Name: Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnej mutagenezy fagowej z wykorzystaniem enzymu NgTET i systemu CRISPR-Cas. Technika ta umożliwia bezszwową modyfikację DNA bakteriofagów dla zastosowań w terapii fagowej i biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten otrzymał dofinansowanie Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG; SPP 2330 numer projektu 464500427, RTG 2355 projekt 11 i RTG 2937 (numer projektu 505997786) od Towarzystwa Maxa Plancka (finansowanie Lidera Grupy Badawczej Maxa Plancka dla K.H.).

<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

KH i NP złożyły europejski wniosek patentowy na "Inżynierię fagów", Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 23 175 257.7. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Badanie to przedstawia solidną i elastyczną strategię wprowadzania precyzyjnych mutacji punktowych do genomów bakteriofagów, w tym zmian pojedynczych nukleotydów. Centralnym elementem przepływu pracy jest integracja rygorystycznych etapów walidacji na każdym etapie, co ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia zarówno dokładności, jak i wydajności edycji genomu. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę wieloetapowy charakter przepływu pracy i dynamiczne interakcje między fagami a ich gospodarzami bakteryjnymi, które w...

Bakteriofagi to wirusy, które atakują bakterie. Wzbudziły one duże zainteresowanie naukowców ze względu na ich ogromny potencjał w biotechnologii i medycynie, szczególnie w walce z bakteriami wielolekoopornymi 1,2,3. Mimo to biologia fagów pozostaje stosunkowo słabo zbadana. Głębsze zrozumienie ich molekularnych mechanizmów przejmowania kontroli nad bakteryjnymi gospodarzami jest niezbędne, aby w pełni wykorzystać ich potencjał terapeutyczny i biotechnologiczny4. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw skutecznego zakażenia fagami, a następnie zmodyfikować fagi pod kątem konkretnych zastosowań, niezbędna jest możliwość genetycznej modyfikacji genomów fagów. Pozostaje jednak jednym z najważniejszych wyzwań w dziedzinie biologii fagów 3,5,6.
DNA faga jest często modyfikowane przez specyficzne zmiany chemiczne zasad purynowych i pirymidynowych, np. glikozylację cytozyny i metylację. Modyfikacje te chronią materiał genetyczny fagów przed rozpoznaniem i degradacją przez nukleazy gospodarza6. Chociaż modyfikacje te mają kluczowe znaczenie dla sprawności fagów, stanowią one istotną przeszkodę dla podejść inżynierii genomu fagów, które opierają się na systemach celowania w DNA 2,3,7.
Istniejące strategie mutagenezy, w tym systemy modyfikacji restrykcji i technologie oparte na białkach Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) i CRISPR-associated (Cas), stoją przed poważnymi wyzwaniami podczas modyfikacji DNA fagów ze względu na ochronne modyfikacje epigenetyczne, takie jak glikozylacja cytozyny8. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas, która jest wysoce skuteczna w komórkach bakteryjnych i eukariotycznych, opiera się na dwóch kluczowych etapach: precyzyjnym rozszczepieniu DNA w docelowych loci genomu przez nukleazę Cas, a następnie naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną z DNA dawcy niosącym pożądaną mutację1. Jednak w fagach modyfikacje DNA często uniemożliwiają nukleazy Cas skuteczne wiązanie lub rozszczepianie genomu. Ponadto szybki i przejściowy charakter replikacji fagów może dodatkowo ograniczać skuteczność rekombinacji homologicznej. Bariery te sprawiają, że szczególnie trudno jest zastosować technologię CRISPR-Cas ukierunkowaną na DNA do mutagenezy fagów. Wykazano, że modyfikacje DNA fagów upośledzają celowanie w DNA fagów za pomocą CRISPR-Cas zarówno in vitro, jak i in vivo 6,7.
Aby sprostać wyzwaniom związanym z ochronnymi modyfikacjami DNA w fagach, wprowadzamy strategię mutagenezy genomu, która wykorzystuje aktywność dioksygenazy metylocytozyny translokacji dziesięciu jedenastu (TET), w szczególności NgTET. U eukariontów enzymy TET katalizują stopniowe utlenianie metylowanej cytozyny poprzez procesy iteracyjne: metylocytozyna (5mdC) jest najpierw przekształcana w hydroksymetylocytozynę (5hmdC), następnie w formylocytozynę (5fdC), a na końcu w karboksycytozynę (5cadC) (Figura 1).
