Name: Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności bariery krew-mózg u dorosłych danio pręgowanych z wykorzystaniem niebieskiego barwnika Evansa. Protokół umożliwia jakościową i ilościową analizę uszkodzeń naczyniowych w modelach chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały sfinansowane przez malezyjskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego (MoHE) w ramach programu grantów na badania podstawowe (FRGS), numer grantu FRGS19-125-0734. Pomoc w publikacji tego badania została wsparta przez Wydział Lekarski Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM).

Protokół ten był przestrzegany i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC) przy Międzynarodowym Uniwersytecie Islamskim w Malezji (IIUM), w odniesieniu do zatwierdzenia etyki zwierząt (nr ref.: IIUM/504/14/2/IACUC).
1. Przygotuj roztwór podstawowy barwnika Evans Blue
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,1 g barwnika EB w 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w celu przygotowania 1% (w/v) roztworu podstawowego. Dokładnie wymieszaj, aż barwnik całkowicie się rozpuści. UWAGA: EB jest sklasyfikowany jako czynnik rakotwórczy kategorii 1B. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą i oczami. Używaj odzieży ochronnej, rękawic, okularów ochronnych i respiratora przeciwpyłowego. Unikaj wdychania pyłu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Nie wrzucaj barwnika Evans Blue (stałego lub roztworu) do zlewu. Odpady należy przechowywać w oznakowanych oryginalnych pojemnikach. Utylizować zgodnie z krajowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. Zebrać filtrat do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Owinąć probówkę w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C. UWAGA: Można również użyć filtra o mniejszej wielkości porów (np. 0,2 μm). Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni lub w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca, przy czym zaleca się podawanie w celu zminimalizowania powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, gdy jest przechowywany w stanie zamrożonym.</li>
</ol>
2. Podawaj barwnik Evans Blue dorosłym danio pręgowanym
<ol>
	<li>Znieczulenie danio pręgowanego za pomocą wstrząsu hipotermicznego poprzez stopniowe obniżanie temperatury wody z 12 °C do 7 °C, aż ryba przestanie reagować na bodźce dotykowe. UWAGA: Stopniowe obniżanie temperatury można osiągnąć, dodając do wody powoli przez kilka minut niewielkie ilości pokruszonego lodu, co pozwala na stopniowy spadek temperatury. Zanurzenie w trikainie jest również odpowiednią alternatywną metodą znieczulania.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl 1% barwnika EB do jamy dootrzewnowej (IP) za pomocą strzykawki insulinowej 31 G. Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia przez 10 sekund, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. UWAGA: Jama wewnątrzotrzewnowa danio pręgowanego znajduje się za obręczą miedniczną. Aby zwiększyć skuteczność podawania EB, należy pościć rybę przez 24 godziny przed wstrzyknięciem. Spowoduje to opróżnienie jamy brzusznej, aby zapewnić lepszy dostęp i dokładność do przestrzeni wewnątrzotrzewnowej.</li>
	<li>Przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozwól na regenerację przez 30 minut. Monitoruj obrażenia, śmiertelność lub zmiany w zachowaniu. UWAGA: Aby pomóc danio pręgowanemu w powrocie do zdrowia, użyj nieznacznie obniżonej temperatury wody (20-24 °C) do zbiornika rekonwalescencji, aby zapewnić łagodny efekt znieczulenia i pomóc znieczulić potencjalny dyskomfort po wstrzyknięciu. Wstrzyknięte ryby będą miały niebieski odcień, co wskazuje na udaną cyrkulację barwnika (ryc. 1).</li>
	<li>Po 30 minutach poddać rybę eutanazji poprzez szok hipotermiczny w temperaturze od 1 °C do 3 °C. Następnie odetnij głowę ryby za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek chirurgicznych. UWAGA: Aby pomóc w późniejszej sekcji mózgu, pozostaw dodatkowe mięso za głową podczas dekapitacji.</li>
	<li>Opłucz głowę dwukrotnie w 1x PBS (stosunek 1:20 ryb do PBS), aby usunąć nadmiar krwi i barwnika EB. UWAGA: Niewystarczające mycie może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich i zagrozić dokładności analizy. Aby temu zapobiec, dokładnie umyj tkankę mózgową co najmniej dwa razy 1x PBS, upewniając się, że cała widoczna krew i swobodnie płynący barwnik zostały usunięte. Jeśli pozostaną resztki barwnika, zdecydowanie zaleca się trzecie pranie.</li>
	<li>Utrwalić głowę w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc (stosunek ryb do utrwalacza 1:20). Mieszanie nie jest wymagane podczas utrwalania, ponieważ mały rozmiar głowy danio pręgowanego i wystarczająca objętość utrwalacza umożliwiają skuteczną penetrację w warunkach statycznych. UWAGA: PFA jest szkodliwy w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Przygotuj roztwór PFA pod wyciągiem. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i unikać wdychania pyłu. Przestrzegaj wszystkich wytycznych bezpieczeństwa zgodnie z zaleceniami producenta. Traktuj PFA jako odpad niebezpieczny. Unikaj wyrzucania go do kanalizacji. Zbieraj i etykietuj odpady w szczelnych pojemnikach i utylizuj je zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami.</li>
