Pomiar starzenia pojedynczych komórek za pomocą biomarkera chromatyny i epigenetycznego starzenia się opartego na obrazowaniu
30 stycznia 2026
Protokół przedstawia proces obrazowania i obliczeniowy do wyodrębniania i weryfikacji chromatyny oraz epigenetycznego wieku (ImAge) opartego na obrazowaniu.
Opracowaliśmy chromatynę opartą na obrazowaniu oraz epigenetyczne obrazowanie wieku, nowatorską technikę mającą na celu ilościowe określenie starzenia i odmładzania w rozdzielczości pojedynczych komórek. Zegary metylacji DNA szacują wiek biologiczny, ale zależą od regresji liniowej, wymagają dużych grup i niszczą próbki, co czyni je kosztownymi i nieodpowiednimi do badań na dużą skalę lub podłużnych. Na początek przenieś zamrożone organy i tkanki do wcześniej schłodzonej zaprawy umieszczonej na suchym lodzie.
Wlej ciekły azot na zamrożoną tkankę i dokładnie ją zmiel, używając wcześniej schłodzonej tłuczka, aż uzyskasz jednolity drobny proszek. Za pomocą wcześniej schłodzonej metalowej łopatki połącz tkankę mieloną na kilka rurek. Po wyodrębnieniu jąder wymieszaj je z trypanowym niebieskim w równych proporcjach w osobnej tubie.
Przelej 10 mikrolitrów mieszaniny do hemocytometru lub załaduj ją do automatycznego licznika komórek. Wprowadź i zweryfikuj wszystkie metadane, w tym identyfikatory próbek, warunki i biomarkery w mapie tablicy oraz wyeksportuj plik CSV. Teraz podano 10 000 jąder na odwiert w objętości 20 do 30 mikrolitrów na płytkę o pojemności 384 dołków.
Wiruj płytę przy 1000g, z przyspieszeniem ustawionym na dziewięć i zwolnieniem cztery, przez 10 minut przy czterech stopniach Celsjusza. Następnie ustabilizuj jądra, dodając równą objętość 8% paradehydu i PBS, i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu utrwalacza dodaj 30 mikrolitrów glicyny 0,1 molowej do PBS i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Usuń roztwór glicyny i przemyj doły dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS. Usuń PBS z każdego dołka i dodaj 30 mikrolitrów roztworu blokującego zawierającego 2% BSA i 0,5% Triton X-100 w PBS. Inkubuj talerz przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu roztworu blokującego inkubuj próbkę z 25 mikrolitrami pierwotnego roztworu przeciwciał w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj studnie trzy razy 100 mikrolitrami PBS, każde płukanie trwa trzy minuty w temperaturze pokojowej. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przemyj studnie trzy razy 100 mikrolitrami PBS, każde płukanie trwa trzy minuty w temperaturze pokojowej. Barw jądra DAPI lub Hoechst, dodając 30 mikrolitrów barwnika w stężeniu 0,01 miligrama na mililitr, a następnie raz umyj płytkę 100 mikrolitrami PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Pobierz skrypty workflow z repozytorium GitHub.
Po zakończeniu pobrania rozpakuj plik, aby rozpakować jego zawartość. Zorganizuj sklonowane repozytorium obrazów tak, aby struktura folderów odpowiadała formatowi zakładanemu przez workflow do prawidłowego wykonywania skryptów. Następnie otwórz aplikację Terminal, jeśli działasz na Linuksie lub Mac OS, albo aplikację WSL, jeśli korzystasz z Windows.
Zmień katalog roboczy na sklonowany folder repozytorium, wpisując wymagane polecenie w terminalu i naciskając Enter. Utwórz nowe środowisko obliczeniowe o nazwie Image_workflow używając Conda z Pythonem w wersji 3.10 i naciśnij Enter. Aktywuj nowo utworzone środowisko Conda za pomocą polecenia aktywuj Image_workflow.