W naszym podejściu do mutagenezy fagowej NgTET jest stosowany w celu tymczasowego zmniejszenia obfitości ochronnych modyfikacji DNA, zwiększając w ten sposób dostępność DNA fagów do narzędzi do edycji genomu, takich jak enzymy Cas9. NgTET został wybrany do modulacji genomu bakteriofaga ze względu na wcześniejsze doniesienia o jego udanej ekspresji w aktywnej rozpuszczalnej formie u heterologicznego gospodarza bakteryjnego, w szczególności E. coli. Ta właściwość jest niezbędna, ponieważ NgTET musi pozostać aktywny podczas infekcji fagowej10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Rysunek 1: Stopniowe utlenianie 5-metylocytozyny przez dioksygenazę TET1. Dioksygenaza TET katalizuje sukcesywne utlenianie 5-metylo-2'-deoksycytydyny (5mdC) do 5hmdC, 5-formylo-2'-deoksycytydyny (5fdC) i ostatecznie do 5-karboksylo-2'-deoksycytydyny (5cadC). Produkt końcowy, 5cadC, spontanicznie lub enzymatycznie powraca do niezmodyfikowanej cytozyny (dC), przyczyniając się w ten sposób do dynamicznej regulacji epigenetycznej. Ten wieloetapowy proces ma kluczowe znaczenie dla aktywnej metylacji DNA u eukariontów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Ponieważ metylocytozyna i hydroksymetylocytozyna są powszechnymi prekursorami hipermodyfikacji DNA fagów, w tym masywnych struktur ochronnych, takich jak glikozylacje, aktywność oksydacyjna dioksygenazy TET może być wykorzystana do zapobiegania tworzeniu się tych hipermodyfikacji DNA9. W tym podejściu do mutagenezy genomu opartym na TET heterologicznie eksprymujemy NgTET rekombinacyjnie w E. coli w celu utlenienia hydroksymetylowanych cytozyn w genomie faga po zakażeniu, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się dużej ilości glikozylacji. Zmniejszając obfitość tych masywnych modyfikacji DNA, nasze podejście może zwiększyć dostępność DNA fagów do nukleaz CRISPR-Cas. Ta zwiększona dostępność ułatwia skuteczne rozpoznawanie celów, precyzyjne rozszczepianie DNA i wprowadzanie bezbliznowych mutacji punktowych do genomu faga, odróżniając je od tradycyjnych metod mutagenezy fagowej, które opierają się na delecjach genów, insercjach genów reporterowych lub integracji sztucznych połączeń w celu selekcji mutantów na podstawie PCR 1,11. Te konwencjonalne strategie były do tej pory jedynymi dostępnymi narzędziami do ukierunkowanej mutagenezy w genomach fagów i dlatego stanowią ważną podstawę dla przedstawionej tutaj metody. Jednak białka jednofagowe mogą pełnić wiele funkcji. Delecja całego genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania zakłóca wszystkie związane z tym funkcje. Natomiast celowe wprowadzanie mutacji punktowych pozwala na selektywną inaktywację określonych funkcji, umożliwiając szczegółową analizę ich ról. Do tej pory funkcje wielu białek fagowych pozostają w dużej mierze niescharakteryzowane; W ten sposób możemy przeoczyć dodatkowe działania związane z danym genem. Dlatego preferowane jest minimalistyczne podejście, które ma na celu usunięcie tylko jednej funkcji przy jednoczesnym spowodowaniu minimalnych zmian w całym białku12,13. Opisana tutaj metoda umożliwia precyzyjne modyfikacje genetyczne bez zakłócania ogólnej organizacji lub funkcji genomu. Innym poważnym wyzwaniem związanym z poprzednimi metodami mutagenezy fagowej była ich niska skuteczność, która zazwyczaj prowadziła do tempa mutacji wynoszącego około 0,1%1,11. Dzięki tej technice przedstawiamy pierwszą strategię mutagenezy, która jest w stanie wprowadzić zmiany w pojedynczym kodonie, osiągając zauważalny siedmiokrotny wzrost skuteczności celowania. Dzięki połączeniu z wysokoprzepustową metodą przesiewową opartą na ONT, wykrywanie mutacji punktowych jest uproszczone, eliminując potrzebę badań przesiewowych dużych populacji fagów w celu wyizolowania jednego mutanta. Opisana tutaj strategia mutagenezy opartej na TET rozwiązuje długotrwałe ograniczenie w tej dziedzinie i umożliwia bardziej wiarygodną edycję genomu14.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana nie tylko do pogłębienia naszej wiedzy na temat mechanizmów infekcji bakteriofagowych, ale jest również bardzo obiecująca dla biologii syntetycznej. Umożliwiając precyzyjną i wydajną inżynierię genomu fagów, toruje drogę do dostosowania fagów do konkretnych zastosowań, zwiększając w ten sposób ich potencjał w zastosowaniach biotechnologicznych i medycznych.

