Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Opracowaliśmy protokoły mające na celu zachowanie integralności metabolitów komórkowych do badań spektrometrii mas pojedynczych komórek. Zbadaliśmy, w jaki sposób warunki mycia, hartowania i przechowywania wpływają na metabolity komórkowe. Niedawno opracowano nowe metody przygotowania próbek i techniki spektrometrii mas w celu przyspieszenia badań metabolomicznych nad pojedynczymi komórkami w celu lepszego zrozumienia heterogeniczności komórkowej i mechanizmów chorobowych.

Naukowcy muszą pokonać wiele kluczowych wyzwań, w tym ograniczoną ilość próbki, zmniejszoną czułość wykrywania ze względu na złożoność próbki oraz zmienione metabolity w związku z przygotowaniem i analizą próbki. Demonstrujemy kompleksowe techniki przygotowania próbek, które mogą zachować metabolity komórkowe i integralność komórek w badaniach metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek. Nasze protokoły mogą zaoferować prosty i skuteczny sposób przygotowania, przechowywania i transportu próbek do badań metabolomicznych pojedynczych komórek przy użyciu różnych technik spektrometrii mas.

Na początek inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla. Codziennie monitoruj konfluencję komórek i przechodź je, gdy kultury osiągną 80% konfluencji. W celu pasażowania odessać pożywkę z naczynia i spłukać raz pięcioma mililitrami PBS.

Inkubuj komórki z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby ułatwić oderwanie komórek. Zneutralizuj trypsynę, dodając osiem mililitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki i delikatnie odpipetuj pipetą, aby rozproszyć komórki. Przenieść jeden mililitr zawiesiny do dziewięciu mililitrów świeżej, kompletnej pożywki do liczenia komórek.

Aby wysiać komórki, rozcieńcz je do końcowego stężenia jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Umieść pojedyncze 18-milimetrowe szklane szkiełka pokrywowe w dołkach 12-dołkowej płytki. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki i 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki, aby uzyskać dwa razy 10 do mocy pięciu komórek na studzienkę.

Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyczepienie. Do przemycia komórek dodaj dwa mililitry zimnego roztworu mrówczanu amonu do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie wyjmij z dołka każde szkiełko nakrywkowe zawierające komórki przylegające i na krótko umieść je na dwie do trzech sekund w oddzielnym dołku wypełnionym dwoma mililitrami zimnego 0,9% roztworu mrówczanu amonu.

Umieść każde płukane szkiełko nakrywkowe z mrówczanu amonu komórkami skierowanymi do góry na szalce Petriego w pojemniku z folii aluminiowej. Powoli wlej od 10 do 20 mililitrów ciekłego azotu na szkiełka nakrywkowe, aby zapewnić całkowite pokrycie. I natychmiast przechyl szalkę Petriego pęsetą, aby zdekantować pozostały ciekły azot.

Używając rękawic kriogenicznych i izolowanej pęsety, umieść szalkę Petriego zawierającą pokrywę chłodzącą ciekły azot w komorze koncentratora próżniowego. Próbki należy przetwarzać przy użyciu standardowych ustawień próżni przez pięć do siedmiu minut, aż widoczny ciekły azot odparuje, a szkiełka nakrywkowe będą wydawały się suche. Upewnij się, że wysuszone szkiełka nakrywkowe nie zawierają żadnych pozostałości ciekłego azotu ani kryształków lodu.

Następnie owiń pojemnik ręcznikiem papierowym i przenieś go do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 48 godzin. Po przechowywaniu przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające szalkę Petriego do miejsca suszenia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Upewnij się, że skondensowany szron lub woda na szkiełkach nakrywkowych całkowicie zniknie przed wyjęciem ich z eksykatora.

Podziel próbki na dwie grupy i odpowiednio je potraktuj. Teraz zamontuj pojedynczą sondę na stoliku XYZ i przymocuj ją do zmotoryzowanego manipulatora XYZ umieszczonego pod mikroskopem cyfrowym. Połącz konfigurację pojedynczej sondy ze spektrometrem mas w celu analizy SCMS.

Jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny należy użyć nitrylu acetonowego zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego o czystości co najmniej 99,9% i dostarczyć go z natężeniem przepływu 150 nanolitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Ustaw parametry spektrometrii mas dla trybów jonów dodatnich i ujemnych. Teraz umieść dwa szkiełka nakrywkowe z grupy pierwszej i grupy drugiej razem na zmotoryzowanym stoliku XYZ konfiguracji SCMS z pojedynczą sondą i użyj mikroskopu, aby losowo wybrać komórki do analizy.

Po uzyskaniu widm masowych przeanalizuj około 30 komórek na grupę przy użyciu tej samej pojedynczej sondy, natężenia przepływu rozpuszczalnika i napięcia jonizacji. Wstępnie przetworzył surowe dane SCMS za pomocą niestandardowego skryptu R i zastosuj usuwanie tła i szumów, a następnie normalizację intensywności jonów do całkowitego prądu jonów. Deizotop danych SCMS przy użyciu izotopu MSD z pakietu Python.

Wykonaj wyrównanie pików za pomocą wewnętrznego skryptu języka Python. Zastosuj szerokość pojemnika 0,01 współczynnika ładunku głównego dla kategoryzacji i tolerancję masy 0,01 współczynnika ładunku głównego lub pięć części na milion dla wyrównania pików. Przeprowadzanie statystycznej analizy danych za pomocą Metabo Analyst 6.0.

Wykonaj test T i wygeneruj mapę cieplną pokazującą względne poziomy metabolitów. Wybierz opcję używaną top 100 i test T lub Inova, aby wygenerować 100 najważniejszych metabolitów uszeregowanych według istotności i wykreślić mapę cieplną przy użyciu tych 100 pierwszych metabolitów ze znaczącymi różnicami. Na koniec przeszukaj dokładne wartości ładunku głównego w bazie danych ludzkiego metabolomu, używając tolerancji masy 10 części na milion do przeszukiwania bazy danych.

Analiza głównych składników w trybie jonów dodatnich wykazała, że grupa pierwsza i grupa druga ściśle się pokrywały, co wskazuje na bardzo podobne profile metabolitów. W trybie jonów ujemnych zaobserwowano porównywalny wzór, chociaż grupa druga wydawała się nieco bardziej wyraźna. Analiza mapy cieplnej 100 największych metabolitów wykazała bardzo spójne wzorce obfitości między grupą pierwszą a grupą drugą w obu modach jonowych.

Nie obserwuje się większych przesunięć ani grupowania specyficznego dla grupy. Chociaż niewielkie różnice w kilku klastrach metabolitów mogą odzwierciedlać różnice w wydajności jonizacji lub stabilności metabolitu.