	<li>Przeanalizuj mózg danio pręgowanego<ol>
		<li>Umieść nieruchomą głowę na czystej szalce Petriego i przeprowadź sekcję mózgu, jak opisano wcześniej15, używając pęsety ze spiczastym końcem. Ciągle dodawaj kroplami 1x PBS podczas sekcji, aby utrzymać nawodnienie tkanki i zapobiec wysuszeniu.</li>
		<li>Przygotuj płytkę z agarozą, rozpuszczając 1 g agarozy w 100 ml wody destylowanej. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż całkowicie się rozpuści, wlej do szalki Petriego i pozwól mu zastygnąć.</li>
		<li>Wypłucz wypreparowany mózg dwukrotnie w dwóch oddzielnych kąpielach 1x PBS. Następnie umieść tkankę na 1% płytce agarozowej, aby zatrzymać wilgoć i zapobiec kurczeniu się. UWAGA: Niewystarczające mycie może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich i zagrozić dokładności analizy. Aby temu zapobiec, należy dokładnie umyć tkankę mózgową co najmniej dwa razy 1× PBS, upewniając się, że cała widoczna krew i swobodnie płynący barwnik zostały usunięte. Jeśli pozostaną resztki barwnika, zdecydowanie zaleca się trzecie pranie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig1.jpg"> 
Rycina 1: Porównanie ubarwienia skóry u danio pręgowanego normalnego i z wstrzykiwanym EB. (A) Normalny danio pręgowany o typowym brązowawym odcieniu skóry. (B) Danio pręgowany, któremu wstrzyknięto EB, wykazujący zauważalny niebieskawy odcień, wskazujący na pomyślną cyrkulację ogólnoustrojową barwnika. Podziałka = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
3. Ustanowienie kontroli pozytywnej poprzez ranę kłutą (SWI)
UWAGA: Rana kłuta przerywa barierę krew-mózg i umożliwia wynaczynienie EB w miejscu urazu.
<ol>
	<li>Znieczulić rybę metodą wstrząsu hipotermicznego (patrz krok 2.1). Po znieczuleniu wstrzyknąć 20 μl 1% barwnika EB i pozostawić rybom do regeneracji przez 30 minut, jak opisano w krokach 2.2 i 2.3.</li>
	<li>Po 30-minutowym okresie rekonwalescencji należy przygotować sterylną igłę 31 G przymocowaną do strzykawki insulinowej i przeprowadzić procedurę leczenia ran kłutych w następujący sposób:<ol>
		<li>Ponownie znieczulić rybę.</li>
		<li>Ustaw rybę pionowo na płaskiej, zimnej powierzchni (np. worek z żelem lodowym). Wbić igłę w jedną stronę kresomózgowia pod kątem 90° na głębokość nieprzekraczającą 1,5 mm (ryc. 2). UWAGA: Aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi skóry z opakowaniem z żelem lodowym i uniknąć potencjalnego uszkodzenia skóry, umieść warstwę gazy lub ręcznika papierowego między rybą a zimną powierzchnią (Rysunek 2). Alternatywnie, rybę można umieścić na płytkiej szalce Petriego umieszczonej na wierzchu zimnego opakowania, aby utrzymać chłodzenie bez bezpośredniego kontaktu. Zaznaczyć 1,5 mm na igle, aby zapobiec nadmiernej penetracji.</li>
		<li>Przenieść rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozostawić do odzyskania przez 30 minut.</li>
		<li>Eutanazja, dekapitacja, naprawa i sekcja mózgu zgodnie z opisem w krokach od 2.4 do 2.7.</li>
		<li>W celu kontroli ujemnej powtórz kroki od 2.1 do 2.7, używając 20 μl 1x PBS zamiast barwnika EB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig2.jpg"> 
Rycina 2: Rana kłuta w celu kontroli pozytywnej. (A) Krótko wprowadzić igłę 31G do kresomózgowia (czerwone kółko), aby ułatwić przenikanie barwnika EB do tkanki mózgowej; Porównanie obok siebie nieuszkodzonego mózgu i mózgu dźgniętego nożem, (B) widok grzbietowy miejsca ukłucia (czerwone kółko), (C) widok boczny miejsca ukłucia. Podziałka = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
4. Analiza jakościowa wynaczynienia EB
<ol>
	<li>Obserwuj wypreparowane tkanki mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym. Zoptymalizuj ustawienia obrazu (powiększenie, balans bieli, ekspozycja, kontrast itp.), aby zapewnić spójność.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą kamery zamontowanej w mikroskopie i zapisuj w programie . Format TIFF. UWAGA: Użyj identycznych ustawień obrazowania dla wszystkich próbek, aby zapewnić wiarygodność porównawczą.</li>
</ol>
5. Analiza ilościowa wynaczynienia EB
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj Fiji (link do pobrania oprogramowania jest dostępny w Tabeli Materiałów). Otwórz obraz w języku Fidżi.</li>
	<li>Wykonaj dekonwolucję kolorów, klikając: Image &gt; Colour &gt; Colour Deconvolution &gt; RGB, co spowoduje powstanie trzech oddzielnych obrazów reprezentujących odcienie czerwonego, zielonego i niebieskiego. UWAGA: Ten krok izoluje niebieski odcień od innych składników koloru, zapewniając, że mierzona jest tylko intensywność niebieskiego barwnika.</li>
