Name: Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj modelowanie niedotlenienia i reoxygenacji w komórkach nabłonka rurkowego nerek. Ta metoda pozwala ocenić markery uszkodzeń nerek oraz funkcję mitochondrialną w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mariano Marin-Blazquez należy do "Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud" Katolickiego Uniwersytetu w Murcji (UCAM). Prace w grupie Rubena Rabadan-Rosa i Rubena Zapaty-Pereza są wspierane grantem od Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Proyectos de Generación de Conocimiento 2023 (PID2023-147560OA-I00). Ruben Rabadán-Ros jest wspierany grantem od Fundación Séneca - Agencia de Ciencia y Tecnología de la Región de Murcia (22524/JLI/24, Ayudas a Proyectos para la Generación de Nuevo Liderazgo Científico Jóvenes Líderes en Investigación 2024). R.Z.-P. jest częścią programu badawczo-innowacyjnego Horyzont Europy (NADIS - 101073251) Unii Europejskiej. Alessandra Tammaro jest finansowana przez grant NWO-FAPESP na Healthy Ageing realizowany przez Zonmw (nr 457002002) oraz grant Junior Talent od Nierstichting.
Autorzy z wdzięcznością dziękują Universidad de Murcia (UM) oraz Universidad Católica de Murcia (UCAM) za udostępnienie swoich obiektów, gdzie nagrywano nagrania wideo.

