Precyzyjna indukcja i rozróżnienie odruchów kaszlu i kichania u myszy
3 października 2025
Badanie to ustanowiło modele kaszlu i kichania u myszy poprzez zastosowanie specyficznych bodźców do tchawicy i jamy nosowej oraz opracowało metodę opartą na dźwięku do rozróżniania kaszlu od kichania myszy poprzez analizę różnic w ich sygnałach akustycznych.
Protokół ten koncentruje się na odruchu oddechowym u myszy. Naszym celem jest stymulacja tchawicy i jamy nosowej, aby wywołać kaszel i kichanie, a na podstawie funkcji dźwiękowych rozróżnimy te dwa typy zdarzeń. Wcześniejsze badania często wykorzystywały nebulizowaną kapsaicynę lub kwas cytrynowy do stymulowania kontroli oddechowej oraz zachowań związanych z kaszlem i kichaniem u myszy.
Jednak nadal nie jest jasne, czy stymulacja kontroli oddechowej poprzez nebulizację wywołuje kaszel, kichanie, czy oba te objawy, ponieważ obecnie nie istnieje wiarygodna metoda rozróżnienia tych dwóch reakcji. W ramach tego projektu opracowaliśmy metodę wywoływania kaszlu i kichania poprzez selektywne stymulowanie tchawicy, czyli jamy nosowej. Wykorzystaliśmy również analizę akustyczną, aby zidentyfikować cechy charakterystyczne między kaszlem a kichaniem.
Nasze badania w całości stanowią potężne narzędzie, które bezpośrednio wesprze rozwój przyszłych leków na zaburzenia kaszlu i kichania. Na początek wyciąć igłę o grubości 28 w kaniulę o długości około pięciu milimetrów. Używając kleszczy i papieru ściernego, wygładź oba końce i przymocuj jeden koniec do silikonowej rurki.
Podłącz rurkowaną kaniulę do strzykawki o średnicy jednego mililitra i przepłucz ją wodą, aby sprawdzić przechodność. Następnie zgiąć kanyulę pod kątem 90 stopni z przełożeniem dwóch do trzech ramion. Włóż dłuższe ramię do silikonowej rurki o długości pięciu centymetrów.
Losowo przydziel myszy do trzech grup, po sześć myszy każda. Teraz zabezpiecz znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole. Po ogoleniu włosów czaszki i szyjki dezynfekuj to miejsce jodoforem i alkoholem.
Pod mikroskopem nacinaj skórę szyjki szyjnej na około jeden centymetr i tępo rozcinaj tkanki i mięśnie, aby odsłonić tchawicę. Przekłuć tkankę miękką pomiędzy chrząstką chrząstką chrząstką i tchawicą za pomocą igły o grubości 32. Następnie stwórz minimalne otwór tchawicy nożyczkami okulistycznymi.
Wkładaj metalową kaniulę pokrytą silikonem około jednego milimetra do lumenu tchawicy i zabezpiecz połączenie kaniula z tchawicą szwem 7-0. Teraz naciń skórę głowy na około jeden centymetr i tępo przeciąż podskórnie od szyi aż do czaszki. Przeprowadź silikonową rurkę przez tunel podskórny do czaszki, przymocuj ją do czaszki za pomocą cementu dentystycznego, a następnie zszyj skórę.
Zszyj nacięcie szyjne i pozwól zwierzęciu dochodzić do siebie przez pięć dni. Zamontuj sondę ultradźwiękową z uszczelką kompatybilną z portem i włóż ją do portu komory pletysmografii całego korpusu, aby zapewnić szczelny kontakt. Podłącz komorę pletysmografii całego ciała do czujnika przepływu i systemu polaryzacji.
Przymocuj silikonową rurkę przymocowaną do czaszki do 30-centymetrowej rurki przedłużającej i umieść mysz w komorze pletysmografii całego ciała. Wysuń rurkę przez górny port komory i uszczelnij ją wokół rurki gliną modelarską. Sprawdź szczelność powietrza, potwierdzając, że szczyty fal oddechowych mieszczą się w granicach czterech, plus minus dwa.
Podłącz strzykawkę o pojemności jednego mililitra z pięcioma mililitrami roztworu kapsaicyny do rurki przedłużającej i zamontuj ją na pompie mikrowtryskowej. Ustaw kamerę o dużej prędkości skierowaną na komorę. Dostosuj odległość i ostrość aparatu, aby uzyskać wyraźny widok, a częstotliwość próbkowania ustaw na 160 klatek na sekundę.