	<li>Aktywuj obraz niebieskiego kanału (zwykle oznaczony jako "Color_3"), klikając obraz. Przekonwertuj go na 8-bitową skalę szarości, klikając: Typ &gt; obrazu &gt; 8-bitowy. UWAGA: Konwersja skali szarości minimalizuje artefakty kolorów i usprawnia analizę opartą na intensywności.</li>
	<li>Zmierz intensywność szarości obrazu 8-bitowego.<ol>
		<li>Ustaw pomiary, wybierając: Analizuj &gt; Ustaw pomiary; wybierz Obszar i Średnia wartość szarości.</li>
		<li>Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta, narysuj obszar zainteresowania (ROI) o jednolitym rozmiarze i zmierz intensywność szarości, wybierając pozycję Analizuj &gt; Zmierz lub naciskając Ctrl + M. UWAGA: We wszystkich próbkach należy zastosować ten sam rozmiar ROI. Bezwzględne wymiary ROI mogą się różnić w zależności od powiększenia i rozdzielczości uzyskanego obrazu, dlatego badacze powinni ustandaryzować rozmiar ROI w swoim zbiorze danych, aby zapewnić porównywalność. Każdy piksel na 8-bitowym obrazie w skali szarości ma wartość intensywności z zakresu od 0 do 255, gdzie 0 oznacza czystą czerń, 255 oznacza czystą biel, a wartości pomiędzy nimi reprezentują różne odcienie szarości.</li>
		<li>Aby zmniejszyć stronniczość, narysuj od trzech do pięciu ROI w anatomicznie spójnych obszarach mózgu we wszystkich próbkach. Unikaj regionów z artefaktami lub niespójnymi plamami. UWAGA: Spójność rozmieszczenia można osiągnąć, odwołując się do anatomicznych punktów orientacyjnych i upewniając się, że pozycjonowanie ROI jest symetryczne we wszystkich grupach eksperymentalnych.</li>
		<li>Uśrednij średnie wartości szarości z ROI dla każdego obrazu, aby uzyskać pojedynczą wartość intensywności na mózg. Użyj tej średniej do porównania statystycznego między grupami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-brain+barrier+overview+on+structure%2C+function%2C+impairment%2C+and+biomarkers+of+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).</li>
<li>Knox, E. G., Aburto, M. R., Clarke, G., Cryan, J. F., O'Driscoll, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+aging+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in aging and neurodegeneration.</a> Mol Psychiatry. 27 (6), 2659-2673 (2022).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nat Rev Neurol. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Kim, S., Jung, U. J., Kim, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crucial+role+of+the+blood-brain+barrier+in+neurodegenerative+diseases%3A+Mechanisms+of+disruption+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The crucial role of the blood-brain barrier in neurodegenerative diseases: Mechanisms of disruption and therapeutic implications.</a> J Clin Med. 14 (2), 386(2025).</li>
<li>Guarino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+modelling+human+blood-brain+barrier+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Advancements in modelling human blood-brain barrier on a chip.</a> Biofabrication. 15 (2), 022003(2023).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends Pharmacol Sci. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Eliceiri, B. P., Gonzalez, A. M., Baird, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliceiri%2C+BP+%22The+blood-brain+and+other+neural+barriers%3A+reviews+and+protocols%22">The blood-brain and other neural barriers: reviews and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+promising+in+vivo+model+for+assessing+the+delivery+of+natural+products%2C+fluorescence+dyes+and+drugs+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A promising in vivo model for assessing the delivery of natural products, fluorescence dyes and drugs across the blood-brain barrier.</a> Pharmacol Res. 125, 246-257 (2017).</li>
<li>Fleming, A., Diekmann, H., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+the+maturation+of+the+blood-brain+barrier+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of the maturation of the blood-brain barrier in larval zebrafish.</a> PLoS One. 8 (10), e77548(2013).</li>
<li>Kislyuk, S., van den Bosch, W., Adams, E., De Witte, P., Cabooter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+and+quantitative+capillary+LC-UV+method+to+study+the+uptake+of+pharmaceuticals+in+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive and quantitative capillary LC-UV method to study the uptake of pharmaceuticals in zebrafish brain.</a> Anal Bioanal Chem. 410, 2751-2764 (2018).</li>
<li>Jaffer, H., Adjei, I. M., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+to+map+blood-brain+barrier+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optical imaging to map blood-brain barrier leakage.</a> Sci Rep. 3 (1), 3117(2013).</li>
<li>Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+dye%3A+A+revisit+of+its+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evans blue dye: A revisit of its applications in biomedicine.</a> Contrast Media Mol Imaging. 2018 (1), 7628037(2018).</li>
