni płytki agarowej.Do inkubacji tlenowej zaszczep płytki agarowe APT, M17, CBL, MPCA oraz TSA przygotowanymi próbkami. Inkubuj płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Do inkubacji beztlenowej umieść zaszczepione płytki MRS agarowe w komorze beztlenowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 30 stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin.Wyjmij płytki z inkubatora i codziennie je badaj w celu monitorowania wzrostu mikroorganizmów. Za pomocą mikrolitrowej pętli mikrobiologicznej naniesiemy wybrane kolonie na to samo medium agarowe, aby je podhodować. Inkubuj w tych samych warunkach, co wcześniej.Do analizy spektrometrii mas rozpocznij od przygotowania rozwiązania macierzy MALDI. Przygotuj mieszankę rozpuszczalników z użyciem 50% acetonitrylu, 47,5% wody o jakości HPLC oraz 2,5% kwasu trichlorooctowego. Rozpuszcz związek matrycowy w mieszance rozpuszczalnika do końcowego stężenia około 10 miligramów na mililitr.Do identyfikacji bakterii SM metodą bezpośredniego transferu kolonii użyj sterylnej pętli, aby przenieść jeden mikrolitr wyhodowanej kolonii bakteryjnej na miejsce na docelowej płytce MALDI. Rozprowadź materiał bakteryjny, aby uzyskać cienką, równą warstwę na talerzu. Po wyschnięciu dodaj na wierzch jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.Do metody ekstrakcji kwasem mrówkowym na celu użyj jednorazowej pętli mikrobiologicznej lub sterylnej wykałaczki, aby pobrać niewielką ilość biomasy bakteryjnej z jednej kolonii. Rozsmaruj materiał bezpośrednio na miejscu na tarczy MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę. Dodaj jeden mikrolitr roztworu kwasu 70% mrówkowego na rozmazany obszar.Gdy plama wyschnie, nałóż na nią jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej. W metodzie ekstrakcji białek w tubce przenieś od jednej do trzech pełnych kolonii z płytki hodowli agarowej do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 300 mikrolitrów sterylnej wody. Dodaj 900 mikrolitrów etanolu absolutnego, aby uzyskać końcowe stężenie etanolu około 75%. Po krótkim wymieszaniu zawartości wiruj rurkę przez dwie minuty w temperaturze 15 000 g w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie odrzuć supernatant, nie naruszając granulki komórkowej. Następnie dodaj 20 do 50 mikrolitrów kwasu 70% mrówkowego do suszonego osadu komórkowego. Mieszaj zawartość przez pipetowanie lub wirowanie, aż granulat zostanie całkowicie zawieszony.Teraz dodaj równą ilość acetonitrylu do zawiesiny kwasu mrówkowego i dokładnie wymieszaj. Wiruj probówkę w 15 000 g przez dwie minuty. Przelej jeden mikrolitr powstałego supernatantu do wyznaczonego miejsca na tarczy MALDI i pozwól mu wyschnąć.Następnie nałóż na zaschnięte miejsce jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA. Pipetuj jeden mikrolitr albo standardu bakteryjnego zawierającego ekstrakt Escherichia coli DH5 alfa, albo kalibratora mikrobiologicznego zawierającego ekstrakt białkowy E.coli ATCC 25922, rybonukleazę i mioglobinę. Do pozyskiwania widm i identyfikacji mikroorganizmów przygotuj punkty kalibracyjne na tarczy docelowej MALDI.Załaduj płytę docelową MALDI zarówno przygotowanymi punktami próbek, jak i punktami kalibru do instrumentu spektrometrii mas. Przeprowadź analizę kalibracji w trybie kalibracji, aby skalibrować system. Obsługiwanie spektrometru mas w liniowym trybie dodatnim jonów dla ogólnego pozyskiwania widm.Następnie ustaw zakres detekcji mas spektrometru masowego na zakres od 2 000 do 20 000 stosunku masy do ładunku. Zbierz widma w duplikatach dla każdego miejsca, aby wygenerować co najmniej cztery techniczne repliki na próbkę. Teraz zastosuj metodę Savitzky'ego-Golaya jako algorytm wygładzania.Do korekcji bazy używaj algorytmu TopHat, aby usunąć szum tła. Następnie wykrywaj szczyty w trybie centroidalnym. Przeładowanie przetworzonych widm mas nieznanych izolatów bakteryjnych do platformy identyfikacji mikroorganizmów w oprogramowaniu MALDI i uruchomienie identyfikacji.Oceń oceny identyfikacyjne zgodnie z progowymi standardami producenta. Widma spektrometrii masowej wykazywały specyficzne dla gatunku profile białek, umożliwiając identyfikację na poziomie rodzaju lub gatunku. Dendrogram wykazał wysokie podobieństwo obserwowane między szczepami tego samego gatunku oraz wyraźne różnice między gatunkami.Krótszy czas inkubacji Bacillus licheniformis wynoszący 12 godzin dał wyższy wynik ID 2,38, podczas gdy dłuższa inkubacja trwająca 18 do 24 godzin skutkowała niższym wynikiem ID 1,85 ze względu na dominację sygnałów zarodników. Wśród metod przygotowywania próbek ekstrakcja białka w tubie dała najwyższy wynik ID – 2,23, następnie ekstracja kwasem mrówkowym na celu – 1,97, a bezpośredni transfer do kolonii, co dało najniższy wynik 1,61. Łącząc kulturę z przygotowaniem próbek dostosowanych do potrzeb, MALDI umożliwia dokładniejszą i szybszą analizę mikrobiomu przy niższych kosztach, co daje wyniki porównywalne z referencyjnymi metodami 16S rRNA.Protokół ten umożliwia rutynowe monitorowanie mikroorganizmów w produktach mlecznych, poprawiając szybkość i dokładność wykrywania, a ostatecznie wzmacniając systemy jakości i bezpieczeństwa żywności. Rozszerzenie baz danych MALDI i automatyzacja przepływów pracy w laboratoriach przemysłowych poprawią identyfikację mikroorganizmów, zwiększą przepustowość, zmniejszą liczbę błędów i przyspieszą monitorowanie mikrobioty.

evaluation-microbial-safety-dairies-using-bacterial-proteomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Uważa się, że bakteriocyny odgrywają kluczową rolę w definiowaniu różnorodności mikrobiologicznej w różnych niszach ekologicznych. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę oceny wpływu bakteriocyny na skład mikrobioty jelitowej na modelu zwierzęcym.

Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy

Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół trawienia na filtrze ze szczegółowymi informacjami na temat: trawienie białek, oczyszczanie peptydów i analiza pozyskiwania niezależnie od danych. Strategia ta jest stosowana do analizy ekspresji wydzielin gruczołu krokowego - próbek moczu i umożliwia wysokie pokrycie proteomem oraz profilowanie proteomu moczu bez znaczników o niskiej brakującej wartości.

Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Poznaj szybką identyfikację bakterii w produktach mlecznych za pomocą MALDI-TOF MS. Ta metoda łączy kulturomikę z ekstrakcją białek, zapewniając dokładne wyniki w krótszym czasie niż tradycyjne techniki.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI (Wideo) | JoVE Journal

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Przeglądaj więcej filmów