Name: Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj protokoły przygotowania próbek do spektrometrii mas pojedynczych komórek z wykorzystaniem mycia, hartowania ciekłym azotem i suszenia. Metoda zachowuje integralność metabolitów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez National Science Foundation (2305182), National Institutes of Health (1R01AI177469) i Chan Zuckerberg Initiative. Rysunek 1 został stworzony w BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Przeprowadź każdy krok w certyfikowanym laboratorium bezpieczeństwa biologicznego klasy II i w sterylnych warunkach. W tym badaniu linię komórkową HCT-116 wykorzystano jako system modelowy, a komórki hodowano w kompletnej pożywce hodowlanej. Regenci i używany sprzęt są wymienieni w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotować kompletne podłoże. Uzupełnij pożywkę McCoy's 5A 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny. Podgrzej do 37 °C.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . Monitoruj konfluencję codziennie i przejście, gdy kultury osiągną ~80% konfluencji.</li>
	<li>Przejście komórek (co ~2 dni).<ol>
		<li>Zassać pożywkę i spłukać raz 5 ml 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do szalki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, aby ułatwić oddzielenie komórek.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając 8 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki i delikatnie pipetując w celu rozproszenia komórek.</li>
		<li>Przenieść 1 ml zawiesiny do 9 ml świeżej kompletnej pożywki.</li>
		<li>Policz komórki. UWAGA: Komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek TC20 zgodnie z instrukcjami producenta. Nie stosowano błękitu trypanowego ani innych środków barwiących.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych.<ol>
		<li>Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia ~1 × 106 komórek/ml.</li>
		<li>Umieścić pojedyncze szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w dołkach na płytce 12-dołkowej. UWAGA: Szklane szkiełka nakrywkowe muszą być sterylizowane w autoklawie przed użyciem do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Dodać 2 ml kompletnej pożywki i 200 μl zawiesiny komórek (~2 × 105 komórek/dołek).</li>
		<li>Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyczepienie komórek. UWAGA: Aby upewnić się, że komórki są w normalnym stanie wzrostu, rutynowo sprawdzaj morfologię komórek i ich status wzrostu (za pomocą mikroskopu), a także badaj potencjalne zanieczyszczenie mykoplazmą (za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazmy).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mycie komórek roztworem mrówczanu amonu (AF)
UWAGA: Za każdym razem przygotuj świeży roztwór AF.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do płukania AF. Odważyć 0,45 g mrówczanu amonu i rozpuścić w 50 ml wody klasy LC/MS. Końcowe stężenie mrówczanu amonu wynosi 0,14 M (0,9% w/w). UWAGA: Utrzymuj roztwór w lodowatym chłodzie (0-4 °C) do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać 2 ml zimnego roztworu AF do każdego dołka płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka nakrywkowe. Używając pary sterylnych kleszczyków, delikatnie wyjmij każde szkiełko nakrywkowe zawierające przylegające komórki z dołka, a następnie na krótko (przez 2-3 s) umieść je w oddzielnym dołku wstępnie wypełnionym 2 ml zimnego 0,9% roztworu mrówczanu amonu (AF). Powtórz proces płukania. UWAGA: Aby uniknąć naruszenia komórek na etapie mycia, płukanie komórek należy wykonywać bardzo delikatnie.</li>
</ol>
3. Hartowanie komórek ciekłym azotem (LN2)
<ol>
	<li>Umieść każde przepłukane AF szkiełko nakrywkowe (komórki skierowane do góry) na szalce Petriego wewnątrz pojemnika z folii aluminiowej. UWAGA: Nosić rękawice kriogeniczne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Całą obsługę LN2 należy wykonywać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Folia aluminiowa może być używana do składania pojemnika do hartowania LN2 .</li>
	<li>Powoli wlej 10-20 ml ciekłego azotu na szkiełka nakrywkowe, zapewniając całkowite pokrycie.</li>
	<li>Natychmiast przechyl szalkę Petriego za pomocą pęsety, aby zdekantować pozostały ciekły azot. UWAGA: Wykonaj tę czynność w ciągu kilku sekund, aby zapobiec tworzeniu się dużych kryształków lodu z resztkowej wilgoci po praniu.</li>
</ol>
4. Liofilizacja komórek w próżni