<li>Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Evans+blue+dye+to+determine+blood-brain+barrier+integrity+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents.</a> Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).</li>
<li>Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+adult+zebrafish+model+of+Parkinson%27s+disease%3A+a+systematic+review+of+dynamic+changes+in+behavior+and+physiology+post-MPTP+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration.</a> Front Neurosci. 18, 1432102(2024).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> J Vis Exp. (108), e53617(2016).</li>
<li>Al-Bachari, S., Naish, J. H., Parker, G. J., Emsley, H. C., Parkes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+leakage+is+increased+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier leakage is increased in Parkinson's disease.</a> Front Physiol. 11, 593026(2020).</li>
<li>Gray, M. T., Woulfe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+blood-brain+barrier+permeability+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Striatal blood-brain barrier permeability in Parkinson's disease.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 747-750 (2015).</li>
<li>Hourfar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+%CE%B1-synuclein+aggregates+on+blood-brain+barrier+integrity+in+the+presence+of+neurovascular+unit+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">The impact of α-synuclein aggregates on blood-brain barrier integrity in the presence of neurovascular unit cells.</a> Int J Biol Macromol. 229, 305-320 (2023).</li>
<li>Olmedo-Díaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+altered+blood-brain+barrier+contributes+to+brain+iron+accumulation+and+neuroinflammation+in+the+6-OHDA+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An altered blood-brain barrier contributes to brain iron accumulation and neuroinflammation in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 362, 141-151 (2017).</li>
<li>Ravenstijn, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+blood-brain+barrier+transport+and+CNS+drug+metabolism+in+diseased+and+control+brain+after+intravenous+L-dopa+in+a+unilateral+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Evaluation of blood-brain barrier transport and CNS drug metabolism in diseased and control brain after intravenous L-dopa in a unilateral rat model of Parkinson's disease.</a> Fluids Barriers CNS. 9, 1-14 (2012).</li>
<li>Wu, Y. C., Sonninen, T. M., Peltonen, S., Koistinaho, J., Lehtonen, Š <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+and+neurodegenerative+diseases-modeling+with+iPSC-derived+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier and neurodegenerative diseases-modeling with iPSC-derived brain cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (14), 7710(2021).</li>
<li>Hosseini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+phenotypic+sex+classification+of+zebrafish+using+machine+learning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Efficient phenotypic sex classification of zebrafish using machine learning methods.</a> Ecol Evol. 9 (23), 13332-13343 (2019).</li>
<li>Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+requirement+of+tight+junction+proteins+in+blood-brain+barrier+function+and+their+role+in+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5601(2024).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+indoline+derivative+for+in+vivo+fluorescent+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel indoline derivative for in vivo fluorescent imaging of blood-brain barrier disruption in animal models.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Schoknecht, K., Eilers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-to-blood+transport+of+fluorescein+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Brain-to-blood transport of fluorescein in vitro.</a> Sci Rep. 14 (1), 25572(2024).</li>
<li>Harris, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+methods+for+imaging+blood-brain+barrier+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo methods for imaging blood-brain barrier function and dysfunction.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 50 (4), 1051-1083 (2023).</li>
<li>Hamilton, N., Allen, C., Reynolds, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+brain+studies+in+live+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI brain studies in live adult zebrafish.</a> NMR Biomed. 36 (7), e4891(2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ocena integralności bariery krew-mózg jest niezbędna do zrozumienia patofizjologii chorób związanych z mózgiem, ponieważ upośledzona bariera krew-mózg może zarówno powodować, jak i pogarszać postęp choroby4. Chociaż dorosły danio pręgowany okazał się skutecznym modelem do badania chorób neurodegeneracyjnych, metody oceny integralności BBB u tego gatunku pozostają słabo rozwinięte8. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia proste, opłacalne podejście do oceny przepuszczalności ...