Komórki użyte w tym protokole nie zostały wyizolowane w kontekście tego badania. Wcześniej zostały wyizolowane i udostępnione przez innych badaczy35. W związku z tym nie przeprowadzono nowych eksperymentów na zwierzętach i nie wymagano zatwierdzenia etycznego dla obecnych prac.
1. Kultura IM-PTEC
<ol>
	<li>Przygotuj medium L3 zgodnie z Tabelą 1.</li>
	<li>Rozmroz fiolkę z IM-PTEC. Hodować około 1 x 106 komórek w temperaturze 33 °C w nawilżonym inkubatorze w warunkach standardowych (5%CO2, atmosferyczneO2) do 80% połączenia (zwykle osiągnięte po 3 dniach). UWAGA: IM-PTEC są izolowane od myszy Immorto. Szczegółowy protokół dotyczący izolacji IM-PTEC można znaleźć wartykule 35.</li>
	<li>Podhodowla komórek 2 razy w tygodniu, w proporcji około 1:10. Do przepuszczania odłącz przylegającą warstwę monowarstwową przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA na 2-3 minuty w 33 °C, zneutralizuj pełnym podłożem do wzrostu i ponownie zasiew w świeżych kolbach hodowlanych.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ilość/Końcowa koncentracja ośrodka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum łydki płodu (FCS)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina</td>
			<td>10 000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycyna</td>
			<td>10 000 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>0,02 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenit sodu</td>
			<td>5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trijodotyronina</td>
			<td>40 pg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrokortyzon</td>
			<td>36 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czynnik wzrostu naskórka</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon γ (IFN-γ)</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Kompozycja medium L3.
2. Kultura restrykcyjna IM-PTEC
<ol>
	<li>Subkultura, jak opisano w kroku 1.3, oraz przenieść całą zawiesinę ogniwa z jednej kolby T-25 z IM-PTEC do kolby T-75 zawierającej około 10 mL medium L3 bez interferonu-γ (IFN-γ). Hodować w temperaturze 37 °C w standardowych warunkach aż do 80% zbiórki (zwykle osiągniętej po 3 dniach).</li>
	<li>Podhodowla, jak opisano w kroku 1.3, oraz przenieść całą zawiesinę ogniwa z jednej kolby T-75 do dwóch kolb T-175 zawierających około 20 mL pożywki L3 bez IFN-γ. Hodować w temperaturze 37 °C w standardowych warunkach aż do 80% zbiórki (zwykle osiągniętej po 3 dniach).</li>
	<li>Płyty IM-PTEC do eksperymentów poprzez odłączenie komórek od konfluentnych hodowli przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA, ponowne zawieszenie ich w pełnym nośniku i zasiewanie z pożądaną gęstością (około 1 x 105). Do analizy ekspresji markerów molekularnych używaj płytek 6-dołkowych lub mikropłyt hodowli komórek z 96 dołkami odpowiednich do badań oddychania mitochondrialnego. UWAGA: W innych eksperymentach należy stosować odpowiedni format hodowli.<ol>
		<li>Podczas powlekania komórek w mikropłytce z 96 dołkami do badań oddechu mitochondrialnego pozostaw cztery dołki w narożnikach, aby wykorzystać je jako korekcję tła. Pozostawić mikropłytkę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem jej w inkubatorze, aby komórki mogły się ustabilizować.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura hipoksji/reoxygenacji (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Odświeżaj IM-PTEC, usuwając podłoże hodowlane i dodając świeże medium L3 bez IFN-γ (0,1 mL/dołek dla płyt 96-dołkowych lub 2 mL/dołek dla płyt 6-dołowych). Umieść komórki w inkubatorze hipoksji w temperaturze 1%O2, 5%CO2, w 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Usuń komórki z inkubatora hipoksji i odśwież je medium L3 bez IFN-γ. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej w standardowych warunkachO2 i 5%CO2 w 37 °C przez 24 godziny. UWAGA: Warunki hipoksyjne można osiągnąć za pomocą inkubatora hipoksji lub modułowej komory hipoksji podłączonej do kontrolowanego zasilania gazem.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69077/69077fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie modelu in vitro H/R w uwiecznionych bliskich komórkach nabłonkowych rurkowych (IM-PTEC). IM-PTEC pochodzące z myszy transgenicznych H-2Kb-tsA58 (Immorto) były hodowane w warunkach normoksycznych, narażone na hipoksję (1% 02, 48 h), a następnie ponownie natlenione (standardowe warunkiO2, 24 godziny), w celu analizy odczytu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69077/69077fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
4. Analiza ekspresji markerów molekularnych
<ol>
	<li>Izolacja RNA<ol>
		<li>Dodaj 800 μL odczynnika izolacyjnego RNA do każdej dołki płyty 6-dołkowej. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś próbki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL wolnych od RNA.</li>
		<li>Dodaj 200 μL chloroformu i dobrze wymieszaj przez 15 sekund przez pipetowanie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.</li>
		<li>Wirować w 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 12 minut. Przenieś wodną fazę górną do wolnej od RNAse rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodaj 500 μL izopropanolu. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wiruj w 12 000 x g w 4 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Usuń supernatant i umyj granulkę 1 mL 70% etanolu. Wirować w 5 000 x g w 4 °C przez 5 minut. Usuń nadmiar.</li>
		<li>Susz granulat na powietrzu. Rozpuszcz granulkę w 12 μL wody wolnej od RNAs.</li>
		<li>Podgrzej próbkę w temperaturze 56 °C przez 15 minut. Zmierz stężenie RNA w mikroobjętościowym spektrofotometrze UV-Vis. UWAGA: Zawsze trzymaj próbki w lodzie między etapami inkubacji, aby uniknąć degradacji RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transkrypcja odwrotna<ol>
		<li>Na lodzie dodaj następujące składniki reakcji do rurki mikrowirówki wolnej od RNAse 0,2 mL: 10 μL mieszanki głównej (2x), 2 μL mieszanki enzymacyjnej, 1-5 μg RNA oraz do 20 μL H2O wolnej od nukleazy.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 25 °C przez 10 minut, a następnie inkubuj w 50-55 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Dezaktywuj reakcję, podgrzewając ją w 85 °C przez 5 minut i schłodz na lodzie. Rozcieńcz cDNA w proporcjach 1:5 lub 1:10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)<ol>
		<li>Przygotuj zestawy podkładów, mieszając je w końcowym stężeniu 10 μM (Tabela 2).</li>
		<li>Aby każdy gen mógł zmierzyć, przygotuj mieszankę qPCR w czasie rzeczywistym (RT) zawierającą następujące odczynniki na dołek: 5 μL RT-qPCR Master Mix; 0,4 μL 10 μM zapalnika przedniego, 0,4 μL zapalnika odwrotnego 10 μM oraz 2,2 μL beznukleazowego H2O.</li>
		<li>Dodaj 8 μL mieszanki RT-qPCR do każdej studni płytki PCR z 384 dołkami. Do każdego dołka dodaj 2 μL próbki cDNA, pozostawiając kroplę na krawędzi dołka.</li>
		<li>Po dodaniu wszystkich próbek delikatnie stukaj w płytkę, aż wszystkie krople spadną do dołków. Szczelnie uszczelnij płytę membraną. Obróć płytkę PCR z 384 dołkami.</li>
		<li>Mierz w systemie RT qPCR z następującym programem: 98 °C przez 30 s, 40 cykli po 98 °C przez 10 s, a następnie 60 °C przez 30 s, oraz krzywa topnienia w 95 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene</td>
			<td>Sekwencje pierwsze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim-1</td>
			<td>F: 5' - TGGTTGCCTTCCGTGTCTCT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: 5' - TCAGCTCGGGAATGCACAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Ngal</td>
			<td>F: 5' - ATGTCACCTCCATCCTGGTCAG </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: 5' - GCCACTTGCACATTGTAGCTCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Acta2</td>
			<td>N: 5' - GCCATCTTTCATTGGGATGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: 5' - CCCCTGACAGGACGTGTTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Col1a1</td>
			<td>N: 5' - CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: 5' - CAGAAGGACCTTGTTTTTGCCAGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sekwencje pierwsze używane w RT-qPCR.
5. Ocena funkcji oddechowych mitochondriów
<ol>
	<li>Dzień przed badaniem<ol>
		<li>Włącz analizator szybkości zużywania tlenu (OCR)/szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR) i pozwól mu się rozgrzać co najmniej 5 godzin przed eksperymentem.</li>
		<li>Nawadnij wkład czujnikowy w temperaturze 37 °C w inkubatorze bezCO2 na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień testu<ol>
		<li>Przygotuj podłoże testowe dla jednej mikropłytki z 96-dołkami zawierającą: 33,4 mL podłoża DMEM o pH 7,4; 0,875 mL glukozy 1 M (końcowe stężenie 25 mM); 0,35 mL pirogroiganianu 100 mM (końcowe stężenie 1 mM); oraz 0,35 mL glutaminy 200 mM (końcowe stężenie 2 mM).</li>
		<li>Przygotuj roztwory inhibitorowe zgodnie z Tabelą 3.</li>
		<li>Wyjmij złożony wkład czujnikowy z inkubatora. Załaduj 25 μL każdego inhibitora do odpowiadającego mu portu za pomocą pipety wielokanałowej i prowadnicy ładowania.</li>
		<li>Usuń pożywkę wzrostu hodowli komórkowej z mikropłytki hodowli komórkowej. Dodaj 175 μL podgrzanego (37 °C) medium do każdego otworu za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Umieść mikropłytę hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C bezCO2 na 45-60 minut przed badaniem.</li>
		<li>Umieść płytkę kalibracyjną z załadowanym wkładem sensora do analizatora OCR/ECAR w celu kalibracji.</li>
		<li>Umieść mikropłytkę hodowli komórkowej w przyrządzie do pomiaru.</li>
		<li>Po przeprowadzeniu zachowaj mikropłytę hodowli komórkowej do ilościowego określenia całkowitego białka do normalizacji danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>[Nabój] (μM)</td>
			<td>[Średni test testowy] (μM)</td>
			<td>Port A</td>
			<td>Port B</td>
			<td>Port C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomicyna</td>
			<td>12</td>
			<td>1.5</td>
			<td>8,4 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>6,3 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antymycyna A</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>12.5</td>
			<td>1.25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,75 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium testowe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3,5 mL</td>
			<td>3,5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Roztwory hamujące do oceny oddychania mitochondrialnego.