<ol>
	<li>Liofilizować natychmiast po hartowaniu LN2 , aby zapobiec rozmrożeniu. UWAGA: Zdejmij wirnik SpeedVac, aby utworzyć płaską platformę, na której znajduje się szalka Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Używając rękawic kriogenicznych i izolowanej pęsety, umieść szalkę Petriego zawierającą schłodzone szkiełka nakrywkowe LN2 w komorze koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Przetwarzaj przy użyciu standardowych ustawień próżni i kontynuuj przez 5-7 minut, aż widoczny LN2 wyparuje, a szkiełka nakrywkowe wyschną. Wysuszone szkiełka nakrywkowe nie powinny zawierać żadnych pozostałości LN2 i kryształków lodu.</li>
</ol>
5. Przechowywanie komórek w zamrażarce w temperaturze -80 °C
<ol>
	<li>Owiń pojemnik ręcznikiem papierowym i przenieś do zamrażarki w temperaturze -80 °C na 48 godzin.</li>
	<li>Po przechowywaniu należy natychmiast przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające płytkę Petriego do eksykatora o temperaturze pokojowej na ~10 minut. Upewnij się, że skondensowany szron lub woda na szkiełkach nakrywkowych całkowicie zniknie przed wyjęciem ich z eksykatora. UWAGA: Szybkie przenoszenie szkiełek nakrywkowych do eksykatora minimalizuje kondensację; Nawet niewielkie zwilżenie powierzchni może spowodować rozpuszczenie wysuszonych metabolitów.</li>
	<li>Po umyciu AF należy podzielić próbki na dwie grupy (grupa 1 i grupa 2). Zastosuj następujące protokoły przetwarzania. Grupa 1: LN2 hartowanie → liofilizacji → analizie SCMS (bez przechowywania). Grupa 2: LN2 hartowanie → liofilizowanie → przechowywanie w temperaturze −80 °C 48 godzin → analizą SCMS.</li>
	<li>Kontynuuj analizę SCMS zgodnie z poniższym opisem. UWAGA: Można przygotować więcej grup komórek przy użyciu różnych warunków. Grupa 1 i Grupa 2 służą do zilustrowania ogólnych protokołów.</li>
</ol>
6. Produkcja z jedną sondą i konfiguracja SCMS
UWAGA: Pojedyncza sonda jest wytwarzana zgodnie z ustalonymi procedurami 21,24,60,61 i znajdują się tutaj tylko krótkie protokoły.
<ol>
	<li>Pociągnij igłę kwarcową z podwójnym otworem za pomocą ściągacza laserowego i wygeneruj końcówkę o średnicy ~10 μm. Zamontuj pojedynczą sondę, wkładając kapilarę ze stopionej krzemionki i emiter nano-ESI do igły kwarcowej z podwójnym otworem. Przymocuj wszystkie elementy do szkiełka za pomocą szybkowiążącej żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Zamontuj pojedynczą sondę na stoliku XYZ. Przymocuj pojedynczą sondę do zmotoryzowanego manipulatora XYZ umieszczonego pod mikroskopem cyfrowym.</li>
	<li>Połącz konfigurację ze spektrometrem mas w celu analizy SCMS.</li>
	<li>Użyć acetonitrylu (≥99,9%) zawierającego 0,1 % kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika ekstrakcyjnego o natężeniu przepływu 150 nL/min dostarczanego przez pompę strzykawkową.</li>
	<li>Ustaw parametry MS. Tryb jonów dodatnich: m/z 200-1500, +2,9 kV, rozdzielczość masowa 120 k (przy m/z 200). Tryb jonów ujemnych: m/z 70-900, −2,1 kV, rozdzielczość masowa 120 k (przy m/z 200). UWAGA: Ponieważ jony ujemne są na ogół wykrywane w zakresie m/z niższym niż jony dodatnie, dla tych dwóch trybów jonów można stosować różne zakresy m/z. Dodatkowe ustawienia MS obejmują maksymalny czas wstrzykiwania 100 ms, jeden mikroskop, standardową automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC), tryb pełnego skanowania (do analizy MS), dysocjację kolizyjną o wyższej energii (HCD) (do analizy MS/MS) ze znormalizowaną energią zderzenia 10-35 (NCE) i 320 °C dla temperatury rurki transferowej jonów. Chromatogram jonów całkowitych (TIC) został wygenerowany w każdym punkcie skanowania/czasu w celu monitorowania stabilności sygnału i wykrywania pojedynczych komórek.</li>
</ol>
7. Eksperymenty SCMS z pojedynczą sondą
<ol>
	<li>Umieść dwa szkiełka nakrywkowe (Grupa 1 i Grupa 2) razem na zmotoryzowanym stoliku XYZ konfiguracji SCMS z pojedynczą sondą 21,24,61.</li>
	<li>Aby zminimalizować efekty wsadowe, wybierz losowo komórki pod mikroskopem.</li>