Bariera krew-mózg (BBB) jest selektywnym, półprzepuszczalnym interfejsem fizjologicznym utworzonym głównie przez wyspecjalizowane komórki śródbłonka mózgu, wspierane przez perycyty i astrocyty, które regulują wymianę molekularną między krwiobiegiem a przestrzenią śródmiąższową mózgu w celu zachowania mikrośrodowiska ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Jego integralność jest niezbędna do zachowania homeostazy OUN i ochrony tkanki nerwowej przed szkodliwymi lub toksycznymi substancjami1. Przerwanie bariery krew-mózg jest dobrze rozpoznaną cechą patologiczną w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Parkinsona (PD), chorobie Alzheimera i stwardnieniu zanikowym bocznym 2,3. Upośledzona funkcja BBB prowadzi do zwiększonej przepuszczalności, umożliwiając związkom neurotoksycznym i mediatorom stanu zapalnego przenikanie do tkanki mózgowej, przyspieszając w ten sposób postęp choroby4. W związku z tym ocena integralności bariery krew-mózg ma kluczowe znaczenie dla uzyskania głębszego wglądu w mechanizmy nerwowo-naczyniowe i zapalne leżące u podstaw tych zaburzeń.
Podczas gdy modele gryzoni in vivo i in vitro pozostają złotymi standardami w badaniach BBB5, danio pręgowany (Danio rerio) stał się cennym modelem kręgowców w neurobiologii ze względu na ich podatność genetyczną, opłacalność, łatwość obsługi oraz zachowane cechy neuroanatomiczne i BBB u ssaków6. Pomimo ich coraz częstszego stosowania w badaniach neurodegeneracyjnych, metody oceny integralności bariery krew-mózg u dorosłych danio pręgowanych są nadal ograniczone 7,8. Techniki takie jak wstrzyknięcia znacznika fluorescencyjnego lub reportery transgeniczne są szeroko stosowane u larw 9,10, ale stanowią poważne wyzwanie u dorosłych ze względu na pigmentację i zmniejszoną przezroczystość. W związku z tym celem niniejszego badania jest ustanowienie prostego, powtarzalnego i wizualnie widocznego protokołu oceny przepuszczalności BBB u dorosłych ryb danio pręgowanego przy użyciu wynaczynienia barwnika Evan's Blue (EB). Metoda ta obejmuje zarówno obserwację jakościową, jak i ilościowy pomiar wycieku barwnika do tkanki mózgowej, zapewniając praktyczne narzędzie do oceny integralności nerwowo-naczyniowej w warunkach patologicznych.
Niebieski barwnik Evana, który wiąże się z albuminą surowicy i normalnie nie może przekroczyć nienaruszonego BBB11, stanowi realną alternatywę do oceny przerwania bariery12. Wynaczynienie EB jest szeroko stosowane w modelach gryzoni do wykrywania wycieku BBB w stanach takich jak urazowe uszkodzenie mózgu, udar i zapalenie nerwów13. Jednak jego zastosowanie u dorosłych danio pręgowanych pozostało w dużej mierze niezbadane. W niniejszym badaniu przedstawiono nowatorską adaptację techniki barwienia EB zoptymalizowaną dla dorosłych ryb danio pręgowanego, umożliwiającą wiarygodną jakościową i ilościową ocenę przepuszczalności BBB. Metoda jest opłacalna, wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu i może być łatwo skalowana dla wielu zwierząt, oferując praktyczną przewagę nad bardziej złożonymi podejściami opartymi na obrazowaniu, zwykle stosowanymi u larw.
Korzystając z tego protokołu, oceniliśmy integralność bariery krew-mózg zarówno u zdrowych, jak i dorosłych zebry z chorobą Parkinsona. Aby wywołać parkinsonizm u danio pręgowanego, neurotoksynę 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydynę (MPTP) podawano dootrzewnowo, zgodnie z wcześniej opisaną metodą14. Wyniki wykazały znacznie większe wynaczynienie EB w mózgach danio pręgowanego z chorobą Parkinsona, co jest zgodne z dobrze udokumentowanym zaburzeniem BBB obserwowanym w PD. Odkrycia te potwierdzają czułość i wiarygodność metody, potwierdzając jej przydatność w łączeniu patologii naczyniowej z wynikami molekularnymi i behawioralnymi. Technika ta stanowi zatem cenne narzędzie dla naukowców badających wkład układu nerwowo-naczyniowego w choroby neurodegeneracyjne i może być stosowana zarówno w modelach danio pręgowanego pod wpływem toksyn, jak i genetycznych.

