Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Badamy infekcję fagową na poziomie molekularnym. To jest naprawdę fundamentalna nauka. Jednak nie zajmujemy się tylko nauką podstawową, ale chcemy również przełożyć tę podstawową naukę na zastosowania, w których wykorzystujemy tę wiedzę do badania infekcji fagowych i wykorzystywania jej do inżynierii fagowej oraz do zastosowań terapeutycznych.

Jednym z najnowszych osiągnięć w dziedzinie badań nad fagami jest odkrycie bakteryjnego układu odpornościowego. Ten układ odpornościowy jest obecny we wszystkich bakteriach i zidentyfikowały lub wygenerowały narzędzia do prawdziwej walki z fagiem. Jednak jest dość sprytny.

był również w stanie zidentyfikować narzędzia i opracować narzędzia, które pozwalają mu uciec przed tymi układami odpornościowymi. Jednym z narzędzi jest modyfikacja jego DNA poprzez modyfikację. Jest to szczególnie interesujące dla nas, ponieważ badanie chemicznej natury tych modyfikacji DNA, które fagi wygenerowały, aby uciec przed układem odpornościowym, jest naprawdę interesujące, a także pozwala nam stać się narzędziem do inżynierii faga na końcu.

W ciągu ostatnich 10 lat wspaniali koledzy z całego świata opracowali wspaniałe technologie. Jedną z tych technologii jest na przykład sekwencjonowanie nowej generacji. Opierając się na tej technologii, możemy naprawdę sekwencjonować fagi, ale także całe genomy gospodarza na poziomie molekularnym.

Z drugiej strony rozwinęła się spektrometria mas, coś w rodzaju proteomiki. CRISPR to wspaniałe narzędzie, które jest obecnie stosowane w różnych królestwach życia. Używamy tego również do inżynierii genomu fagów.

To tylko kilka wspaniałych technologii, które zmieniły sposób, w jaki dziś myślimy o fagach. Kiedy mówimy o obecnych wyzwaniach, jednym z wyzwań, które widzimy, jest inżynieria bio CRISPR genomu faga. Genom faga jest całkowicie zmodyfikowany za pomocą modyfikacji DNA, a jądrowe ACE CRISPR w rzeczywistości nie są w stanie rozszczepić DNA.

Jest to więc wyzwanie, któremu musimy sprostać, jeśli chcemy zmodyfikować genomy fagów bakteryjnych. Moja grupa odkryła zupełnie nowy budulec RNA. Odkryliśmy, że określone transkrypty przenoszą się na swoim pięciu głównych końcach, tak zwane widmo redoks, krótki NAD dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, i odkryliśmy to również niedawno, po raz pierwszy w interakcjach fagowych E-coli T4.

Opierając się na tym odkryciu, stwierdziliśmy również, że RNA i białka mogą wchodzić ze sobą w interakcje w zupełnie nowy sposób. Odkryliśmy, że ten NAD, który opisałem wcześniej, działa jak klej molekułowy, łącząc ze sobą RNA i białka. Ta euligacja RNA jest całkowicie nowym sposobem interakcji RNA i białek w naturze.

Dokonaliśmy tego odkrycia w ekologicznej interakcji antyfagowej. Obecnie zależy nam również na przełożeniu tej podstawowej nauki na zastosowania, na przykład w dziedzinie terapii opartej na RNA. Na początek potraktuj 500 mikrolitrów zawiesiny fagowej 20 jednostkami DNA 1.

Dodaj dwa mikrolitry RNA AT1 zmieszane do probówki. Inkubować mieszaninę poddaną działaniu substancji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie załaduj 500 mikrolitrów poddanego działaniu roztworu faga na przygotowany gradient sacharozy.

Odwirować gradient przy 70 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zapal probówkę wirówkową od dołu, aby uwidocznić mętne pasmo fagów w gradiencie. Następnie za pomocą kaniuli ostrożnie usuń frakcję zawierającą do nowej ultra probówki do ultrawirowania.

Teraz dodaj 30 mililitrów lodowatego buforu TM do probówki i odwiruj. Następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu TM po odrzuceniu supernatantu. Zawieszone fagi należy przechowywać przez noc w szklanej fiolce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dodać jeden mikrogram proteinazy K do zawieszonych fagów. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość mieszaniny chloroformu fenolowego i alkoholu izoamylowego do próbki.