	<li>Uzyskaj widma masowe w trybie jonów dodatnich i ujemnych. Analizuj wiele (np. ~30) komórek na grupę z tą samą pojedynczą sondą, natężeniem przepływu rozpuszczalnika i napięciem jonizacji. UWAGA: Używaj tej samej pojedynczej sondy, natężenia przepływu rozpuszczalnika i napięcia jonizacji dla każdego eksperymentu, aby zapewnić porównywalność danych. Kalibruj Orbitrap codziennie przed akwizycją. Zarówno analizy MS, jak i MS/MS mogą być wykonywane na poziomie pojedynczej komórki. Gromadzenie danych dotyczących stwardnienia rozsianego w celu uzyskania dokładnych wartości m/z do badań profili metabolitów i wstępnych znaczników w analizie niecelowanej. Przeprowadzanie analizy MS/MS wybranych jonów w celu identyfikacji molekularnej w analizie celowanej. Dane pozyskano za pomocą kompatybilnego oprogramowania do gromadzenia i interpretacji danych.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Wstępnie przetwarzaj nieprzetworzone dane SCMS przy użyciu niestandardowego skryptu języka R. Etapy przetwarzania wstępnego obejmują usuwanie tła i szumów oraz normalizację intensywności jonów do TIC 11,12,23.</li>
	<li>Deizotopuj dane SCMS przy użyciu pakietu języka Python ms_deisotope.</li>
	<li>Wykonaj wyrównanie pików przy użyciu wewnętrznego skryptu języka Python60. Do kategorowania należy użyć pojemnika o szerokości 0,01 m/z. Użyj tolerancji masy 0,01 m/z lub 5 ppm do wyrównania pików.</li>
	<li>Wykonuj statystyczną analizę danych za pomocą MetaboAnalyst 6.062. Przeprowadzić test t i wygenerować mapę cieplną (dla względnych poziomów metabolitów). Wybierz opcję Użyj 100 pierwszych w teście T/ANOVA, aby wygenerować 100 pierwszych metabolitów, uszeregowanych według wartości p od niskiej do wysokiej, ze znaczną różnicą (p < 0,05) od porównania. Narysuj mapę cieplną, korzystając z tych 100 pierwszych metabolitów.</li>
	<li>Przeszukaj dokładne wartości m/z i widma MS/MS w bazie danych ludzkiego metabolomu (HMDB63). Użyj tolerancji masy 10 ppm podczas przeszukiwania baz danych MS. UWAGA: Inne bazy danych, takie jak LipidMaps64, mogą być używane do przeszukiwania baz danych.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest natychmiastowe wygaszanie żywych komórek za pomocą LN2 po umyciu AF, co znacznie zmniejsza aktywność enzymatyczną i zatrzymuje trwające procesy metaboliczne. Dodatkowo, mycie komórek za pomocą AF przed wygaszaniem zwiększyło intensywność jonów i zmniejszyło efekty matrycy, wspierając jego włączenie jako krok przygotowawczy do poprawy czułości SCMS. W obecnych badaniach komórki w różnych grupach (tj. Grupie 1 i Grupie 2) były hodowane przy użyciu tej samej początkowej partii, aby zminimalizować ich zmienność biologiczną. Wybrano 48-godzinny czas przechowywania, ponieważ komórki z dodatkowym czasem wzrostu (grupa 1) mogą nadal utrzymywać odpowiednią gęstość komórek (np. w celu uniknięcia agregacji komórek) do porównawczej analizy SCMS z przechowywanymi komórkami (grupa 2). Należy jednak zachować ostrożność w przypadku przechowywania w chłodni, nawet przez 48 godzin, ponieważ nadal obserwowano znaczące zmiany metaboliczne w porównaniach między próbkami świeżo wysuszonymi i przechowywanymi (grupa 1 vs. Grupa 2). Chociaż w rzeczywistych badaniach próbki komórek i tkanek są zwykle przechowywane przez dłuższy czas (np. przez tygodnie i miesiące) w zamrażarce o temperaturze -80 °C, sugeruje się skrócenie czasu przechowywania w celu zminimalizowania zmian metabolitów.
Rozwiązywanie problemów powinno zatem koncentrować się na zminimalizowaniu czasu między suszeniem a analizą SCMS, zapewniając, że warunki rozmrażania nie będą kondensować lub częściowego ponownego nawodnienia. Resztkowa zawartość wody i kondensacja wody podczas przemian próbek mogą częściowo nawodnić komórki i umożliwić reakcje enzymatyczne i chemiczne, takie jak hydroliza, utlenianie i proteoliza, które rozkładają metabolity65, prowadząc do sztucznych zmian w składzie metabolitów. Dokładnie wysuszone próbki skutecznie zatrzymują te procesy i zachowują integralność molekularną66. Zapewnienie środowiska osuszania wolnego od wilgoci i szybkie przejście na SCMS jest kluczem do uniknięcia tych pułapek.
Pomimo sukcesu tej metody w zachowaniu profili metabolitów, nadal istnieją pewne ograniczenia. Metoda wymaga dostępu do systemu suszenia próżniowego i zamrażarki w temperaturze -80 °C i nie jest w pełni skuteczna w przypadku długotrwałego przechowywania. Ponadto, chociaż szybkie suszenie w temperaturze pokojowej tymczasowo zachowuje metabolity, nie zastępuje ono hartowania LN2 . Zmiany związane z przechowywaniem mogą nadal występować z powodu niepełnego usunięcia wody i ryzyka ponownego nawodnienia podczas obchodzenia się z próbką. Te ograniczenia podkreślają potrzebę uściślenia metody, jeśli pożądany jest dłuższy magazyn lub wyższa przepływność.
