Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI
7 października 2025
Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.
Opracowaliśmy protokół przygotowania i izolacji społeczności mikroorganizmów z różnych codziennych produktów, takich jak mleko, śmietana, masło i ser. Po wyizolowaniu ten mikroorganizm można szybko i dokładnie zidentyfikować za pomocą MALDI-TOF MS. Optymalizacja warunków hodowli pozostaje kluczowym wyzwaniem, podobnie jak luki w bazie danych oraz wymagająca ekstrakcja bakterii Gram-dodatnich i tworzących zarodniki. Na początek pobierz reprezentatywną próbkę produktu mlecznego i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednolitość.
Aseptycznie przenieś jeden mililitr lub jeden gram próbek stałych do stożkowej wirówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej dziewięć mililitrów sterylnego płynnego medium. Intensywnie przeszukaj probówkę przez 30 do 60 sekund, aby ujednolicić próbkę. Następnie przygotuj serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń poprzez przelanie jednego mililitra ujednoliconej zawiesiny do kolejnych probówek, z których każda zawiera dziewięć mililitrów roztworu sterylnego.
Dokładnie wymieszaj każdą rozcieńczenię poprzez wirowanie lub potrząsanie w wirze. Następnie należy pobrać 0,1 mililitra oryginalnej próbki lub jednego z przygotowanych rozcieńczeń i przenieść ją na powierzchnię przygotowanej miski Petriego zawierającej odpowiedni medium agarowy. Używając sterylnego rozprowadzacza, równomiernie rozłóż inokulum na powierzchni płytki agarowej.
Do inkubacji tlenowej zaszczep płytki agarowe APT, M17, CBL, MPCA oraz TSA przygotowanymi próbkami. Inkubuj płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Do inkubacji beztlenowej umieść zaszczepione płytki MRS agarowe w komorze beztlenowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 30 stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin.
Wyjmij płytki z inkubatora i codziennie je badaj w celu monitorowania wzrostu mikroorganizmów. Za pomocą mikrolitrowej pętli mikrobiologicznej naniesiemy wybrane kolonie na to samo medium agarowe, aby je podhodować. Inkubuj w tych samych warunkach, co wcześniej.
Do analizy spektrometrii mas rozpocznij od przygotowania rozwiązania macierzy MALDI. Przygotuj mieszankę rozpuszczalników z użyciem 50% acetonitrylu, 47,5% wody o jakości HPLC oraz 2,5% kwasu trichlorooctowego. Rozpuszcz związek matrycowy w mieszance rozpuszczalnika do końcowego stężenia około 10 miligramów na mililitr.
Do identyfikacji bakterii SM metodą bezpośredniego transferu kolonii użyj sterylnej pętli, aby przenieść jeden mikrolitr wyhodowanej kolonii bakteryjnej na miejsce na docelowej płytce MALDI. Rozprowadź materiał bakteryjny, aby uzyskać cienką, równą warstwę na talerzu. Po wyschnięciu dodaj na wierzch jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Do metody ekstrakcji kwasem mrówkowym na celu użyj jednorazowej pętli mikrobiologicznej lub sterylnej wykałaczki, aby pobrać niewielką ilość biomasy bakteryjnej z jednej kolonii. Rozsmaruj materiał bezpośrednio na miejscu na tarczy MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę. Dodaj jeden mikrolitr roztworu kwasu 70% mrówkowego na rozmazany obszar.
Gdy plama wyschnie, nałóż na nią jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej. W metodzie ekstrakcji białek w tubce przenieś od jednej do trzech pełnych kolonii z płytki hodowli agarowej do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 300 mikrolitrów sterylnej wody. Dodaj 900 mikrolitrów etanolu absolutnego, aby uzyskać końcowe stężenie etanolu około 75%. Po krótkim wymieszaniu zawartości wiruj rurkę przez dwie minuty w temperaturze 15 000 g w temperaturze pokojowej.
Następnie ostrożnie odrzuć supernatant, nie naruszając granulki komórkowej. Następnie dodaj 20 do 50 mikrolitrów kwasu 70% mrówkowego do suszonego osadu komórkowego. Mieszaj zawartość przez pipetowanie lub wirowanie, aż granulat zostanie całkowicie zawieszony.
Teraz dodaj równą ilość acetonitrylu do zawiesiny kwasu mrówkowego i dokładnie wymieszaj. Wiruj probówkę w 15 000 g przez dwie minuty. Przelej jeden mikrolitr powstałego supernatantu do wyznaczonego miejsca na tarczy MALDI i pozwól mu wyschnąć.
Następnie nałóż na zaschnięte miejsce jeden mikrolitr roztworu matrycy HCCA. Pipetuj jeden mikrolitr albo standardu bakteryjnego zawierającego ekstrakt Escherichia coli DH5 alfa, albo kalibratora mikrobiologicznego zawierającego ekstrakt białkowy E.coli ATCC 25922, rybonukleazę i mioglobinę. Do pozyskiwania widm i identyfikacji mikroorganizmów przygotuj punkty kalibracyjne na tarczy docelowej MALDI.
Załaduj płytę docelową MALDI zarówno przygotowanymi punktami próbek, jak i punktami kalibru do instrumentu spektrometrii mas. Przeprowadź analizę kalibracji w trybie kalibracji, aby skalibrować system. Obsługiwanie spektrometru mas w liniowym trybie dodatnim jonów dla ogólnego pozyskiwania widm.