Zainstaluj Poetry, menedżera pakietów w Pythonie, w aktywowanym środowisku za pomocą instalatora PIP. Następnie zainstaluj wszystkie niezbędne pakiety Pythona wymagane do workflow za pomocą Poetry. Teraz skonfiguruj CUDA w środowisku Conda, aby umożliwić funkcjonalność jednostki graficznej podczas etapu segmentacji.
Otwórz aplikację Terminal i zmień folder na sklonowany. Aktywuj środowisko Conda, wpisując poniższe polecenie i naciskając Enter. Otwórz główny plik workflow w edytorze kodu lub tekstu, takim jak VS Code lub Notepad, aby skonfigurować parametry analizy.
Ustaw nazwę projektu, przypisując zmienną p do krótkiego bezpiecznego identyfikatora systemu plików używanego do organizacji wyników. Ustaw listę kanałów do wyodrębniania cech w CHS, w tym kanał segmentacji, jeśli cechy z tego kanału są wymagane. Używając ImageIndex i etykiety kanału jako klucza, odwzoruj identyfikator kanału obrazu z nazw plików na dokładny nagłówek kolumny mapy tablicy zapisany wcześniej na wielka i wielka litera.
Następnie ustaw lokalizacje danych, przypisując orgDataLoadPath do trasy zbioru danych, orgDataSubfolder do podfolderu obrazu, jeśli to konieczne, oraz resultsSavePath do trasy wyjściowej. Potwierdź rozszerzenie nazwy pliku w pliku imageFileFormat. Następnie edytuję imageFileRegEx, aby używać grup przechwytujących w Pythonie dla wymaganych części, w tym wiersza, kolumny, pola, pozycji Z i kanału.
Teraz ustaw kanał segmentacyjny w segmentation_ch na kanał jądrowy używany do wykrywania obiektów. Zdecyduj, czy użyć korekcji iluminacji, ustawiając illumiCorrection i ustawiając na true, aby obliczyć i zastosować podstawowe modele. Następnie w voxel_dim ustaw fizyczny rozmiar woksela w mikrometrach jako ZYX za pomocą metadanych mikroskopowych.
Zapisz plik i zamknij edytor po weryfikacji każdego parametru. Na koniec uruchom skrypt workflow, aby uzyskać odczyty obrazów i wykonać walidację, utrzymując terminal otwarty podczas działania skryptu. Wizualizuj wyniki i eksportuj odczyty obrazów RAW do dodatkowej analizy w oprogramowaniu zewnętrznym.
Reprezentatywne obrazy indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych wykazały wyraźnie oddzielone jądra barwione DAPI, trimetylowany histon H3 przy lizynie 27 oraz acetylowany histon H3 przy lizynie 27. Analiza obrazów wątroby i mięśni szkieletowych wykazała istotną różnicę między młodymi a starszymi próbkami, przy czym stare myszy OSKM wykazywały mniejszy obraz w porównaniu ze starymi, co wskazuje na częściowe przeprogramowanie. Analiza pojedynczych zwierząt wykazała, że niektóre stare próbki OSKM wykazywały znacząco obniżone wartości obrazów w porównaniu ze starymi myszami.
Protokół ten umożliwia badaczom badanie zmian związanych z wiekiem w organizacji chromatyny i epigenetycznej z rozdzielczością pojedynczych komórek w różnych typach komórek i tkankach. Nasza metoda oparta na obrazowaniu jest niedestrukcyjna, zachowuje strukturę chromatyny, umożliwia powtarzane pomiary i jest bardziej opłacalna w badaniach na dużą skalę lub podłużnych. Przyszłe badania będą koncentrować się na dodawaniu większej liczby markerów epigenetycznych oraz badaniu struktur wewnątrzjądrowych związanych ze starzeniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje przebieg obrazowania i analizy obliczeniowej w celu wyodrębnienia i walidacji wieku epigenetycznego oraz organizacji chromatyny na podstawie obrazowania (ImAge). Technika ta umożliwia ilościowe określenie procesów starzenia i odmładzania z rozdzielczością pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
Wprowadzenie
- Tradycyjne zegary metylacji DNA szacują wiek biologiczny, lecz opierają się na regresji liniowej.