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów związanych z ujawnieniem tego dzieła

Większość danych przedklinicznych dotyczących AKI indukowanej nerkami IRI pochodzi z modeli in vivo 50, 51, 52, 53, ze względu na brak ustalonych modeli in vitro. To, w połączeniu z ograniczoną dostępnością dobrze scharakteryzowanych, uwiecznionych na mysach znieśmiertelnych linii nabłonkowych, ogranicza badania in vitro, czyniąc rozwój tego protokołu cennym zasobem. Ta metoda zapewnia bardziej dostępną i powtarzalną platformę do badania mechanizmów urazów H/R nerek w warunkach kontrolowanych, jednocześnie zmniejszając potrzebę stosowania zwierząt.
Ponadto protokół ten w dużej mierze wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny, ułatwiając jego wdrożenie bez potrzeby stosowania specjalistycznych i kosztownych instrumentów. Jedynym wyjątkiem jest wymóg posiadania inkubatora hipoksji, który zazwyczaj jest dostępny w laboratoriach badań onkologicznych do odtwarzania mikrośrodowisk nowotworowych niedotlenionych 54,55,56. Ta dostępność wspiera szerszą adaptację i promuje powtarzalność w różnych laboratoriach.
Kluczowym aspektem tego protokołu jest właściwa kultura IM-PTEC. Komórki muszą być hodowane w temperaturze 33 °C i uzupełniane IFN-γ, aby uniknąć obniżenia aktywności SV40. Przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych IM-PTEC są następnie przesuwane do warunków restrykcyjnych na 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentów. Hodowla restrykcyjna odbywa się poprzez podniesienie temperatury do 37 °C i usunięcie interferon-gamma (IFN-γ) z podłoża na 1 tydzień, co zmniejsza ekspresję antygenu SV40 o dużym T – białko wirusowe kodowane przez wirusa małpi 40, używane do uwiecznienia komórek35,57 – powodujące utratę statusu uwiecznienia komórek oraz promowanie bardziej zróżnicowanego i fizjologicznie istotnego fenotypu58. Warto zauważyć, że IM-PTEC mogą rozwijać wyraźne cytoplazmatyczne wakuole po kilku dniach hodowli; Jeśli dojdzie do wakuolacji, należy pominąć hydroksykortyzon z pożywki hodowlanej, aby zapobiec lub odwrócić tę zmianę.
Chociaż użycie uwiecznionych PTEC-ów daje przewagę stabilności i łatwości utrzymania, naukowcy mogą również rozważyć wykorzystanie pierwotnych komórek nabłonkowych proksymalnych rurkowych, aby zwiększyć znaczenie fizjologiczne. Jednak pierwotne PTEC-y myszy wykazują większą zmienność między dawcami59,60 i mają ograniczoną zdolność proliferacji61,62, co czyni je mniej odpowiednimi do eksperymentów o wysokiej przepustowości lub długoterminowych eksperymentach. Ich zastosowanie może być bardziej odpowiednie w badaniach walidacyjnych lub przy analizie konkretnych odpowiedzi pochodzących od pacjentów
Protokół ten stanowi cenną platformę do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw urazu H/R, identyfikacji i oceny potencjalnych podejść terapeutycznych oraz badania odpowiedzi komórkowych, takich jak stan zapalny, stres oksydacyjny i szlaki śmierci komórki w kontrolowanym środowisku63,64.
Niemniej jednak ważnym ograniczeniem tego modelu jest to, że nie odtwarza on niektórych cech niedokrwienia obserwowanych podczas przeszczepu nerek, takich jak hipotermia czy niedobór składników odżywczych podczas przechowywania w zimnie9. Te schorzenia znacząco wpływają na metabolizm komórkowy i wzorce urazów, a ich brak może ograniczać przeniesienie wyników do środowiska klinicznego65,66.
Podsumowując, ten model in vitro H/R u IM-PTEC zapewnia powtarzalne, dostępne i etycznie korzystne podejście do badania urazu niedokrwiennego nerek i reperfuzji w warunkach kontrolowanych. Choć nie oddaje w pełni złożoności niedokrwienia in vivo , stanowi cenne narzędzie uzupełniające do wyjaśniania mechanizmów komórkowych, przesiewowego badania kandydatów terapeutycznych oraz ograniczenia zależności od eksperymentów na zwierzętach w badaniach nerek.