Protokoły opisane w tej pracy oferują uproszczone i skuteczne podejście do zachowania metabolomu pojedynczej komórki dla SCMS w otoczeniu. W przeciwieństwie do metod wymagających skomplikowanych krioprotektantów lub zamrażania in situ, nasz przepływ pracy jest łatwo kompatybilny z istniejącymi technikami jonizacji otoczenia i pozwala na elastyczne terminy pobierania próbek i analizy. Integracja mycia, hartowania, suszenia i krótkotrwałego przechowywania komórek bez znacznej utraty wierności metabolomicznej stanowi praktyczne rozwiązanie dla laboratoriów, które nie mają dostępu do spektrometrów masowych na żądanie. Podejście to ma duży potencjał w zakresie postępu badań nad biologią systemów jednokomórkowych, metabolizmem nowotworów, heterogenicznością odpowiedzi na leki i fenotypowaniem metabolicznym rzadkich populacji komórek. Szerokie zastosowanie tych protokołów, szczególnie w przypadku platform SCMS opartych na jonizacji otoczenia, sprawia, że stanowią one ważny wkład w dziedzinę technik analitycznych pojedynczych komórek. W przyszłych badaniach protokoły te mogą być dostosowywane i udoskonalane, aby dostosować je do szerszej gamy typów komórek. Dzięki dodatkowym etapom przygotowania próbki (np. aplikacji matrycy) przetworzone komórki mogą być potencjalnie analizowane za pomocą innych technik SCMS (np. MALDI i SIMS), oferując wyższą rozdzielczość przestrzenną i przepustowość do analizy większej liczby komórek (np. komórek o wysokim stopniu konfluencji). Wyniki sugerują również, że te protokoły hartowania, suszenia i przechowywania mogą być potencjalnie wykorzystane do przygotowania komórek do wysyłki (np. w pojemnikach na suchy lód), umożliwiając wspólne badania SCMS w różnych lokalizacjach.

Heterogeniczność między komórkami stała się fundamentalną zasadą systemów biologicznych, zwłaszcza w kontekście progresji choroby, oporności na leki i różnicowania komórkowego 1,2. W organizmach wielokomórkowych nawet genetycznie identyczne komórki w tym samym mikrośrodowisku mogą wykazywać różne fenotypy, wynikające z różnic na poziomie transkryptomicznym3, proteomicznym4 i, co najważniejsze, metabolomicznym5. Podczas gdy genomika i transkryptomika pojedynczych komórek zyskały znaczną popularność w ciągu ostatniej dekady, metabolomika pojedynczych komórek pozostaje stosunkowo słabo rozwinięta ze względu na nieodłączną złożoność i szybką dynamikę metabolitów6. Metabolity są bardzo wrażliwe na sygnały środowiskowe, mają zróżnicowaną strukturę chemiczną i polarność7 oraz występują w niskich stężeniach w objętościach małych komórek8. Właściwości te sprawiają, że ich wiarygodny pomiar z pojedynczych komórek jest wyzwaniem analitycznym. Ponieważ metabolomika oferuje najbliższy obraz stanu funkcjonalnego komórki w czasie rzeczywistym, postęp w metodach solidnego badania metabolomu w rozdzielczości pojedynczej komórki jest niezbędny do głębszego zrozumienia fizjologii i patologii komórkowej7.
Tradycyjne techniki metabolomiki masowej uśredniają sygnały w dużych populacjach komórek, maskując niejednorodność komórkową i potencjalnie ukrywając rzadkie, ale znaczące sygnatury metaboliczne. W przeciwieństwie do tego, metabolomika pojedynczej komórki ujawnia unikalne profile biochemiczne na poziomie poszczególnych komórek, co czyni ją nieocenioną w badaniu procesów takich jak różnicowanie komórek macierzystych, odpowiedzi na leki i mechanizmy chorobowe 6,9,10,11,12,13 . Metody oparte na spektrometrii mas (MS), takie jak desorpcja laserowa wspomagana matrycą i jonizacja (MALDI) MS i jony wtórne (SI) MS, posunęły naprzód tę dziedzinę, ale stoją przed wyzwaniami, takimi jak złożone przygotowanie, wymagania dotyczące próżni i destrukcyjna jonizacja, które ograniczają analizę żywych komórek 9,14. W szczególności ostatnie osiągnięcia w oprzyrządowaniu zaowocowały najnowocześniejszymi technikami, w tym transmisyjnym trybem MALDI sprzężonym z pozycyjną jonizacją indukowaną laserem (t-MALDI-215) i spektrometrią mas jonów wtórnych Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, umożliwiły bezznacznikowe, wysokorozdzielcze obrazowanie metaboliczne 3D na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki, oferując wyjątkową dokładność masy i rozdzielczość przestrzenną.
Jonizacja otoczenia MS rozwiązuje te problemy. Reprezentatywne techniki SCMS w otoczeniu obejmują jednokomórkową spektrometrię mas wideo na żywo (Video-MS)18, DESI19 i nano-DESI20. Wśród nich SCMS z pojedynczą sondą jest jedną z technik, która wyróżnia się zdolnością do bezpośredniego pobierania próbek i jonizacji żywych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu podwójnej kapilary 21,22,23,24. Technika ta minimalizuje zakłócenia próbki, umożliwiając jednocześnie profilowanie metaboliczne in situ w wysokiej rozdzielczości i została z powodzeniem zastosowana w badaniach nad wchłanianiem leków i ich wpływem na metabolizm komórkowy 22,25,26,27,28,29,30, reakcje środowiskowe 31,32 i heterogeniczność metaboliczną33. 34,35,36 wśród pojedynczych komórek.