Następnie ustaw zakres detekcji mas spektrometru masowego na zakres od 2 000 do 20 000 stosunku masy do ładunku. Zbierz widma w duplikatach dla każdego miejsca, aby wygenerować co najmniej cztery techniczne repliki na próbkę. Teraz zastosuj metodę Savitzky'ego-Golaya jako algorytm wygładzania.
Do korekcji bazy używaj algorytmu TopHat, aby usunąć szum tła. Następnie wykrywaj szczyty w trybie centroidalnym. Przeładowanie przetworzonych widm mas nieznanych izolatów bakteryjnych do platformy identyfikacji mikroorganizmów w oprogramowaniu MALDI i uruchomienie identyfikacji.
Oceń oceny identyfikacyjne zgodnie z progowymi standardami producenta. Widma spektrometrii masowej wykazywały specyficzne dla gatunku profile białek, umożliwiając identyfikację na poziomie rodzaju lub gatunku. Dendrogram wykazał wysokie podobieństwo obserwowane między szczepami tego samego gatunku oraz wyraźne różnice między gatunkami.
Krótszy czas inkubacji Bacillus licheniformis wynoszący 12 godzin dał wyższy wynik ID 2,38, podczas gdy dłuższa inkubacja trwająca 18 do 24 godzin skutkowała niższym wynikiem ID 1,85 ze względu na dominację sygnałów zarodników. Wśród metod przygotowywania próbek ekstrakcja białka w tubie dała najwyższy wynik ID – 2,23, następnie ekstracja kwasem mrówkowym na celu – 1,97, a bezpośredni transfer do kolonii, co dało najniższy wynik 1,61. Łącząc kulturę z przygotowaniem próbek dostosowanych do potrzeb, MALDI umożliwia dokładniejszą i szybszą analizę mikrobiomu przy niższych kosztach, co daje wyniki porównywalne z referencyjnymi metodami 16S rRNA.
Protokół ten umożliwia rutynowe monitorowanie mikroorganizmów w produktach mlecznych, poprawiając szybkość i dokładność wykrywania, a ostatecznie wzmacniając systemy jakości i bezpieczeństwa żywności. Rozszerzenie baz danych MALDI i automatyzacja przepływów pracy w laboratoriach przemysłowych poprawią identyfikację mikroorganizmów, zwiększą przepustowość, zmniejszą liczbę błędów i przyspieszą monitorowanie mikrobioty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół do szybkiego oceny składu mikrobiologicznego produktów mlecznych, wykorzystując kombinację kulturomiki i MALDI-TOF MS do identyfikacji. Metoda osiąga porównywalne wyniki taksonomiczne do sekwencjonowania 16S rRNA, ale oferuje krótszy czas realizacji niż tradycyjne techniki hodowania.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ocena składu mikrobiologicznego
- Mikrobiologia produktów mlecznych
- Zastosowania spektrometrii masowej w biologii
Tło
- Znaczenie identyfikacji mikroorganizmów dla bezpieczeństwa żywności
- Wyzwania związane z hodowlaną i identyfikacją spp. z produktów mlecznych
- Zastosowanie MALDI-TOF MS w mikrobiologii
Zastosowane metody
- Izolacja i przygotowanie społeczności mikrobiologicznych z produktów mlecznych
- MALDI-TOF MS do identyfikacji bakterii
- Podejścia eksperymentalne, w tym rozcieńczenia szeregowe i inkubacje
Główne wyniki
- Udana identyfikacja bakterii o wysokiej specyficzności
- Porównanie czasów inkubacji i ich wpływu na wyniki identyfikacji
- Demonstracja skutecznych protokołów ekstrakcji białek
Wnioski
- Badanie ilustruje szybką metodę identyfikacji mikroorganizmów w produktach mlecznych.
- To podejście ma znaczące implikacje dla bezpieczeństwa żywności i badań mikrobiologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput microbial profiling of dairy products using MALDI-TOF MS enables food safety labs to detect and identify contaminants with greater speed and accuracy. This proteomic approach supports critical quality control inflection points, reducing risk of undetected microbial hazards in manufacturing. The method's robust, reproducible outputs strengthen enterprise-wide food safety and compliance strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microbial presence and diversity in complex dairy matrices.
- Supports functional validation of microbial safety targets through species-level identification.
- Facilitates predictive confidence in contamination risk assessment and mitigation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible workflows for microbial detection across diverse dairy products.
- Generates quantitative protein fingerprint spectra for robust assay development and benchmarking.
- Enables scalable, high-throughput screening compatible with routine quality control operations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by providing rapid, species-level microbial identification.
- Ensures continuity from discovery of contaminants to preclinical validation of food safety interventions.
- Reduces mechanistic ambiguity in microbial risk assessment for food product pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This MALDI-TOF MS protocol integrates from early microbial discovery through routine screening and translational safety validation in food industry pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial contamination and clarifies species-specific risks.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and cross-lab standardization.
- Analytics: Delivers high-resolution protein spectra and identification scores for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical safety validation by enabling rapid, actionable microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for ongoing microbial safety monitoring across product lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial safety and reduces undetected contamination risk.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for product release and strengthens compliance with safety standards.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of quality control interventions and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and microbial culturomics for optimal execution.
- Demands access to MALDI-TOF MS instrumentation and robust spectral databases.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Must adapt extraction and incubation parameters for different microbial and dairy matrices.
- Database gaps and challenging extraction of certain bacteria may limit identification in some cases.