<table><tbody><tr><td>Agaroza w proszku</td><td>Vivantis powiedział:</td><td>Zobacz materiał PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski barwnik Evana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Link do pobrania: https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.</td><td>HY-500M</td><td></td></tr><tr><td>Proszek paraformaldehydu (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P4417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Chemikalia HmbG</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Korporacja Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 0,45 i mikro; m</td><td>Merck Millipore&nbsp;</td><td>SLHV004SL</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez evana u dorosłych danio pręgowanych

Visualizing the Gatekeeper: Evan's Blue Dye-Based Assessment of Blood-Brain Barrier Permeability in Adult Zebrafish

Bariera krew-mózg (BBB) jest półprzepuszczalnym interfejsem, który utrzymuje homeostazę ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez regulację przepływu substancji do i z mózgu, chroniąc w ten sposób tkankę nerwową przed potencjalnie szkodliwymi czynnikami. Zaburzenie bariery krew-mózg jest dobrze znaną cechą wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona (PD) i choroby Alzheimera (AD), w których zwiększona przepuszczalność przyczynia się do postępu choroby i ją zaostrza. Chociaż dorosły danio pręgowany (Danio rerio) jest coraz częściej uznawany za cenny model do badania chorób neurodegeneracyjnych, ustandaryzowane metody oceny integralności BBB u tego gatunku pozostają ograniczone. Protokół ten opisuje proste, powtarzalne i opłacalne podejście do oceny przepuszczalności BBB u dorosłych ryb danio pręgowanego poprzez analizę wynaczynienia barwnika Evan's Blue (EB) z układu nerwowo-naczyniowego do tkanki mózgowej. Metoda łączy wizualizację jakościową z ilościową analizą obrazu rozkładu EB w celu wykrycia zaburzenia BBB. Kluczowe kroki obejmują prawidłowe dootrzewnowe wstrzyknięcie barwnika EB, potwierdzenie ogólnoustrojowego krążenia barwnika, staranną sekcję mózgu oraz spójne obrazowanie i pomiar intensywności skali szarości. Kontrole dodatnie i ujemne są włączane w celu walidacji penetracji barwnika i wsparcia dokładnej interpretacji. Reprezentatywne wyniki wskazują na większe wynaczynienie EB w mózgach danio pręgowanego z chorobą Parkinsona w porównaniu z grupą kontrolną, której wstrzyknięto sól fizjologiczną, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność BBB. Ta technika wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu i jest odpowiednia dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi praktyczne narzędzie do badania integralności bariery krew-mózg w modelach dorosłych danio pręgowanego i może być dostosowany do różnych zastosowań, w tym do badań mechanizmów chorobowych i oceny interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na funkcję nerwowo-naczyniową.