<table><tbody><tr><td>Probówki reakcyjne 1,5 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kanocjalne 15 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki polipropylenowe o pojemności 15 ml</td><td>Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (do ultrawirowania)</td></tr><tr><td>Probówki kanoniczne 50 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor GC</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x Barwnik ładujący DNA TriTrack&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Czynnik R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarozy</td><td>Meridian BIOLOGIA</td><td>BIO-41025 powiedział:</td><td>Klasa molekularna</td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-30I</td><td>Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Kwas borowy&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>Czynnik chłodniczy R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Heksahydrat chlorku wapnia</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, ekstra czysty&nbsp;</td></tr><tr><td>Miernik gęstości komórek</td><td>Harvard Biochrom&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Firma VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał D4540</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-sodowy</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Klasa farmaceutyczna</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety Pasteura</td><td>Firma VWR</td><td>612-1702</td><td>230 milimetr</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&mikro; L</td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP (po 10 mM dNTP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Produkt własny.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Konstrukt plazmidowy zawierający CRISPR-Cas12/ModA sgRNA</td></tr><tr><td>DS-spCas (system CRISPR-Cas9)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (numer akcesorium AddGene)</td><td>Plazmid do budowy plazmidów CRISPR-Cas zawierających przekładki (system CRISPR-Cas9) do mutagenezy fagowej (krok 3.2)</td></tr><tr><td>Szczep E. coli B został użyty do zakażenia T4</td><td>Komunikacja DSMZ</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani i Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Szczep ekspresyjny, kompetentna komórka</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Szczep ekspresji, kompetentne komórki.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Szczep klonujący, kompetentne komórki</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Szczep klonujący, kompetentne komórki.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (bezwzględny)&nbsp;</td><td>Firma VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Komórka przepływowa Flongle</td><td>Technologie Oxford Nanopore</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>R10.4.1. chemia, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Zestaw minipreparatu plazmidu Gene JET&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus drabinka DNA</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Zobacz materiał SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR Drabinka DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Zobacz materiał SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz gradientu 108</td><td>BIOCOMP</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Pico 17</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Infors HT Minitron</td><td>Infors AG</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Carla Rotha</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth</td><td>Zobacz materiał X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>Zobacz materiał X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie MinION&nbsp;</td><td>Technologie Oxfrod Nanopore</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>Identyfikator IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Forward starter do wprowadzenia mutacji punktowej dla ModA E165A i wprowadzenia lepkich końcówek do klonowania Golden Gate (Krok 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>Identyfikator IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Odwrotny starter do