Według Global Observatory on Donation and Transplantation, przeszczep nerki stanowi około 60%-65% wszystkich przeszczepów narządów stałych na świecie, przy czym liczba przeprowadzonych zabiegów w 2023 roku była prawie trzykrotnie wyższa niż przeszczepów wątroby, przy czym ten ostatni jest drugim najczęściej spotykanym typem. W 61% przeszczepów nerek wykonanych w tym roku organ pochodził od zmarłych dawców1, co wiąże się z dłuższym okresem zachowania w porównaniu do przeszczepów od żywych dawców, gdzie czas oczekiwania jest znacznie krótszy2. W tym okresie zachowania nerki są zazwyczaj konserwowane poprzez statyczne przechowywanie zimna, aby spowolnić metabolizm komórkowy, co zmniejsza zapotrzebowanie na tlen i energię, a tym samym ogranicza uszkodzenia niedokrwienne3. Jednak statyczne przechowywanie zimna zapewnia jedynie częściową ochronę, ponieważ nie jest w stanie w pełni utrzymać metabolizmu komórkowego ani dostarczania tlenu, co prowadzi do postępujących zaburzeń metabolicznych podczas zachowania 4,5. Alternatywnie, zachowanie normotermiczne ex vivo pojawiło się jako realna strategia utrzymania narządu w temperaturze bliskiej fizjologicznej, wspierając tym samym metabolizm komórkowy i natlenienie, a w konsekwencji zmniejszając uszkodzenia niedokrwieniowe i reperfuzyjne (IRI)6.
Jednak podczas przeszczepu nerki ostre uszkodzenie nerek (AKI) spowodowane IRI jest nieuniknioną konsekwencją. IRI powstaje w wyniku przerwania przepływu krwi przez organ, co prowadzi do nierównowagi między podażą a popytem tlenu i składników odżywczych7. Proces ten ma bezpośredni wpływ na funkcjonowanie przeszczepionej nerki i zwiększa ryzyko ostrego odrzucenia oraz obniżenia funkcji przeszczepu długoterminowego 8,9.
PTEC – szczególnie liczne w korze nerki – są szczególnie podatne na IRI. Komórki te stanowią około 60%-70% nabłonka rurkowego i odpowiadają za reabsorpcję większości filtratów kłębuszkowych, w tym wody, jonów, glukozy i aminokwasów10. Ich wysoka aktywność metabolyczna jest wspierana przez rozległą sieć mitochondrialną, aby zaspokoić zapotrzebowanie na transport zależny od ATP.11. W związku z tym są niezwykle wrażliwe na zaburzenia metaboliczne, takie jak niedobór tlenu i dysfunkcja mitochondrialnych, które są centralnymi cechami IRI12.
Podczas IRI brak tlenu zakłóca mitochondrialną fosforylację oksydacyjną, prowadząc do wyczerpania ATP i upośledzenia funkcji reabsorpcji 13,14. To inicjuje metaboliczne przejście z utleniania kwasów tłuszczowych (FAO) na glikolizę beztlenową oraz aktywację szlaku fosforanu pentozowego, który choć tymczasowo chroni, nie jest wystarczający, by w pełni zaspokoić potrzeby energetyczne i redoksowe tych komórek15. Jeśli supresja FAO utrzymuje się podczas fazy naprawy, następuje nagromadzenie lipidów16 i lipotoksyczność17, co dodatkowo uszkadza komórki i osłabia ich zdolność regeneracyjną18. Ten nieprzystosowalny stan metaboliczny może ostatecznie prowadzić do zaniku jajowód, włóknienia śródmiąższowego oraz postępu do przewlekłej choroby nerek19.
To zaburzenie metaboliczne spowodowane wadliwym FAO, utrudnia zaspokojenie wysokich wymagań energetycznych cewki nerkowej17,19. Wynikające z tego wyczerpanie ATP i nagromadzenie lipidów sprzyja dysfunkcji mitochondriów oraz powstawaniu reaktywnych form tlenu, które aktywują sygnalizację prozapalną i infiltrację leukocytów 20,21,22. Utrzymujące się zapalenie i uszkodzenia oksydacyjne destabilizują integralność mitochondriów, wzmacniając niewydolność energetyczną i ostatecznie wywołując śmierć komórek apoptotycznych i martwiczych23,24. W tej fazie ostrego urazu specyficzne biomarkery, takie jak Kidney Injury Molecule 1 (KIM-1) oraz Neutrofil Gelatynaza Lipocalina (NGAL), są podwyższane, służąc jako wrażliwe wskaźniki uszkodzenia rurówek bliższych i wczesnego AKI25.
Po ostrym urazie mechanizmy nieadaptacyjnej naprawy sprzyjają nadmiernemu osadzaniu się macierzy zewnątrzkomórkowej, co jest charakterystyczne dla włóknienia nerek26. Wśród składników macierzy zewnątrzkomórkowej kolagen, szczególnie kolagen typu I (kodowany przez gen Col1a1), gromadzi się w przestrzeni śródmiąższowej, przyczyniając się do zaniku rurówek i utraty funkcjonalnego miąższu27. Ta fibrotyczna remodelacja jest w dużej mierze napędzana starzeniem rurkowym i częściowym przejściem z nabłonka do mezenchymu (pEMT) w komórkach nabłonka rurkowego, co ostatecznie prowadzi do spadku funkcji nerek 28,29,30. Początek nerkowego pEMT i włóknienia wspomaga postęp od AKI do przewlekłej choroby nerek (CKD), co kończy się nieodwracalną utratą funkcji nerek i zaburzoną przeżywalnością przeszczepu31,32.
W tym protokole opisujemy model in vitro urazu H/R, wykorzystując mysze SV40-uwiecznione przez komórki nabłonkowe proksymalne rurkowate (IM-PTEC), poddane kontrolowanym warunkom H/R. Większość przedklinicznych badań IRI nerek tradycyjnie opierała się na modelach zwierzęcych, które odtwarzają złożone odpowiedzi naczyniowe i immunologiczne nerek, ale wiążą się z wyższymi kosztami, kwestiami etycznymi i znacznie większą zmiennością biologiczną33,34. Te ograniczenia spowolniły rozwój komplementarnych systemów opartych na komórkach, odpowiednich do szczegółowych badań mechanistycznych i wysokoprzepustowych. To eksperymentalne rozwiązanie umożliwia powtarzalną symulację niedotlenienia i odbudowy, naśladując kluczowe cechy IRI obserwowane w przeszczepionych nerkach. Model ten stanowi cenne narzędzie do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw urazów rurkowobiegowych, ekspresji markerów biomarkerów oraz odpowiedzi fibrotycznych w kontrolowanym środowisku. Ponadto zapewnia istotną platformę do przesiewowego badania i oceny potencjalnych strategii terapeutycznych mających na celu zapobieganie lub łagodzenie uszkodzeń niedokrwiennych oraz poprawę wyników po przeszczepie.