Teraz jednocześnie rozpocznij pletysmografię całego ciała, ultrasonografię i oprogramowanie kamery. Uruchom pompę, aby rozpocząć infuzję kapsaicyny i zapisuj liczbę kaszlu przez 10 minut. Przygotuj zwierzęta i wszystkie materiały potrzebne do zabiegu.
Po znieczuleniu i przygotowaniu myszy zabezpiecz ją w ramce stereotaksyjnej. Dezynfekuj obszar operacyjny jodoforem i alkoholem. Nacinaj skórę nad czaszką i kością nosową, używając skalpela, aby odsłonić kość nosową.
Za pomocą mikrowiertła wykonaj otwór o średnicy 0,5 milimetra na styku kości nosowej z bocznym wyrostkiem chrząstki przegrody nosowej. Teraz odsłoń błonę śluzową nosa przez otwór na żarno. Delikatnie unieś błonę śluzową nosa igłą 32-gauge, aby odsłonić jamę nosową.
Następnie zamontuj rurkę polietylenową w ramieniu stereotaksyjnym. Ustaw końcówkę rurki równo z otworem na dziurkę, przymocuj rurkę do kości nosowej za pomocą cementu dentystycznego, a następnie zszyj skórę. Połóż mysz na poduszce grzewczej i pozwól jej się zregenerować, aż odzyska świadomość.
Podłącz komorę pletysmografii całego ciała do czujnika przepływu i systemu polaryzacyjnego zgodnie z instrukcją producenta. Następnie zamontuj sondę ultradźwiękową z uszczelką dostosowaną do portu. Włóż sondę do komory pletyzmografii i sprawdź szczelność hermetyczną.
Przenieś mysz do komory pletyzmografii i wysunąć rurkę polietylenową przez górny port. Uszczelnij port za pomocą gliny modelarskiej, aby zabezpieczyć rurkę. Sprawdź szczelność komory i ustaw kamerę zgodnie z wcześniejszymi demonstracjami.
Na koniec przesuwaj nylonowy filament o średnicy 0,25 milimetra przez miękką rurkę do jamy nosowej na głębokość od zera do trzech milimetrów. Trzymaj pięć centymetrów filamentu odsłoniętego poza ręczną tubką. Podczas każdej stymulacji naciskaj wolny koniec filamentu, aż zgina się pod kątem około 45 stopni, wywierając około 0,6 grama siły na błonę śluzową nosa przez jedną sekundę.
Powtarzaj stymulację co 30 sekund, rejestrując reakcje kichania przez 10 minut. Myszy poddane operacji tchawicy lub nosa z mechaniczną stymulacją nosa oraz wyzwaniem kapsaicynowym tchawicą znacząco zwiększały odpowiednio kichnięcie i kaszel. Zapisy pletyzmografii całego ciała wykazały zarówno pojedyncze, jak i podwójne szczyty oddechowe dla kaszlu wywołanego kapsaicyną oraz mechanicznie wywołanego kichania.
Oscylogramy dźwięku wykazały, że kaszel miał nagłe począcie intensywności szczytowej na początku i był skoncentrowany w zakresie od zera do 30 kiloherców. Podczas gdy dźwięk kichania stopniowo narastał, obejmował zakres od zera do 80 kiloherców i trwał dłużej. Faza kompresji kaszlu z pojedynczym szczytem trwała średnio około 32,39 milisekundy, co jest znacznie krótsze niż kaszel podwójnego szczytu, czyli około 53,17 milisekundy.
Średnia faza kompresji przy kichnięciach z pojedynczym szczytem wynosiła około 44,03 milisekundy, podczas gdy podwójne kichnięcia trwały średnio około 74,24 milisekundy i były znacznie dłuższe. Wzorce pojedynczego szczytu występowały w 77,55% kaszli, podczas gdy tylko 32,42% kichnięć wykazywało pojedyncze szczyty, z dominującymi wzorcami podwójnych szczytów na poziomie 67,58%. Czas trwania dźwięku kichania był istotnie dłuższy niż kaszel, choć z nakładającymi się zakresami. Przecięcie aferentów czuciowych nosa znacząco zmniejszyło kichanie wywołane kapsaicyną, podczas gdy kaszel pozostał niezmieniony.