Odwróć, aby dobrze wymieszać i odwirować. Przenieś fazę wodną do nowej probówki reakcyjnej i powtórz ekstrakcję trzy razy. Wykonać trzy ekstrakcje zwrotne chloroformu, używając równej objętości chloroformu, aby usunąć resztki fenolu.

Następnie wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,5 i 2,5 objętości etanolu. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia odwiruj próbkę o sile 15 000 G przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać granulki DNA.

Umyj osad DNA dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Delikatnie potrząśnij probówką i ponownie odwiruj. Ostrożnie usunąć supernatant.

Następnie zreusuj oczyszczone DNA w ultraczystej wodzie. Przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Zaszczepić komórki Escherichia coli BL 21D 3, które są transformowane zarówno plazmidem PET 28 NGTet, jak i plazmidem o ekspresji CAS 12 lub CAS 9.

Hoduj kulturę na podłożu LB z uzupełnieniem odpowiednich antybiotyków w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Indukować ekspresję NG TED, dodając 0,05 milimolowego IPTG i inkubować przez dodatkowe dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jako kontrolę porównaj szczepy E.coli BL 21 D3 z nadekspresją NgTET i bez niej.

Przenieś 300 mikrolitrów kultur E. coli do sterylnej probówki. Zakażon kulturę fagiem typu dzikiego T4 lub potraktowanym NgTET przy wielokrotności infekcji 0,01. Delikatnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie faga, a następnie ponownie inkubuj.

Dodaj mieszaninę fagów bakteryjnych do czterech mililitrów miękkiego ślimaka LB zawierającego 0,75% świdra i antybiotyki. Wymieszaj dokładnie, ale delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Wlej miękką mieszankę ślimaka na rozgrzaną płytę ślimaka LB.

Pozwól płytce na chwilę zestalić się w temperaturze pokojowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia policz płytki, aby określić liczbę jednostek tworzących płytkę. W celu wyboru licznika należy zainfekować E. coli cast 13 A spacer za pomocą fagów, które mają być wybrane w kontrataku.

Dokonaj wyboru licznika w tych samych warunkach, które są używane do mutagenezy. Po inkubacji przefiltruj natant SUP przez filtr 0,45 mikrometra, aby usunąć resztki bakteryjne. Użyj wybranych przez licznik i przefiltrowanych fagów do testu płytki na szczepie E. coli B, aby wyizolować poszczególne płytki w celu dalszej walidacji.

Pasmo faga było wyraźnie widoczne, gdy próbka faga T4 była wystarczająco zagęszczona. Ekspresja białka NgTET w E. coli została potwierdzona przez faga SDS, który wykazał swoją obecność zarówno w rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych frakcjach po lizie komórek i odwirowaniu. Chromatogramy wykazały, że względna obfitość dioksiadenozyny, dijodohydroksychinoliny i tymidyny pozostała niezmieniona między DNA fagowym T4 typu dzikiego a DNA fagowym traktowanym NgTET.

Obfitość zmodyfikowanych pochodnych cytozyny została znacznie zmniejszona w DNA faga traktowanym NgTET w porównaniu z próbką nietraktowaną lekomi. Plazmid zawierający gen NgTET i regiony homologiczne dla ukierunkowanej mutagenezy został skonstruowany przy użyciu klonowania Golden Gate. Badania przesiewowe PCR potwierdziły pomyślną amplifikację docelowej klaczy genowej na pasach od drugiego do dziewiątego żelu agros, wskazując na pozytywne trafienia wśród pobranych blaszek.

W DNA fagów typu dzikiego T4 względna obfitość 5 glikozylohydroksyetylo2 prime deoksydydyny była wysoka. W DNA faga T4 traktowanego NgTET poziomy 5-glikozylohydroksyetylo-2 pierwotnej deoksydydyny były znacznie obniżone w porównaniu z typem dzikim. DNA faga T4 potraktowane katalitycznie nieaktywnym mutantem NgTET D234 A utrzymywało wysoki poziom 5 glikolhydroksyetylo2 pierwszej deoksydydyny.

Odzyskane potomstwo faga T 4 wykazało prawie przywrócone poziomy 5 hydroksymetylo-2 prime deoksydydyny w porównaniu z typem dzikim.