<table><tbody><tr><td>Płytka qPCR z 384 dołkami</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Ortoalresa</td><td>Biocen22R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>0757-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu naskórka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141086.1214</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Hipoksji</td><td>Memmert</td><td>ICO 50med</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>ProspecBIo</td><td>CYT-358</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>ICO 105</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>VWR</td><td>0918-1L</td><td></td></tr><tr><td>ITSe</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nie2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>Genomika Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina - Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master Mix</td><td>NZYTech</td><td>MB22303</td><td></td></tr><tr><td>System qPCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>QuantStudio 5</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix transkrypcji odwrotnej</td><td>NZYTech</td><td>MB12502</td><td>Zawiera mieszankę enzymatyczną</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAse</td><td>HyClone</td><td>SH3053802</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testu obciążeniowego Seahorse XF Cell Mito</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Zawiera oligomycynę, FCCP, antymycynę A i rotenon</td></tr><tr><td>Seahorse XF DMEM medium</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Glukoza</td><td>Agilent</td><td>03577-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Glutamine</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Pyruvate</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFe96</td><td>Agilent</td><td>S7800BR</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103792-100</td><td>Zawiera mikropłytkę do hodowli komórek XFe96 oraz wkład sensorowy XFe96</td></tr><tr><td>Cykler termiczny</td><td>BIO-RAD</td><td>Termiczny cykler T100</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Modeling Hypoxia/Reoxygenation Injury in Proximal Tubular Epithelial Cells

