Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz
17 października 2025
Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.
Zakres moich badań polega na opracowaniu modelu uszkodzeń indukowanych UVB, aby móc badać patogenność rzadkiej choroby, xeroderma pigmentosum, a dokładniej XPA. Jednym z wyzwań tych modeli in vitro jest to, że wychowanie trwa dość długo, około czterech miesięcy, a ponieważ to wciąż dość młoda dziedzina, musimy je jeszcze lepiej scharakteryzować. Zalety tego modelu to model 3D pochodzący od hiPSC, kultura, że powietrze i ciecz się stykają, odtwarzają architekturę ludzkiej skóry i posiadają kończyny skórne, takie jak gruczoł łojowy i mieszki włosowe.
Na początek przygotuj roztwór jednomolowy, dodając granulki wodorotlenku sodu do pustej rurki 15-mililitrowej. Dodaj wodę destylowaną do pelletów i przeprowadź rurkę wirem, aby je rozpuścić. Filtr sterylizuje roztwór wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 mola za pomocą membranowego filtra o rozmiarze poru o średnicy 0,2 mikrometra.
Na lodzie rozcieńczaj roztwór kolagenu typu I za pomocą 10 razy stężenia PBS, pięciomilimolowego wodorotlenku sodu i wody destylowanej, aby dostosować ostateczną objętość. Rozprowadz 150 mikrolitrów tego roztworu kolagenowego do każdej insetki, umieszczonej w standardowej płytki z 12 dołkami. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby żel kolagenowy mógł się zpolimeryzować.
Następnie wytnij końcówki P1000 podgrzewanym skalpelem, aby uzyskać końcówki o szerokim przełęcie. Następnie użyj szerokich końcówek otworu, aby umieścić wybraną torbielowatą strukturę z niewielką ilością medium na pokrywce 10-centymetrowej szalki Petriego. Ostrożnie usuń wszelkie produkty uboczne struktury za pomocą sterylnego skalpela, stabilizując ją sterylnymi kleszczami po przeciwnej stronie.
Wyciąć około jednego milimetra z obu końców torbielowatego organoidu skóry przylegającego do pierwszego nacięcia skalpelem. Używając sterylnych kleszczy, delikatnie rozłóż górną warstwę skóry. Pokrój tkankę na dwie do czterech części, w zależności od rozmiaru.
Następnie, używając sterylnych kleszczy, przesuwaj każdy element na wkład pokryty kolagenem, skierowany do góry. Dodaj 600 mikrolitrów OMM do każdego dołku standardowej płytki z 12 dołkami. Przenieś wkład z powrotem na płytkę 12-dołkową zawierającą OMM.
Następnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Do dnia zero powstał pojedynczy, gęsty agregat komórkowy zawierający większość komórek dzięki starannemu obsłudzeniu i wirówce. Prawidłowa indukcja nabłonka powierzchniowego doprowadziła do powstania cienkiego, przejrzystego nabłonka na zewnętrznej warstwie kruszywa już trzeciego dnia. Do 12. dnia cienka warstwa komórek mezenchymalnych zgromadziła się na jednym biegunie torbieli.
Płytki i szpiączki do włosów stały się widoczne między 50. a 80. dniem, po współindukcji nabłonka i mezenchymalnego. Organoidy pozbawione widocznych plakodów wykazywały niezwykle cienki nabłonek i były wyłączone z przejścia planarnego. Do płaskiego generowania organoidów skóry wyselekcjonowano jedynie torbiele o średnicy co najmniej pięciu milimetrów o spolaryzowanych produktach ubocznych.
Mieszki włosowe stopniowo wydłużały się przez 27 dni hodowli styku powietrze-ciecz. Gruczoły łojowe stały się widoczne około 14. dnia w konfiguracji płaskiej. Stopniowo zwiększało się przebarwienie organoidów z czasem.
Barwienie hematoksyliny i eozyny ujawniło warstwowy nabłonek oraz błonę podstawną oddzielającą je od skóry skórnej. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło architekturę podobną do ludzkiej skóry w płaskich organoidach skóry.