- Obecne metody wymagają dużych kohort i często prowadzą do zniszczenia próbek.
- Ograniczenia te sprawiają, że są one kosztowne i nieprzydatne w badaniach wielkoskalowych lub podłużnych.
Cel badania
- Opracowanie nowej techniki kwantyfikacji starzenia się z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Zapewnienie alternatywy dla istniejących metod szacowania wieku biologicznego.
Zastosowane metody
- Przenieś zamrożone organy i tkanki do schłodzonego wcześniej moździerza umieszczonego na suchym lodzie.
- Rozcieraj zamrożoną tkankę z ciekłym azotem, aż do uzyskania drobnego proszku.
- Podziel rozcieraną tkankę na mniejsze porcje i przelej do wielu probówek.
- Wyizoluj jądra komórkowe i zmieszaj je z błękitem trypanowym w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Technika oparta na obrazowaniu umożliwia szczegółową analizę chromatyny i wieku epigenetycznego.
- Zapewnia ona bardziej wydajną i mniej destrukcyjną metodę szacowania wieku biologicznego.
Wnioski
- Technika ImAge stanowi obiecującą alternatywę w badaniu procesów starzenia i odmładzania.
- Umożliwia ona badaczom prowadzenie szeroko zakrojonych badań podłużnych bez niszczenia próbek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja wieku biologicznego w rozdzielczości pojedynczych komórek jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka we wczesnych etapach programów długowieczności i odmładzania. Protokół ImAge umożliwia niedestrukcyjną, wysokoprzepustową ocenę starzenia się chromatyny i zmian epigenetycznych, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad interwencjami. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną oraz pozwala na efektywną selekcję projektów w portfelu terapeutyków modyfikujących wiek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na mechanizmy starzenia się chromatyny i epigenetyki.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych interwencji odmładzających na poziomie pojedynczych komórek.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka poprzez ilościowe określanie odwrócenia lub przyspieszenia starzenia się w odpowiedzi na zastosowane terapie eksperymentalne.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wdrażania celów modyfikujących starzenie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane testy obrazowania pojedynczych komórek do późniejszych etapów przepływu pracy w przesiewaniu związków.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne odczyty zmian stanu chromatyny i epigenetyki.
- Umożliwia skalowalną, niedestrukcyjną analizę odpowiednią do badań podłużnych i badań na dużych kohortach.
- Wspiera standaryzację testów i ponowne wykorzystanie platformy w różnych typach tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki biomarkerów z pojedynczych komórek z fenotypami funkcjonalnymi, takimi jak aktywność lokomotoryczna.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację strategii odmładzania.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i ilościowe wskaźniki wieku biologicznego.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów dla badań nad interwencjami związanymi z wiekiem.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Protokół ImAge integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz dostosowanie translacyjnych biomarkerów dla interwencji modyfikujących wiek.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie zmian w chromatynie i epigenetyce w celu wyjaśnienia szlaków starzenia się oraz efektów interwencji.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty z pojedynczych komórek do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Generuje zwalidowane biomarkery oparte na obrazowaniu oraz porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy molekularne sygnatury starzenia się z wynikami funkcjonalnymi i punktami końcowymi w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku potok obrazowania i obliczeń, który można dostosować do wielu tkanek i interwencji.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmów w badaniach nad starzeniem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę starzenia na poziomie pojedynczych komórek za pomocą skalowalnych, nieniszczących przebiegów pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie wiarygodnych decyzji typu go/no-go oraz kapitałowo efektywne rozwijanie programów odmładzania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na terapeutyki modyfikujące wiek w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu wysokoprzepustowym (high-content imaging) oraz analizie obliczeniowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej mikroskopii i infrastruktury obliczeniowej z wykorzystaniem jednostek GPU.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji obrazowania i zarządzania metadanymi pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych tkanek i typów komórek poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od wysokiej jakości przygotowania próbek i obrazowania w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