Przeszczep nerki stanowi około 60%-65% wszystkich przeszczepionych narządów stałych. Większość nerek dawcy pochodzi od osób zmarłych, co wymaga długotrwałej konserwacji zimna, co jest znanym czynnikiem złych wyników przeszczepów. Pomimo obecnych strategii zachowania, uszkodzenia niedokrwieniowe i reperfuzyjne (IRI) pozostają nieuniknionym skutkiem przejściowych przerw w przepływie krwi, prowadzącym do niedotlenienia i niedoboru składników odżywczych. W obrębie nefronu proksymialne nabłonkowe komórki rurkowaste (PTEC) segmentu S3 są szczególnie podatne na IRI ze względu na wysokie zapotrzebowanie metaboliczne oraz zależność od mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej. Na poziomie molekularnym IRI zakłóca metabolizm mitochondrialny i zmniejsza produkcję ATP, co ogranicza zapotrzebowanie na energię komórek nabłonka rurkowo-rurkowego (PTEC) oraz sprzyja apoptozie i martwicy. Aby zbadać te mechanizmy i ocenić potencjalne strategie terapeutyczne, niezbędne są solidne i powtarzalne modele in vitro nerkowego IRI, które dokładnie oddają metaboliczne podatności PTEC. Tutaj opisujemy protokół indukcji i oceny urazów hipoksji/reoxygenacji (H/R) u uśmiechniętych PTEC-ów (IM-PTECs). Protokół zawiera szczegółowe informacje o składzie podłoża i warunkach hodowli niezbędnych do utrzymania tych komórek, a następnie następuje indukcja uszkodzeń H/R poprzez kontrolowaną hipoksję i fazy reoxygenacji, które ściśle naśladują niedokrwienie i reperfuzję w przeszczepionych nerkach. Model ten stanowi cenną podstawę do oceny efektów różnych interwencji na komórki nabłonkowe nerek narażone na uszkodzenia H/R. Wpływ tych terapii można ocenić poprzez analizę ekspresji markerów związanych z uszkodzeniami PT, a także poprzez ocenę funkcji oddechowej mitochondriów. Razem te odczyty dostarczają mechanistycznych wglądów w skuteczność związków chemicznych i procesy komórkowej regeneracji, wspierając rozwój ukierunkowanych terapii dla IRI nerek.