Podczas gdy wiele metod SCMS w otoczeniu umożliwia analizę żywych komórek, zazwyczaj mają one niską przepustowość ze względu na ręczną obsługę wymaganą do indywidualnego wyboru komórek 23,37,38. Ponieważ metabolizm komórkowy jest bardzo dynamiczny, przedłużone przygotowanie próbki może zmienić profile metabolitów. Aby temu zaradzić, naukowcy stosują techniki hartowania natychmiast po wyizolowaniu komórek 39,40. Wygaszanie zatrzymuje aktywność metaboliczną poprzez szybkie chłodzenie 41,42,43,44 lub denaturację enzymatyczną 43,45,46,47, zachowując stan biochemiczny komórek w określonym momencie. Ten krok ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia dokładnych i istotnych czasowo danych metabolomicznych. Skuteczny protokół gaszenia musi szybko i dokładnie zatrzymać wewnątrzkomórkową aktywność metaboliczną. Oceniano różne metody, w tym zimną izotoniczną sól fizjologiczną48, schłodzony acetonitryl46, zimny metanol 44,47,48,49, lodowaty roztwór buforowy fosforanu (PBS)43,50, LN2 43,44,51, a nawet zabiegi gorącym powietrzem 52. Podczas gdy wiele z nich zostało pierwotnie opracowanych do metabolomiki komórek masowych, niektóre, takie jak zimny metanol i acetonitryl, zostały zaadaptowane do technik jednokomórkowych, takich jak Pico-ESI-MS39 i MALDI-MS46. Pomimo swojej skuteczności, każda metoda ma wady: rozpuszczalniki organiczne mogą powodować wyciek metabolitów i uszkodzenie błon komórkowych48,53, a nielotne roztwory soli mogą zakłócać MS, powodując supresję jonów54, zmniejszając czułość i pogarszając dokładność danych47,55.
Szybkie zamrażanie LN2 jest powszechnie stosowane w badaniach biologicznych56, ponieważ szybko zatrzymuje metabolizm komórkowy bez pozostawiania nielotnych soli, dzięki czemu dobrze nadaje się do SCMS. Może jednak uszkadzać błony komórkowe, co jest problematyczne w przypadku SCMS57,58. Aby zmniejszyć to uszkodzenie, w niektórych badaniach zastosowano metodę obejmującą szybką filtrację, płukanie NaCl na zimno i zamrażanie LN2, co pomaga zatrzymać szybko obracające się metabolity53,59. Mimo to ta metoda nie jest idealna dla SCMS ze względu na trudności w izolowaniu pojedynczych komórek i potencjalne efekty macierzy z pozostałości soli. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest kolejną powszechną metodą konserwacji, ale jej wpływ na profile metabolitów jednokomórkowych pozostaje niejasny. Wcześniej informowaliśmy o badaniach mających na celu rozwiązanie tych ograniczeń poprzez połączenie wielu kluczowych etapów: komórki są najpierw myte lotnym, kompatybilnym z MS roztworem AF, a następnie hartowane LN2, liofilizowane próżniowo i przechowywane w niskiej temperaturze (-80 °C)60. Obecne podejście minimalizuje uszkodzenia komórek i degradację metabolitów, umożliwiając dokładniejsze pomiary SCMS. Prace te koncentrują się na szczegółach eksperymentalnych, mając na celu promowanie przyjęcia tej metody przygotowania komórek do solidnych technik SCMS.