Przegląd
Niniejsza praca opracowuje model uszkodzeń indukowanych promieniami UVB w celu zbadania unforemowanej skóry (xeroderma pigmentosum), koncentrując się na generowaniu organoidów skóry zawierających mieszki włosowe, pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Organoidy są hodowane z wykorzystaniem fizjologicznie istotnego interfejsu powietrze-ciecz, aby skutecznie naśladować architekturę i funkcję ludzkiej skóry.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Patogenność kserodermii pigmentowej
- Opracowanie modeli skóry in vitro
- Wykorzystanie trójwymiarowej technologii organoidów
Wstęp
- Wyzwania w hodowli organoidów skóry
- Aktualny stan wiedzy na temat biologii skóry
- Znaczenie mieszków włosowych i przydatków skóry w badaniach
Zastosowane metody
- Kultura na granicy faz powietrze-ciecz w celu rozwoju organoidów
- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste jako źródło
- Techniki immunofluorescencji i barwienia histologicznego
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie organoidów skóry z mieszkami włosowymi
- Obserwacja koindukcji nabłonkowej i mezenchymalnej
- Walidacja architektury przypominającej ludzką skórę za pomocą barwienia
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wiedzy na temat rozwoju organoidów skóry z komórek macierzystych.
- Wykazuje potencjał wykorzystania tego modelu w zrozumieniu chorób skóry.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ludzkie organoidy płaskiej skóry z włosami, pochodne z iPSC i hodowane na granicy powietrze-ciecz, stanowią fizjologicznie istotny system in vitro do badania biologii skóry oraz formowania przydatków. Platforma ta umożliwia predykcyjne modelowanie odpowiedzi tkankowej na szkodliwe czynniki środowiskowe oraz środki farmakologiczne, wspierając badania translacyjne i mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach i rozwoju (R&D) w dziedzinie dermatologii. Podejście to zwiększa pewność co do potencjału portfela badawczego poprzez zapewnienie solidnych, reprodukowalnych modeli skóry do wczesnego etapu odkryć i oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań międzykomórkowych w mikrośrodowisku ludzkiej skóry.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez modelowanie rozwoju przydatków skóry oraz stratyfikacji tkankowej.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla szlaków związanych ze skórą oraz mechanizmów rzadkich chorób.
Przesiew oraz opracowywanie testu
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do ilościowej oceny odpowiedzi na leki oraz uszkodzeń tkanek.
- Dostarcza zwalidowane systemy biologiczne z mieszkami włosowymi i gruczołami łojowymi do oceny związków.
- Umożliwia skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy w różnorodnych zastosowaniach w badaniach skóry.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modeluje reakcje tkanek istotne dla przebiegu chorób, w tym uszkodzenia indukowane przez UVB oraz infekcje patogenami.
- Jest zgodny z translacyjnymi strategiami biomarkerów poprzez analizy molekularne i histologiczne.
- Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka, łącząc etap odkryć z walidacją przedkliniczną.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten system organoidowy integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz analitykę predykcyjną w biologii skóry.
- Biologia odkryć: Wspiera badania nad architekturą skóry i formowaniem się jej przydatków w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla testów odpowiedzi na leki i uszkodzenia.
- Analityka: Umożliwia odczyty molekularne i histologiczne do porównawczej analizy warunków.
- Badania translacyjne: Ułatwia zachowanie ciągłości od modelowania in vitro do przedklinicznych badań nad chorobami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla wielu inicjatyw badawczych i przesiewowych w zakresie skóry.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad skórą.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne i reprodukowalne przepływy pracy w generowaniu organoidów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie solidnego modelowania in vitro.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów dermatologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, manipulacji organoidami oraz inżynierii tkankowej.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz oraz do analiz molekularnych.
- Konieczna jest standaryzacja punktów kontrolnych oceny jakościowej oraz kryteriów wyboru pomiędzy poszczególnymi zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli chorobowych lub typów tkanek, w zależności od celu badań.
- Praktycznymi ograniczeniami, które należy wziąć pod uwagę, są długie okresy hodowli oraz potrzeba ciągłej charakterystyki obszarów.