Najpierw przeprowadzono walidację biegu czasowego, aby określić optymalne warunki niedotlenienia/reoxygenacji (H/R) w celu reprodukcji urazu niedokrwiennego u IM-PTEC. Aktywacja kaspazy-3, będąca znakiem rozpoznawczym uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji zarówno in vivo, jak i in vitro, została wykorzystana jako wskaźnik wierności modelu36,37. Stwierdziliśmy, że 48 godzin hipoksji, a następnie 24 godziny reoxygenacji, dały największy wzrost aktywności kaspazy-3. Żywotność komórek, oceniana testem MTT, pozostała porównywalna z normoksyjną kontrolą w tych warunkach, co wskazuje, że choć rozpoczęto sygnalizację apoptotyczną, komórki pozostawały zdolne do dalszych badań farmakologicznych (Rysunek uzupełniający 1). Ten zwalidowany protokół został następnie użyty do wywołania urazu H/R poprzez kontrolowaną hipoksję/reoxygenację IM-PTEC.
Po uszkodzeniu niedokrwiennym wykonano RT-qPCR w celu określenia ekspresji kilku markerów uszkodzenia nerek (Rysunek 2). RT-qPCR wykazał, że w kontekście IRI ekspresja Kim-1 38,39 i Ngal40,41, znanych markerów ostrego uszkodzenia nerek, była istotnie zwiększona. Ponadto zwiększona była ekspresja Acta2 42,43 oraz Col1a1 44,45,46, markerów nerkowego pEMT/włóknienia. Oprócz tego, że jest markerem pEMT/włóknienia nerek, ekspresja Col1a1 może być powiązana z nasileniem PRENKA47. /p>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69077/69077fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Ekspresja molekularna markerów uszkodzenia nerek pod normoksją lub hipoksją/reoxygenacją (H/R). Po H/R ekspresja molekularnych markerów uszkodzenia nerek Kim-1, Ngal, Acta2 i Col1a1 jest istotnie zwiększona w IM-PTEC. Dane przedstawiane są jako średnia ± standardowy błąd średniej (SEM) z czterech biologicznych replikacji na warunki. Istotność statystyczna oceniono za pomocą niesparowanego dwustronnego testu Student's t. Poziomy istotności są podawane następująco: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***) oraz p < 0,0001 (****). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69077/69077fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Przeprowadzono również badania oddechu mitochondrialnego w celu określenia pojemności oddechowej mitochondriów po H/R (Rysunek 3). Poprzez pomiar tempa zużycia tlenu (OCR) ustaliliśmy, że po wyzwaniu niedokrwiennym wszystkie parametry oddechu mitochondrialnego (oddech podstawowy, produkcja ATP, wyciek protonów, maksymalne oddychanie i pojemność zapasowa) zostały zmniejszone, co wskazuje na utrudniony metabolizm mitochondrialny.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69077/69077fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: OCR (tempo zużycia tlenu) u IM-PTEC w warunkach normoksycznych lub hipoksycznych. Po niedotlenieniu/reoxygenacji (H/R) im-PTEC wykazują zmniejszoną funkcję oddechową mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne oceniano poprzez kolejne dodawanie inhibitorów łańcucha transportu elektronów: oligomycyny, FCCP (karbonyl cyjanidu-p-trifluorometoksyfenylhydrazonu), antymycyny A oraz rotenonu. Dane przedstawiane są jako średnia ± standardowy błąd średniej (SEM) z czterech biologicznych replikacji na warunki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69077/69077fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Wyniki te potwierdzają, że protokół H/R skutecznie indukuje molekularne i metaboliczne zmiany zgodne z niedokrwiennym uszkodzeniem nerek u IM-PTEC48,49. Protokół ten stanowi zatem użyteczne ramy do odtwarzania stanów podobnych do niedokrwienia nerek in vitro.
Rysunek uzupełniający 1. Żywotność komórek i aktywność kaspazy-3 w warunkach normoksji oraz niedotlenienia/reoxygenacji (H/R). (A) Żywotność komórek. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu MTT po ekspozycji na normoksię lub niedotlenienie/reoxygenację (H/R). Wyniki wyraża się jako względna żywotność (%) znormalizowana do normoksycznych kontroli. (B) Rozcięta kaspaza-3. Aktywność rozszczepionego kaspazy-3 (białko nmol/min/mg) została zmierzona w komórkach poddanych różnym okresom trwania normoksji (N), hipoksji (H) i reperfuzji (R). Dane są prezentowane jako średnia ± SEM, a każda kropka reprezentuje indywidualny biologiczny replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69077/Supplementary Figure 1_RE.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.</a>

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Kidney transplantation accounts for approximately 60%-65% of all transplanted solid organs. Most donor kidneys are obtained from deceased individuals, ...