<table><tbody><tr><td>-80 stopni Celsjusza; Zamrażarka C</td><td>Eppendorf Nowy Brunszwik</td><td>U700</td><td>Przygotowanie próbki </td></tr><tr><td>ACETONTRYL</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>240744</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Mrówczan amonu </td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>401152500</td><td>Przygotowanie próbki </td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 18 mm</td><td>Szkło nakrywkowe VMR micro</td><td>48380046</td><td>Hodowla komórkowa </td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop stereoskopowy</td><td>Shenzhen D& F Co.</td><td>Supereyes T004</td><td>Analiza</td></tr><tr><td>Rurki kwarcowe z podwójnym otworem, 1.120 "x0,005" x12 "</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Konferencja Devcon</td><td>Nr kat. 20945</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Nauka Warda </td><td>470301-120 500 ml</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40 &mikro; m, OD: 100 i mikro; m</td><td>Technologie Polymicro</td><td>TSP040105</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki, ID: 50 &mikro; m, OD: 150 i mikro; m</td><td>Technologie Polymicro</td><td>1068150015</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 18mm</td><td>Firma VWR </td><td>48380046</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HyClone Syntetyczne serum (FBS)</td><td>Klon</td><td>SH3006603</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Inkubator </td><td>HeraCell (Heraeus)</td><td></td><td>Hodowla komórkowa </td></tr><tr><td>Ściągacz laserowy</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>modelu P-2000</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>Lampa UV LED</td><td>Sprzęt dentystyczny Foshan Liang Ya</td><td>LY-C240</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>McCoy's 5A </td><td>Gibco (firma Gibco) </td><td>2537128</td><td>Hodowla komórkowa </td></tr><tr><td>Mikrounia</td><td>IDEX Zdrowie & Nauka Sp. z o.o.</td><td>Zobacz materiał M-539</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany interfejs FAIMS pro </td><td>Rybak termiczny </td><td>98100-20046</td><td>Analiza </td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania MycoAlert PLUS Mycoplasma</td><td>Lonza</td><td>LT07-703</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Tablica optyczna </td><td>Thorlabs Inc., Newton</td><td></td><td>Analiza </td></tr><tr><td>Woda klasy Optima LC/MS (Fisher Chemical, USA)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał W6500</td><td>Przygotowanie próbki </td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Exploris 240 </td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td></td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140-122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Firma VWR</td><td>Numer katalogowy: 0780-50L</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac (Savant)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td> SPD111 V</td><td>Przygotowanie próbki </td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa (SKE10)</td><td>Chemyx Sp. z o.o.</td><td>80561</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Strzykawka, 250 i mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Konfiguracja eksperymentu SCMS</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek TC20</td><td>Laboratoria Bio-Rad </td><td>1450102EDU</td><td>Liczba komórek</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych, 100 mm</td><td>Fisher naukowy </td><td>FB012924</td><td>Hodowla komórkowa </td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>25200-072</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy USB ("Skorpion" 500 Zoom)</td><td>Chinavasion, hurtownia Sp. z o.o.</td><td></td><td>Analiza </td></tr><tr><td>Żywica utwardzana promieniami UV</td><td>Pierwszorzędny stomatologia</td><td>Numer artykułu 006.030</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Xcalibur</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stolik XYZ (CONEX-MFACC)</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td>Analiza </td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Sample Preparation for Single Cell Mass Spectrometry Metabolomics Studies: Combined Cell Washing, Quenching, Drying, and Storage

Jednokomórkowa spektrometria mas (SCMS) stała się nieodzownym narzędziem do badania metabolizmu komórkowego. Dzięki postępowi w nowoczesnych technikach spektrometrii mas (MS) i zapotrzebowaniu na badania nad heterogenicznością komórek w podstawowych naukach biologicznych i chorobach człowieka, w badaniach laboratoryjnych opracowano i zastosowano wiele różnych technik SCMS. Ponieważ metabolity mogą dokładnie odzwierciedlać stan komórek, analiza metabolomiczna SCMS żywych komórek jest uważana za potężne narzędzie do dostarczania informacji molekularnych o komórkach. Jednak głównym wyzwaniem w analizie SCMS żywych komórek jest zachowanie endogennych profili metabolitów podczas przygotowywania, transportu i pomiaru próbki. Metabolity komórkowe ulegają szybkiemu obrotowi i są bardzo wrażliwe na zmiany środowiskowe, co czyni je podatnymi na degradację lub transformację przed analizą. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiamy solidny i powtarzalny protokół przygotowania komórek, zaprojektowany w celu zachowania integralności metabolitów komórkowych dla SCMS. Protokół obejmuje mycie komórek lotnym roztworem mrówczanu amonu (AF), szybkie hartowanie ciekłym azotem (LN2), liofilizację próżniową i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Takie podejście minimalizuje uszkodzenia błon komórkowych, jednocześnie skutecznie zatrzymując aktywność metaboliczną. Wyniki wskazują, że szybkie wygaszanie komórek jest niezbędne; jednak ograniczenie czasu przechowywania w temperaturze -80 °C jest konieczne w celu zachowania metabolitów komórkowych. Proponowany protokół może być potencjalnie wykorzystany w innych istniejących technikach SCMS do szerokich zastosowań.

W niniejszym raporcie opisano metodologię, która obejmuje mycie komórek, szybkie wygaszanie komórek, suszenie próżniowe i przechowywanie w temperaturze -80 °C (rysunek 1). W szczególności podejście to ma na celu zachowanie stanu metabolomicznego komórek przed analizą SCMS. Skuteczność tego protokołu przetestowano poprzez przygotowanie komórek w dwóch różnych warunkach: świeżo wygaszonych i wysuszonych komórek (grupa 1, służąca jako kontrola) oraz komórek wygaszonych, wysuszonych i przechowywanych w temperaturze -80 °�C (grupa 2). Każda grupa była analizowana przy użyciu metody SCMS z pojedynczą sondą zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych. Analiza głównych składowych (PCA) i wizualizacja mapy ciepła zostały wykorzystane do oceny różnic w profilach metabolomicznych między grupami.