Przegląd
W niniejszym badaniu opracowano modele kaszlu i kichania u myszy poprzez zastosowanie specyficznych bodźców w tchawicy i jamie nosowej. Opracowano metodę opartą na analizie dźwięku, która pozwala odróżnić kaszel od kichania u myszy poprzez analizę różnic w sygnałach akustycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia układu oddechowego
- Modele zwierzęce
Wstęp
- W poprzednich badaniach w celu stymulacji reakcji oddechowych stosowano nebulizowaną kapsaicynę lub kwas cytrynowy.
- Rozróżnianie kaszlu od kichania było utrudnione ze względu na brak wiarygodnych metod.
- Zrozumienie tych odruchów może pomóc w opracowaniu metod leczenia powiązanych zaburzeń.
- Analiza akustyczna może dostarczyć informacji na temat charakterystyki kaszlu i kichania.
Cel badania
- Wywołanie kaszlu i kichania u myszy poprzez selektywną stymulację.
- Odróżnienie reakcji kaszlu od kichania przy użyciu cech dźwiękowych.
- Zapewnienie narzędzia do przyszłego opracowywania leków ukierunkowanych na zaburzenia układu oddechowego.
Zastosowane metody
- Indukcja kaszlu i kichania poprzez stymulację tchawicy i jamy nosowej.
- Zastosowanie pletyzmografii całego ciała do monitorowania czynności oddechowych.
- Analiza akustyczna w celu zidentyfikowania charakterystycznych cech dźwiękowych kaszlu i kichania.
- Układ eksperymentalny obejmujący procedury chirurgiczne i rejestrację dźwięku.
Główne wyniki
- Odnotowano znaczny wzrost liczby epizodów kaszlu i kichania po stymulacji.
- Zidentyfikowano charakterystyczne cechy akustyczne dla kaszlu i kichania.
- Pletyzmografia całego ciała wykazała ślady oddechowe z pojedynczymi i podwójnymi szczytami.
- Analiza audio ujawniła różnice w natężeniu i zakresach częstotliwości między kaszlem a kichaniem.
Wnioski
- Ustanowione modele skutecznie rozróżniają kaszel i kichanie u myszy.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych studiów nad zaburzeniami układu oddechowego.
- Analiza akustyczna może być cennym narzędziem w badaniach nad układem oddechowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rozróżnienie odruchów kaszlu i kichania z precyzją anatomiczną i akustyczną wypełnia krytyczną lukę w walidacji celów oddechowych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w terapii dróg oddechowych. Model ten umożliwia wysoką pewność separacji nakładających się fenotypów oddechowych, wspierając rozwój biomarkerów prognostycznych oraz rzetelną ocenę przedkliniczną. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfela badań, dostarczając ilościowych, powtarzalnych punktów końcowych dla modulacji odruchów oddechowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne badanie szlaków obronnych dróg oddechowych poprzez izolację odruchów kaszlu i kichania.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez stymulację anatomicznie specyficzną i ilościowe odczyty.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie nakładających się fenotypów oddechowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze kandydatów w procesie odkrywania leków na schorzenia układu oddechowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne modele do kwantyfikacji kaszlu i kichania in vivo.
- Standaryzuje punkty końcowe akustyczne i pletyzmograficzne dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę związków kandydackich celujących w odruchy dróg oddechowych.
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do porównań międzybadawczych i międzyzespołowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje modele przedkliniczne z istotnymi dla choroby odruchami dróg oddechowych w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez mapowanie odrębnych sygnatur fizjologicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne, mierzalne punkty końcowe.
- Zmniejsza niejednoznaczność translacyjną, dostarczając danych fenotypowych osadzonych w mechanizmach biologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnego odkrycia, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną, zapewniając reużywalną platformę do badań nad odruchami oddechowymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków mechanizmów obronnych dróg oddechowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników akustycznych i oddechowych w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości i statystyczne rozróżnienie zdarzeń kaszlu od kichania.
- Badania translacyjne: Łączy studia przedkliniczne i translacyjne poprzez dostosowanie wyników modelu do klinicznych punktów końcowych układu oddechowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowaną, skalowalną możliwość prowadzenia bieżących badań nad układem oddechowym i oceny związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w układzie oddechowym.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów odruchów oddechowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki stosowane w chorobach układu oddechowego.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w technikach chirurgicznych u myszy oraz w fizjologii układu oddechowego.
- Wymaga dostępu do pletyzmografii całego ciała, wideografii wysokiej prędkości oraz infrastruktury do ultradźwiękowego nagrywania dźwięku.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów stymulacji i rejestracji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych gatunków lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność zabiegów chirurgicznych oraz potrzebę zastosowania specjalistycznych narzędzi analitycznych.