Protokół ten został przetestowany na modelu danio pręgowanego z chorobą Parkinsona. Upośledzenie bariery krew-mózg jest dobrze udokumentowanym zjawiskiem u pacjentów z chorobą Parkinsona 16,17,18 oraz w różnych modelach zwierzęcych choroby Parkinsona 19,20,21. Aby zbadać integralność BBB w modelu parkinsonowskim dorosłego danio pręgowan...

Protokół ten przedstawia wiarygodną metodę oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) w modelu dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu oceny Evana opartej na niebieskim barwniku, umożliwiając zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zaburzeń nerwowo-naczyniowych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

The Blood-Brain Barrier (BBB) is a semi-permeable interface that maintains central nervous system (CNS) homeostasis by regulating the movement of ...

Badania te koncentrują się na opracowaniu niezawodnej, prostej i opłacalnej metody oceny integralności bariery krew-mózg u dorosłych ryb danio pręgowanego. Większość badań nad danio pręgowanym nie ma łatwego, wiarygodnego sposobu pomiaru przerwania bariery krew-mózg, a istniejące metody są często skomplikowane lub kosztowne. Tak więc ten protokół oferuje praktyczne i niedrogie rozwiązanie.Protokół ten jest prosty, opłacalny i łączy w sobie zarówno analizę wizualną, jak i mierzalną, a wszystko to bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub skomplikowanych kroków. Zapewniając prosty, powtarzalny protokół, ułatwi to laboratoriom badanie zmian nerwowo-naczyniowych w modelach choroby dorosłego danio pręgowanego. Na początek znieczul danio pręgowanego, stopniowo obniżając temperaturę wody z 12 stopni Celsjusza do siedmiu stopni Celsjusza, aż ryba przestanie reagować na bodźce dotykowe.Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 31 wstrzyknij 20 mikrolitrów 1% błękitu Evansa lub barwnika EB do jamy dootrzewnowej ryby i delikatnie uciskaj miejsce wstrzyknięcia przez 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się. Teraz przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozwól na regenerację przez 30 minut. Monitoruj ryby pod kątem obrażeń, śmiertelności lub zmian w zachowaniu w tym czasie.W celu ustalenia kontroli dodatniej należy przygotować sterylną igłę o rozmiarze 31 dołączoną do strzykawki insulinowej w celu przeprowadzenia zabiegu urazu kłutego. Po 30-minutowym okresie rekonwalescencji ponownie znieczul rybę, jak pokazano wcześniej. Ustaw rybę pionowo na płaskiej, zimnej powierzchni, takiej jak okład z żelu lodowego.Wbić igłę w jedną stronę cefalonu pod kątem 90 stopni na głębokość nieprzekraczającą 1,5 milimetra. Następnie przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozwól jej dojść do siebie przez 30 minut. Po eutanazji ryby przez hipotermię użyj sterylnego ostrza lub nożyczek chirurgicznych, aby odciąć głowę uśpionej rybie.Opłucz głowę dwukrotnie w 1X PBS, używając proporcji 1:20 ryb do PBS, aby usunąć nadmiar krwi i niebieskiego barwnika Evansa. Następnie utrwalaj głowę w 4% paraformaldehydzie, używając ryby w stosunku 1:20 do utrwalacza i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Umieść nieruchomą głowę na czystej szalce Petriego i przeprowadź sekcję mózgu za pomocą pęsety ze spiczastym końcem.Stale dodawaj PBS kroplami podczas sekcji, aby utrzymać nawodnienie tkanki i zapobiec wysuszeniu. Wypłucz wypreparowany mózg dwukrotnie w dwóch oddzielnych kąpielach PBS i umieść tkankę na 1% płytce agarozowej, aby zatrzymać wilgoć i zapobiec kurczeniu się. Obserwuj wypreparowane tkanki mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym.Aby rozpocząć analizę ilościową, pobierz i zainstaluj oprogramowanie Fidżi i otwórz plik obrazu mózgu w Fidżi. Wykonaj dekonwolucję kolorów, wybierając Obraz, a następnie Kolor, Dekonwolucja kolorów i wybierz RGB. Spowoduje to powstanie trzech oddzielnych obrazów reprezentujących odcienie czerwonego, zielonego i niebieskiego.Teraz aktywuj obraz niebieskiego kanału, zwykle oznaczony jako Kolor 3, klikając obraz. Przekonwertuj go na 8-bitową skalę szarości, wybierając Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy. Następnie, aby zmierzyć intensywność szarości obrazu 8-bitowego, ustaw parametry pomiaru, wybierając Analizuj i Ustaw pomiary.Następnie wybierz obszar i średnią wartość szarości. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta, narysuj obszar zainteresowania o jednolitym rozmiarze i zmierz intensywność szarości, wybierając pozycję Analizuj, a następnie pozycję Zmierz. Normalny danio pręgowany wykazywał typowy brązowawy odcień skóry, a danio pręgowany, któremu wstrzyknięto EB, wykazywał zauważalny niebieskawy odcień.Aby zbadać integralność bariery krew-mózg w dorosłym modelu parkinsonowskim danio pręgowanego, porównano wynaczynienie barwnika EB do tkanek mózgowych między grupą kontrolną, której wstrzyknięto sól fizjologiczną, a danio pręgowanym z chorobą Parkinsona. W grupie kontroli negatywnej naczynia krwionośne w mózgu wydawały się czerwonawe, co wskazuje na brak wynaczynienia barwnika EB. W przeciwieństwie do tego, grupy kontrolne, kontrolne z wstrzyknięciem soli fizjologicznej, kontrole pozytywnej i grupy parkinsonowskiej wykazywały niebieskawe zabarwienie w naczyniach naczyniowych mózgu, potwierdzając udane krążenie ogólnoustrojowe barwnika EB.Wypreparowane mózgi z grupy kontroli ujemnej wydawały się białawe z wyraźnie widocznymi naczyniami krwionośnymi, co potwierdza brak barwienia EB. W grupie z urazem kontroli pozytywnej intensywne niebieskie zabarwienie otaczające tkankę mózgową wskazywało na wyciek barwnika z powodu celowego przerwania bariery krew-mózg. W grupie, której wstrzyknięto sól fizjologiczną, barwienie EB pozostało ograniczone do naczyń krwionośnych, co wskazuje na nienaruszoną barierę krew-mózg.Grupa z chorobą Parkinsona wykazywała ciemniejszy, bardziej rozproszony niebieski wzór barwienia, wskazujący na znaczny wyciek barwnika EB i naruszenie bariery krew-mózg. Ilościowa analiza skali szarości wykazała znacznie niższe wartości intensywności szarości w grupie z chorobą Parkinsona w porównaniu z grupą wstrzykiwaną solą fizjologiczną.