Wyniki PCA w trybie jonów dodatnich (ryc. 2A) ujawniły, że grupy 1 i grupa 2 miały podobne ogólne profile metabolitów. Prawie identyczne profile Grupy 1 i Grupy 2 pokazują, że przechowywanie w temperaturze -80 °C przez 48 godzin nie zmienia znacząco metabolomu, jeśli komórki są odpowiednio schładzane przed suszeniem. W trybie jonów ujemnych (ryc. 2B) obserwuje się porównywalny wzór, chociaż grupa 2 wydaje się nieco bardziej wyraźna - potencjalnie ze względu na różnice w jonizacji między określonymi klasami metabolitów, na przykład fosfatydylocholiny są lepiej wykrywane w trybie dodatnim, podczas gdy kwasy tłuszczowe jonizują się bardziej efektywnie w trybie ujemnym60. Pomimo tej zmienności, konsekwentne grupowanie między grupami 1 i 2 w obu trybach potwierdza wniosek, że zintegrowany protokół hartowania, suszenia i przechowywania utrzymuje integralność metaboliczną.
Analiza mapy cieplnej dodatkowo potwierdziła wyniki PCA, przedstawiając względną obfitość 100 najważniejszych metabolitów w dwóch grupach. Jak pokazano na rysunku 3, 100 największych metabolitów wykazuje wysoce spójne wzorce obfitości między grupą 1 a grupą 2 w obu trybach jonów. Nie obserwuje się większych przesunięć ani grupowania specyficznego dla grupy, chociaż niewielkie zmiany w kilku klastrach metabolitów mogą odzwierciedlać różnice w wydajności jonizacji lub stabilności metabolitów. Wyniki te pokazują, że proces harcowania, suszenia i przechowywania zachowuje komórkowe profile metabolomiczne z wysoką wiernością, dzięki czemu doskonale nadaje się do zastosowań SCMS w otoczeniu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Ogólny przebieg pracy w analizie spektrometrii mas jednokomórkowych (SCMS) badający, w jaki sposób wygaszanie LN2 i 48-godzinne przechowywanie w temperaturze -80 °C wpływają na profile metabolitów w pojedynczych komórkach. (A) Komórki wysiewano, inkubowano i płukano roztworem formatu amonowego (AF). (B) Przygotowano dwie grupy komórek - Grupa 1: komórki zostały umyte, schładzone i liofilizowane do natychmiastowych eksperymentów SCMS bez przechowywania; Grupa 2: komórki zostały umyte, schodzone, liofilizowane i przechowywane w temperaturze -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Analiza głównych składowych (PCA) danych SCMS z komórek HCT-116 w grupach eksperymentalnych w trybie (A) jonów dodatnich i (B) trybie jonów ujemnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Mapy cieplne przedstawiające względne poziomy 100 najważniejszych metabolitów wykrytych w pojedynczych komórkach HCT-116 przygotowanych w różnych warunkach, przedstawione dla (A) trybu jonów dodatnich i (B) trybu jonów ujemnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Single-cell mass spectrometry (SCMS) has become an indispensable tool for studying cellular metabolism. Owing to advancements in modern mass spectrometry ...

Opracowaliśmy protokoły mające na celu zachowanie integralności metabolitów komórkowych do badań spektrometrii mas pojedynczych komórek. Zbadaliśmy, w jaki sposób warunki mycia, hartowania i przechowywania wpływają na metabolity komórkowe. Niedawno opracowano nowe metody przygotowania próbek i techniki spektrometrii mas w celu przyspieszenia badań metabolomicznych nad pojedynczymi komórkami w celu lepszego zrozumienia heterogeniczności komórkowej i mechanizmów chorobowych.Naukowcy muszą pokonać wiele kluczowych wyzwań, w tym ograniczoną ilość próbki, zmniejszoną czułość wykrywania ze względu na złożoność próbki oraz zmienione metabolity w związku z przygotowaniem i analizą próbki. Demonstrujemy kompleksowe techniki przygotowania próbek, które mogą zachować metabolity komórkowe i integralność komórek w badaniach metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek. Nasze protokoły mogą zaoferować prosty i skuteczny sposób przygotowania, przechowywania i transportu próbek do badań metabolomicznych pojedynczych komórek przy użyciu różnych technik spektrometrii mas.Na początek inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla. Codziennie monitoruj konfluencję komórek i przechodź je, gdy kultury osiągną 80% konfluencji. W celu pasażowania odessać pożywkę z naczynia i spłukać raz pięcioma mililitrami PBS.Inkubuj komórki z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby ułatwić oderwanie komórek. Zneutralizuj trypsynę, dodając osiem mililitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki i delikatnie odpipetuj pipetą, aby rozproszyć komórki. Przenieść jeden mililitr zawiesiny do dziewięciu mililitrów świeżej, kompletnej pożywki do liczenia komórek.Aby wysiać komórki, rozcieńcz je do końcowego stężenia jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Umieść pojedyncze 18-milimetrowe szklane szkiełka pokrywowe w dołkach 12-dołkowej płytki. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki i 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki, aby uzyskać dwa razy 10 do mocy pięciu komórek na studzienkę.Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyczepienie. Do przemycia komórek dodaj dwa mililitry zimnego roztworu mrówczanu amonu do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie wyjmij z dołka każde szkiełko nakrywkowe zawierające komórki przylegające i na krótko umieść je na dwie do trzech sekund w oddzielnym dołku wypełnionym dwoma mililitrami zimnego 0,9% roztworu mrówczanu amonu.Umieść każde płukane szkiełko nakrywkowe z mrówczanu amonu komórkami skierowanymi do góry na szalce Petriego w pojemniku z folii aluminiowej. Powoli wlej od 10 do 20 mililitrów ciekłego azotu na szkiełka nakrywkowe, aby zapewnić całkowite pokrycie. I natychmiast przechyl szalkę Petriego pęsetą, aby zdekantować pozostały ciekły azot.Używając rękawic kriogenicznych i izolowanej pęsety, umieść szalkę Petriego zawierającą pokrywę chłodzącą ciekły azot w komorze koncentratora próżniowego. Próbki należy przetwarzać przy użyciu standardowych ustawień próżni przez pięć do siedmiu minut, aż widoczny ciekły azot odparuje, a szkiełka nakrywkowe będą wydawały się suche. Upewnij się, że wysuszone szkiełka nakrywkowe nie zawierają żadnych pozostałości ciekłego azotu ani kryształków lodu.Następnie owiń pojemnik ręcznikiem papierowym i przenieś go do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 48 godzin. Po przechowywaniu przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające szalkę Petriego do miejsca suszenia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Upewnij się, że skondensowany szron lub woda na szkiełkach nakrywkowych całkowicie zniknie przed wyjęciem ich z eksykatora.Podziel próbki na dwie grupy i odpowiednio je potraktuj. Teraz zamontuj pojedynczą sondę na stoliku XYZ i przymocuj ją do zmotoryzowanego manipulatora XYZ umieszczonego pod mikroskopem cyfrowym. Połącz konfigurację pojedynczej sondy ze spektrometrem mas w celu analizy SCMS.Jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny należy użyć nitrylu acetonowego zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego o czystości co najmniej 99,9% i dostarczyć go z natężeniem przepływu 150 nanolitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Ustaw parametry spektrometrii mas dla trybów jonów dodatnich i ujemnych. Teraz umieść dwa szkiełka nakrywkowe z grupy pierwszej i grupy drugiej razem na zmotoryzowanym stoliku XYZ konfiguracji SCMS z pojedynczą sondą i użyj mikroskopu, aby losowo wybrać komórki do analizy.Po uzyskaniu widm masowych przeanalizuj około 30 komórek na grupę przy użyciu tej samej pojedynczej sondy, natężenia przepływu rozpuszczalnika i napięcia jonizacji. Wstępnie przetworzył surowe dane SCMS za pomocą niestandardowego skryptu R i zastosuj usuwanie tła i szumów, a następnie normalizację intensywności jonów do całkowitego prądu jonów. Deizotop danych SCMS przy użyciu izotopu MSD z pakietu Python.Wykonaj wyrównanie pików za pomocą wewnętrznego skryptu języka Python. Zastosuj szerokość pojemnika 0,01 współczynnika ładunku głównego dla kategoryzacji i tolerancję masy 0,01 współczynnika ładunku głównego lub pięć części na milion dla wyrównania pików. Przeprowadzanie statystycznej analizy danych za pomocą Metabo Analyst 6.0.Wykonaj test T i wygeneruj mapę cieplną pokazującą względne poziomy metabolitów. Wybierz opcję używaną top 100 i test T lub Inova, aby wygenerować 100 najważniejszych metabolitów uszeregowanych według istotności i wykreślić mapę cieplną przy użyciu tych 100 pierwszych metabolitów ze znaczącymi różnicami. Na koniec przeszukaj dokładne wartości ładunku głównego w bazie danych ludzkiego metabolomu, używając tolerancji masy 10 części na milion do przeszukiwania bazy danych.Analiza głównych składników w trybie jonów dodatnich wykazała, że grupa pierwsza i grupa druga ściśle się pokrywały, co wskazuje na bardzo podobne profile metabolitów. W trybie jonów ujemnych zaobserwowano porównywalny wzór, chociaż grupa druga wydawała się nieco bardziej wyraźna. Analiza mapy cieplnej 100 największych metabolitów wykazała bardzo spójne wzorce obfitości między grupą pierwszą a grupą drugą w obu modach jonowych.Nie obserwuje się większych przesunięć ani grupowania specyficznego dla grupy. Chociaż niewielkie różnice w kilku klastrach metabolitów mogą odzwierciedlać różnice w wydajności jonizacji lub stabilności metabolitu.

sample-preparation-for-single-cell-mass-spectrometry-metabolomics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę przygotowania próbek komórek raka piersi do profilowania metabolitów. Komórki raka piersi leczy się estradiolem, który wiąże się z receptorem estrogenowym alfa i powoduje zmianę składu metabolitów.

Przygotowanie próbek do metabolomiki: metoda przygotowania próbek komórek do profilowania metabolitów

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Poznaj protokoły przygotowania próbek do spektrometrii mas pojedynczych komórek z wykorzystaniem mycia, hartowania ciekłym azotem i suszenia. Metoda zachowuje integralność metabolitów komórkowych.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Przeglądaj więcej filmów