wprowadzenia mutacji punktowej dla ModA E165A i do wprowadzenia lepkich końcówek do klonowania Golden Gate (Krok 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>Identyfikator IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Starter do generowania przekładki dla systemów CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 do mutagenezy fagowej i kontrselekcji (krok 3.2 i krok 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>Identyfikator IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Odwrotny starter do generowania przekładki dla systemów CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 do mutagenezy i kontrselekcji fagów (krok 3.2 i krok 4.1)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop ND-1000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw NucleoMag&nbsp;</td><td>Machery Nagel</td><td>REF 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do trawienia nukleozydów&nbsp;</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>Zobacz materiał M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (system CRISPR-Cas13)</td><td>Addgene powiedział:</td><td>186236 (numer akcesorium AddGene)</td><td>System kodowania plazmidowego CRISPR-Cas13 do kontrselekcji (krok 4.1)</td></tr><tr><td>Plazmid pCpfl-sp (system CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene powiedział:</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pCpfl-sp (system CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene powiedział:</td><td>122186 (numer akcesorium AddGene)</td><td>Plazmid do budowy plazmidów CRISPR-Cas zawierających przekładki (system CRISPR-Cas12) do mutagenezy fagowej (krok 3.2)</td></tr><tr><td>Naczynia reakcyjne PCR</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqZIELONY</td><td>Firma VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Produkt własny.</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>Plazmid jest dostępny na życzenie, mapę plazmidu można znaleźć pod następującymi https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Produkt własny.</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>Plazmid do budowy pET28a_NgTET_donor DNA metodą klonowania Golden Gate (krok 3.1), plazmid&nbsp; jest dostępny na żądanie, mapę plazmidu można znaleźć pod następującymi https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm z krzywkami</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&mikro; L</td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monopodstawowy</td></tr><tr><td>Uniwersalny zasilacz PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromierz Quantus, system dsDNA QuantiFluor</td><td>Preparat Promega</td><td>E2670 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>EN0551</td><td>zmieszać 2 mg/ml RNazy A 5000 U/ml RNazy T1&nbsp;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I do ekstrakcji DNA&nbsp;</td><td>Carla Rotha</td><td>Zobacz materiał X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 Zestaw do sekwencjonowania ligacji</td><td>Technologie Oxford Nanopore</td><td>Brak katalogu&nbsp; numer</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Filtry Steritop, 0,22 i mikro; m Wielkość porów</td><td>Milipory</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 ml i 500 ml</td></tr><tr><td>Streptomycyna 50 mg/L</td><td>Carla Rotha</td><td>Zobacz materiał HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Sakroza</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>dla biologii molekularnej&nbsp;</td></tr><tr><td>Aluminiowy wirnik wahadłowy&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza 5 U/&mikro; L</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>EL0011 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ligazy DNA T4</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Zobacz materiał B69</td><td></td></tr><tr><td>Probówki o grubych ściankach, bez oprawek</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Termocykler, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Komfort termomiksera&nbsp;</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wanna wannowa, VWB2&nbsp;</td><td>Firma VWR</td><td>462-0557</td><td>Pojemność 12 l</td></tr></tbody></table>

precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów crispr-cas wspomaganych nget

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Bakteriofagi, wirusy, które atakują swoich gospodarzy bakteryjnych, mają znaczny potencjał w biotechnologii i medycynie, zwłaszcza w zwalczaniu zakażeń wielolekoopornych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw infekcji fagowej pozostają w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Precyzyjna, specyficzna dla miejsca mutageneza fagów jest potężnym narzędziem do wyjaśniania funkcji genów i interakcji-gospodarz.
Jednak głównym wyzwaniem w mutagenezie genomu fagów jest obecność modyfikacji DNA fagów, które zakłócają konwencjonalne narzędzia do edycji genomu, takie jak CRISPR-Cas. 
Chociaż systemy CRISPR-Cas są z powodzeniem stosowane do ukierunkowanej mutagenezy w różnych organizmach, ich skuteczność w mutagenezie fagów jest często ograniczona przez modyfikacje DNA, takie jak glikozylacja cytozyny. Aby pokonać tę barierę, opracowaliśmy skuteczną metodę, która tymczasowo zmniejsza obfitość modyfikacji DNA fagów, umożliwiając skuteczne celowanie w CRISPR-Cas i precyzyjne wprowadzanie mutacji do genomów fagów. W szczególności używamy dioksygenazy metylocytozyny Ten Eleven Translocation (TET) z Naegleria gruberi (NgTET), która iteracyjnie demodyfikuje metylowane i hydroksymetylowane cytozyny w DNA. Poprzez utlenianie hydroksymetylowanych cytozyn w DNA faga, NgTET zapobiega późniejszym modyfikacjom cytozyny, takim jak glikozylacja, i znacznie zwiększa skuteczność rozszczepienia DNA za pośrednictwem Cas.
Podsumowując, przedstawione tutaj bezbliznowe i precyzyjne podejście do edycji genomu umożliwia skuteczne wprowadzanie mutacji punktowych przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury genów w genomach fagów. Zachowując nienaruszone ramy transkrypcyjne i translacyjne, metoda ta minimalizuje niezamierzone zakłócenia w złożonych sieciach regulacyjnych. Jest to szczególnie ważne dla badań nad niezbędnymi lub wielofunkcyjnymi białkami fagowymi. Możliwość generowania ukierunkowanych modyfikacji genetycznych bez wprowadzania obcych sekwencji znacznie rozszerza eksperymentalny zestaw narzędzi do biologii fagów. Strategia ta nie tylko ułatwia szczegółowe badania funkcjonalne, ale także zwiększa potencjał racjonalnej inżynierii fagów do zastosowań terapeutycznych i biotechnologicznych.

Identyfikacja pasma faga w gradiencie. Widoczność pasma faga w gradiencie zależy od stężenia faga w początkowej próbce załadowanej na gradient. Gdy jest wystarczająco skoncentrowany (~&gt;1 × 1011 PFU/ml), pasmo można wyraźnie zobaczyć, oświetlając gradient od dołu źródłem światła (patrz rysunek 3).
Jednak przy niskich stężeniach fagów pasmo może nie być łatwo widoczne. W takim przypadku zalecamy powtórzenie próby wizualizacji poprze...

W tym miejscu przedstawiamy protokół redukcji modyfikacji DNA w bakteriofagach za pomocą enzymu NgRET, umożliwiający skuteczną i pozbawioną blizn mutagenezę CRISPR-Cas. Metoda ta ułatwia inżynierię genetyczną fagów do zastosowań w biotechnologii i terapii fagowej.

Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

Badamy infekcję fagową na poziomie molekularnym. To jest naprawdę fundamentalna nauka. Jednak nie zajmujemy się tylko nauką podstawową, ale chcemy również przełożyć tę podstawową naukę na zastosowania, w których wykorzystujemy tę wiedzę do badania infekcji fagowych i wykorzystywania jej do inżynierii fagowej oraz do zastosowań terapeutycznych.Jednym z najnowszych osiągnięć w dziedzinie badań nad fagami jest odkrycie bakteryjnego układu odpornościowego. Ten układ odpornościowy jest obecny we wszystkich bakteriach i zidentyfikowały lub wygenerowały narzędzia do prawdziwej walki z fagiem. Jednak jest dość sprytny.był również w stanie zidentyfikować narzędzia i opracować narzędzia, które pozwalają mu uciec przed tymi układami odpornościowymi. Jednym z narzędzi jest modyfikacja jego DNA poprzez modyfikację. Jest to szczególnie interesujące dla nas, ponieważ badanie chemicznej natury tych modyfikacji DNA, które fagi wygenerowały, aby uciec przed układem odpornościowym, jest naprawdę interesujące, a także pozwala nam stać się narzędziem do inżynierii faga na końcu.W ciągu ostatnich 10 lat wspaniali koledzy z całego świata opracowali wspaniałe technologie. Jedną z tych technologii jest na przykład sekwencjonowanie nowej generacji. Opierając się na tej technologii, możemy naprawdę sekwencjonować fagi, ale także całe genomy gospodarza na poziomie molekularnym.Z drugiej strony rozwinęła się spektrometria mas, coś w rodzaju proteomiki. CRISPR to wspaniałe narzędzie, które jest obecnie stosowane w różnych królestwach życia. Używamy tego również do inżynierii genomu fagów.To tylko kilka wspaniałych technologii, które zmieniły sposób, w jaki dziś myślimy o fagach. Kiedy mówimy o obecnych wyzwaniach, jednym z wyzwań, które widzimy, jest inżynieria bio CRISPR genomu faga. Genom faga jest całkowicie zmodyfikowany za pomocą modyfikacji DNA, a jądrowe ACE CRISPR w rzeczywistości nie są w stanie rozszczepić DNA.Jest to więc wyzwanie, któremu musimy sprostać, jeśli chcemy zmodyfikować genomy fagów bakteryjnych. Moja grupa odkryła zupełnie nowy budulec RNA. Odkryliśmy, że określone transkrypty przenoszą się na swoim pięciu głównych końcach, tak zwane widmo redoks, krótki NAD dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, i odkryliśmy to również niedawno, po raz pierwszy w interakcjach fagowych E-coli T4.Opierając się na tym odkryciu, stwierdziliśmy również, że RNA i białka mogą wchodzić ze sobą w interakcje w zupełnie nowy sposób. Odkryliśmy, że ten NAD, który opisałem wcześniej, działa jak klej molekułowy, łącząc ze sobą RNA i białka. Ta euligacja RNA jest całkowicie nowym sposobem interakcji RNA i białek w naturze.Dokonaliśmy tego odkrycia w ekologicznej interakcji antyfagowej. Obecnie zależy nam również na przełożeniu tej podstawowej nauki na zastosowania, na przykład w dziedzinie terapii opartej na RNA. Na początek potraktuj 500 mikrolitrów zawiesiny fagowej 20 jednostkami DNA 1.Dodaj dwa mikrolitry RNA AT1 zmieszane do probówki. Inkubować mieszaninę poddaną działaniu substancji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie załaduj 500 mikrolitrów poddanego działaniu roztworu faga na przygotowany gradient sacharozy.Odwirować gradient przy 70 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zapal probówkę wirówkową od dołu, aby uwidocznić mętne pasmo fagów w gradiencie. Następnie za pomocą kaniuli ostrożnie usuń frakcję zawierającą do nowej ultra probówki do ultrawirowania.Teraz dodaj 30 mililitrów lodowatego buforu TM do probówki i odwiruj. Następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu TM po odrzuceniu supernatantu. Zawieszone fagi należy przechowywać przez noc w szklanej fiolce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodać jeden mikrogram proteinazy K do zawieszonych fagów. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość mieszaniny chloroformu fenolowego i alkoholu izoamylowego do próbki.Odwróć, aby dobrze wymieszać i odwirować. Przenieś fazę wodną do nowej probówki reakcyjnej i powtórz ekstrakcję trzy razy. Wykonać trzy ekstrakcje zwrotne chloroformu, używając równej objętości chloroformu, aby usunąć resztki fenolu.Następnie wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,5 i 2,5 objętości etanolu. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia odwiruj próbkę o sile 15 000 G przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać granulki DNA.Umyj osad DNA dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Delikatnie potrząśnij probówką i ponownie odwiruj. Ostrożnie usunąć supernatant.Następnie zreusuj oczyszczone DNA w ultraczystej wodzie. Przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Zaszczepić komórki Escherichia coli BL 21D 3, które są transformowane zarówno plazmidem PET 28 NGTet, jak i plazmidem o ekspresji CAS 12 lub CAS 9.Hoduj kulturę na podłożu LB z uzupełnieniem odpowiednich antybiotyków w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Indukować ekspresję NG TED, dodając 0,05 milimolowego IPTG i inkubować przez dodatkowe dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jako kontrolę porównaj szczepy E.coli BL 21 D3 z nadekspresją NgTET i bez niej.Przenieś 300 mikrolitrów kultur E. coli do sterylnej probówki. Zakażon kulturę fagiem typu dzikiego T4 lub potraktowanym NgTET przy wielokrotności infekcji 0,01. Delikatnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie faga, a następnie ponownie inkubuj.Dodaj mieszaninę fagów bakteryjnych do czterech mililitrów miękkiego ślimaka LB zawierającego 0,75% świdra i antybiotyki. Wymieszaj dokładnie, ale delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Wlej miękką mieszankę ślimaka na rozgrzaną płytę ślimaka LB.Pozwól płytce na chwilę zestalić się w temperaturze pokojowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia policz płytki, aby określić liczbę jednostek tworzących płytkę. W celu wyboru licznika należy zainfekować E. coli cast 13 A spacer za pomocą fagów, które mają być wybrane w kontrataku.Dokonaj wyboru licznika w tych samych warunkach, które są używane do mutagenezy. Po inkubacji przefiltruj natant SUP przez filtr 0,45 mikrometra, aby usunąć resztki bakteryjne. Użyj wybranych przez licznik i przefiltrowanych fagów do testu płytki na szczepie E. coli B, aby wyizolować poszczególne płytki w celu dalszej walidacji.Pasmo faga było wyraźnie widoczne, gdy próbka faga T4 była wystarczająco zagęszczona. Ekspresja białka NgTET w E. coli została potwierdzona przez faga SDS, który wykazał swoją obecność zarówno w rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych frakcjach po lizie komórek i odwirowaniu. Chromatogramy wykazały, że względna obfitość dioksiadenozyny, dijodohydroksychinoliny i tymidyny pozostała niezmieniona między DNA fagowym T4 typu dzikiego a DNA fagowym traktowanym NgTET.Obfitość zmodyfikowanych pochodnych cytozyny została znacznie zmniejszona w DNA faga traktowanym NgTET w porównaniu z próbką nietraktowaną lekomi. Plazmid zawierający gen NgTET i regiony homologiczne dla ukierunkowanej mutagenezy został skonstruowany przy użyciu klonowania Golden Gate. Badania przesiewowe PCR potwierdziły pomyślną amplifikację docelowej klaczy genowej na pasach od drugiego do dziewiątego żelu agros, wskazując na pozytywne trafienia wśród pobranych blaszek.W DNA fagów typu dzikiego T4 względna obfitość 5 glikozylohydroksyetylo2 prime deoksydydyny była wysoka. W DNA faga T4 traktowanego NgTET poziomy 5-glikozylohydroksyetylo-2 pierwotnej deoksydydyny były znacznie obniżone w porównaniu z typem dzikim. DNA faga T4 potraktowane katalitycznie nieaktywnym mutantem NgTET D234 A utrzymywało wysoki poziom 5 glikolhydroksyetylo2 pierwszej deoksydydyny.Odzyskane potomstwo faga T 4 wykazało prawie przywrócone poziomy 5 hydroksymetylo-2 prime deoksydydyny w porównaniu z typem dzikim.

precise-phage-mutagenesis-with-ngtet-assisted-crispr-cas-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Tutaj prezentujemy protokół optymalizujący CRISPR-Cas9 w celu osiągnięcia wyższej specyficzności bez utraty aktywności na miejscu. Używamy podejścia ukierunkowanej ewolucji zwanego Sniper-screen, aby znaleźć zmutowanego Cas9 o pożądanych cechach. Sniper-Cas9 jest kompatybilny ze skróconymi pojedynczymi przewodnikami RNA i dostarczaniem w formacie rybonukleoproteiny, dobrze znanymi strategiami osiągania wyższej specyficzności.

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Poznaj metodę precyzyjnej mutagenezy fagowej z wykorzystaniem enzymu NgTET i systemu CRISPR-Cas. Technika ta umożliwia bezszwową modyfikację DNA bakteriofagów dla zastosowań w terapii fagowej i biotechnologii.

Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Przeglądaj więcej filmów