Nasze badania koncentrują się na modelowaniu urazu niedokrwienia nerek i reperfuzji z wykorzystaniem komórek rurkowo-proksymalnych nerek do badania uszkodzonych mechanizmów i poszukiwania strategii terapeutycznych. Odtworzenie złożonego środowiska niedokrwiennego nerki in vitro pozostaje trudne, zwłaszcza zimna i interakcje immunologiczne. Na początek usuń pożywkę hodowlową z IM-PTEC, aby odświeżyć komórki.Do otworów płyty z sześcioma dołkami należy dodać dwa mililitry świeżego medium L3 bez gamma interferonu. Umieść komórki w inkubatorze hipoksji ustawionym na 1% tlenu i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin. Po inkubacji należy usunąć płytki IM-PTEC z inkubatora hipoksji i zastąpić podłoże świeżym medium L3 bez interferonu Gamma.Umieść komórki w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w normalnych warunkach tlenowych i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby wykonać RT-qPCR, przygotuj zestawy zapalników, mieszając je do końcowego stężenia 10 mikromolowych. Przygotować mieszankę reakcji, łącząc wymagane odczynniki wraz z spłonami i wodą wolną od nukleazy w każdym odwiercie.Mieszaj delikatnie, aby zapewnić jednolitość. Za pomocą pipety wlej osiem mikrolitrów mieszanki RT-qPCR do każdego dołka płytki PCR z 384 dołkami i dodaj dwa mikrolitry dotartej próbki DNA do każdej dołki, pozwalając na pozostanie małej kropli na krawędzi dołku. Po dodaniu wszystkich próbek delikatnie stukaj w płytkę, aż wszystkie krople całkowicie spadną do dołków, i szczelnie uszczelnij płytę membraną.Obróć płytkę PCR z 384 dołkami, aby usunąć pęcherzyki powietrza i zapewnić równomierny rozkład. Teraz umieść szczelną płytkę w systemie RT-qPCR. Ustaw program i rozpocznij pomiar.Włącz analizator szybkości zużywania tlenu i szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, aby ogrzał się na co najmniej pięć godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Nawadnij wkład z czujnikiem na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze niezawierającym dwutlenek węgla. Następnego dnia przygotuj podłoże do hodowli komórek na 196 dołków, dodając Modified Eagle Medium Dulbecco z odpowiednimi suplementami i delikatnie mieszając do homogeniczności.Następnie przygotuj roztwory inhibitorowe, mieszając wymagane składniki. Następnie wyjmij nawadniony wkład czujnikowy z inkubatora. Używając pipety wielokanałowej i prowadnicy ładowania, załaduj 25 mikrolitrów każdego inhibitora do odpowiadającego mu portu.Następnie aspiruj medium wzrostu z mikropłyty hodowli komórkowej i dodaj 175 mikrolitrów medium testowego temperowanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołku za pomocą pipety wielokanałowej. Umieść mikropłytę hodowli komórkowej w inkubatorze z dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 45 do 60 minut przed rozpoczęciem badania. Po inkubacji należy włożyć płytkę kalibracyjną zawierającą załadowany wkład czujnika do analizatora w celu kalibracji.Po zakończeniu kalibracji umieść mikropłytkę hodowli komórkowej w analizatorze do pomiaru. Po wykonaniu pomiaru usuń i zachowaj mikropłytę hodowli komórkowej do późniejszego ilościowego określenia całkowitego białka w celu normalizacji danych. 48 godzin hipoksji, a następnie 24 godziny reoxygenacji, przyniosły największy wzrost aktywności kaspazy-3, jednocześnie utrzymując żywotność komórek porównywalną z normoksyczną kontrolą.Po niedotlenieniu i reoxygenacji nastąpił istotny wzrost ekspresji markerów uszkodzenia nerek Kim-1 i Ngal, a także ekspresji markerów przejścia nabłonkowego i włóknienia nerkowego częściowego nabłonka do mezenchymalnego oraz włóknienia, Acta2 i Col1a1. Analiza oddechu mitochondrialnego wykazała, że po wyzwaniu niedokrwiennym wszystkie parametry oddechowe, w tym oddech podstawowy, produkcja ATP, wyciek protonów, maksymalne oddychanie oraz pojemność zapasowa, zostały zmniejszone, co wskazuje na utrudniony metabolizm mitochondrialny. Brakuje standaryzowanych modeli komórkowych do badania urazów niedokrwiennych nerek i reperfuzji w kontrolowanych warunkach metabolicznych.Nasz protokół jest prosty, opłacalny i powtarzalny, wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego oraz inkubatora hipoksji. Identyfikacja nowych celów terapeutycznych oraz walidacja związków ochronnych przy użyciu zarówno modeli in vitro, jak i in vivo.

modeling-hypoxiareoxygenation-injury-proximal-tubular-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Źródło: Alluri, H., et.al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i redotlenowacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015).Film pokazuje wpływ niedoboru tlenu i glukozy oraz późniejszego dotlenienia na komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) poprzez symulację stanu niedotlenienia i braku składników odżywczych. Warunki te powodują zubożenie ATP, zwiększenie wewnątrzkomórkowego wapnia i wytwarzanie...

Wpływ deprywacji tlenowo-glukozowej i reoksygenacji na interakcje komórka-komórka

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) wiąże się z wysokim wskaźnikiem zachorowalności i śmiertelności. Celem opisanego tutaj modelu deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) in vitro jest ocena wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego na różne komórki, szczególnie w komórkach śródbłonka bariery krew-mózg (BBB).

Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

W tym miejscu opisujemy protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) z kory nerkowej w celu opracowania monowarstwowych i trójwymiarowych kultur na macierzy zewnątrzkomórkowej (3D-HRTEC).

Rozwój hodowli pierwotnych komórek nabłonka ludzkich kanalików nerkowych w warunkach jednowarstwowych i trójwymiarowych

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

Samoorganizujące się ludzkie organoidy sercowe (hCO) to nowy system modelowania rozwoju i chorób serca u człowieka. Tutaj przedstawiono metodologię generowania i urazu hCOs przy użyciu hipoksji i reoxygenacji oraz szczegóły oczekiwanych wyników histologicznych i funkcjonalnych po urazie.

Model urazu hipoksji i reoxygenacji u samoorganizujących się ludzkich kardioidów

W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Poznaj modelowanie niedotlenienia i reoxygenacji w komórkach nabłonka rurkowego nerek. Ta metoda pozwala ocenić markery uszkodzeń nerek oraz funkcję mitochondrialną w kontrolowanych warunkach in vitro.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Przeglądaj więcej filmów