visualizing-gatekeeper-evan-s-blue-dye-based-assessment-blood-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru przepuszczalności mózgu zarodkowego rybki zebrafish u żywego zwierzęcia. Technika ta analizuje zdolność do zatrzymywania płynu mózgowo-rdzeniowego oraz cząsteczek o różnej masie cząsteczkowej w świetle rurki nerwowej i ilościowo określa ich przemieszczanie się poza komory mózgu. Metoda ta jest przydatna do określania różnic w przepuszczalności i dojrzewaniu nabłonka podczas rozwoju oraz w przebiegu chorób.

Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Ten film demonstruje procedurę oceny przerwania bariery krew-mózg w mysim modelu EAE. Barwniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach są wstrzykiwane po ortopie i krążą w naczyniach krwionośnych mózgu. Mniejszy barwnik przecieka przez szczeliny do tkanki mózgowej, podczas gdy większy barwnik dostaje się tylko wtedy, gdy zakłócenie jest poważne, co koreluje z zakresem uszkodzenia bariery.

Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

Zakłócenie bariery krew-mózg pomaga w dostarczaniu niektórych leków do mózgu. Mannitol podawany dotętniczo obkurcza komórki otaczające naczynia krwionośne w celu fizycznego przerwania bariery.

Szczurzy model przerwania bariery krew-mózg w celu umożliwienia ukierunkowanych terapii nerwowo-naczyniowych

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.

Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Poznaj metodę oceny przepuszczalności bariery krew-mózg u dorosłych danio pręgowanych z wykorzystaniem niebieskiego barwnika Evansa. Protokół umożliwia jakościową i ilościową analizę uszkodzeń naczyniowych w modelach chorób neurologicznych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów