Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Badania te koncentrują się na opracowaniu niezawodnej, prostej i opłacalnej metody oceny integralności bariery krew-mózg u dorosłych ryb danio pręgowanego. Większość badań nad danio pręgowanym nie ma łatwego, wiarygodnego sposobu pomiaru przerwania bariery krew-mózg, a istniejące metody są często skomplikowane lub kosztowne. Tak więc ten protokół oferuje praktyczne i niedrogie rozwiązanie.

Protokół ten jest prosty, opłacalny i łączy w sobie zarówno analizę wizualną, jak i mierzalną, a wszystko to bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub skomplikowanych kroków. Zapewniając prosty, powtarzalny protokół, ułatwi to laboratoriom badanie zmian nerwowo-naczyniowych w modelach choroby dorosłego danio pręgowanego. Na początek znieczul danio pręgowanego, stopniowo obniżając temperaturę wody z 12 stopni Celsjusza do siedmiu stopni Celsjusza, aż ryba przestanie reagować na bodźce dotykowe.

Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 31 wstrzyknij 20 mikrolitrów 1% błękitu Evansa lub barwnika EB do jamy dootrzewnowej ryby i delikatnie uciskaj miejsce wstrzyknięcia przez 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się. Teraz przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozwól na regenerację przez 30 minut. Monitoruj ryby pod kątem obrażeń, śmiertelności lub zmian w zachowaniu w tym czasie.

W celu ustalenia kontroli dodatniej należy przygotować sterylną igłę o rozmiarze 31 dołączoną do strzykawki insulinowej w celu przeprowadzenia zabiegu urazu kłutego. Po 30-minutowym okresie rekonwalescencji ponownie znieczul rybę, jak pokazano wcześniej. Ustaw rybę pionowo na płaskiej, zimnej powierzchni, takiej jak okład z żelu lodowego.

Wbić igłę w jedną stronę cefalonu pod kątem 90 stopni na głębokość nieprzekraczającą 1,5 milimetra. Następnie przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego i pozwól jej dojść do siebie przez 30 minut. Po eutanazji ryby przez hipotermię użyj sterylnego ostrza lub nożyczek chirurgicznych, aby odciąć głowę uśpionej rybie.

Opłucz głowę dwukrotnie w 1X PBS, używając proporcji 1:20 ryb do PBS, aby usunąć nadmiar krwi i niebieskiego barwnika Evansa. Następnie utrwalaj głowę w 4% paraformaldehydzie, używając ryby w stosunku 1:20 do utrwalacza i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Umieść nieruchomą głowę na czystej szalce Petriego i przeprowadź sekcję mózgu za pomocą pęsety ze spiczastym końcem.

Stale dodawaj PBS kroplami podczas sekcji, aby utrzymać nawodnienie tkanki i zapobiec wysuszeniu. Wypłucz wypreparowany mózg dwukrotnie w dwóch oddzielnych kąpielach PBS i umieść tkankę na 1% płytce agarozowej, aby zatrzymać wilgoć i zapobiec kurczeniu się. Obserwuj wypreparowane tkanki mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym.

Aby rozpocząć analizę ilościową, pobierz i zainstaluj oprogramowanie Fidżi i otwórz plik obrazu mózgu w Fidżi. Wykonaj dekonwolucję kolorów, wybierając Obraz, a następnie Kolor, Dekonwolucja kolorów i wybierz RGB. Spowoduje to powstanie trzech oddzielnych obrazów reprezentujących odcienie czerwonego, zielonego i niebieskiego.

Teraz aktywuj obraz niebieskiego kanału, zwykle oznaczony jako Kolor 3, klikając obraz. Przekonwertuj go na 8-bitową skalę szarości, wybierając Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy. Następnie, aby zmierzyć intensywność szarości obrazu 8-bitowego, ustaw parametry pomiaru, wybierając Analizuj i Ustaw pomiary.

Następnie wybierz obszar i średnią wartość szarości. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokąta, narysuj obszar zainteresowania o jednolitym rozmiarze i zmierz intensywność szarości, wybierając pozycję Analizuj, a następnie pozycję Zmierz. Normalny danio pręgowany wykazywał typowy brązowawy odcień skóry, a danio pręgowany, któremu wstrzyknięto EB, wykazywał zauważalny niebieskawy odcień.

Aby zbadać integralność bariery krew-mózg w dorosłym modelu parkinsonowskim danio pręgowanego, porównano wynaczynienie barwnika EB do tkanek mózgowych między grupą kontrolną, której wstrzyknięto sól fizjologiczną, a danio pręgowanym z chorobą Parkinsona. W grupie kontroli negatywnej naczynia krwionośne w mózgu wydawały się czerwonawe, co wskazuje na brak wynaczynienia barwnika EB. W przeciwieństwie do tego, grupy kontrolne, kontrolne z wstrzyknięciem soli fizjologicznej, kontrole pozytywnej i grupy parkinsonowskiej wykazywały niebieskawe zabarwienie w naczyniach naczyniowych mózgu, potwierdzając udane krążenie ogólnoustrojowe barwnika EB.

Wypreparowane mózgi z grupy kontroli ujemnej wydawały się białawe z wyraźnie widocznymi naczyniami krwionośnymi, co potwierdza brak barwienia EB. W grupie z urazem kontroli pozytywnej intensywne niebieskie zabarwienie otaczające tkankę mózgową wskazywało na wyciek barwnika z powodu celowego przerwania bariery krew-mózg. W grupie, której wstrzyknięto sól fizjologiczną, barwienie EB pozostało ograniczone do naczyń krwionośnych, co wskazuje na nienaruszoną barierę krew-mózg.

Grupa z chorobą Parkinsona wykazywała ciemniejszy, bardziej rozproszony niebieski wzór barwienia, wskazujący na znaczny wyciek barwnika EB i naruszenie bariery krew-mózg. Ilościowa analiza skali szarości wykazała znacznie niższe wartości intensywności szarości w grupie z chorobą Parkinsona w porównaniu z grupą wstrzykiwaną solą fizjologiczną.