In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Nasze badania dotyczą komórek T pamięci CD8 w kobiecym drógu rozrodczym, analizując, jak infekcje i choroby wpływają na ich zdolność zamieszkania, funkcjonowanie, utrzymanie oraz potencjał terapeutyczny. Istniejące metody ograniczają przeżywalność i stabilność fenotypową komórek T pamięci rezydentnych. Protokół ten umożliwia skalowalne badania in vitro poprzez indukcję rezydencji tkanek poprzez kultową hodowlę komórek T organoidalnych.

Na początek należy narządy nabłonka pochwy (VEO) o gęstości 10 000 komórek w 20 mikrolitrach ekstraktu z błony podstawnej na dołek płytki 24-dołkowej. Włóż talerz do inkubatora i utrzymuj hodowle przez siedem do dziesięciu dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dzień przed kokulturą aspiruj podłoże komórkowe z wyznaczonych studni i przemyj je DPBS.

Aspiruj DPBS, a następnie podaj 600 mikrolitrów podgrzanego 0,25% trypsyny EDTA do studni. Używając pipety P1000 powlekanej BSA, dokładnie ponownie zawiesz, aby mechanicznie rozbić ekstrakt błony podstawnej i przenieść zawartość studni do sterylnej rurki stożkowej o średnicy 15 mililitrów powłokowanej BSA. Teraz umieść stożkową rurkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach dodaj 10 mililitrów 10% FBS w RPMI, aby stłumić trypsynizację. Następnie umieść probówkę w wirówce i obróć ją w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć supernatant. Używając końcówki pipety pokrytej BSA, ponownie zawiesij granulat w 100 do 300 mikrolitrach pożywki hodowli organoidów T-komórkowych lub zwykłego DMEMF 12.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość wirusa potrzebną do osiągnięcia wielokrotności zakażeń 0,1, używając całkowitej liczby komórek i znanego miana wirusa. Aspiracja podłoża komórkowego z dołków VEO wybranych do infekcji.

Każdą jamkę przemyj 500 mikrolitrami podgrzanego DPBS i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po pięciu minutach odłóż DPBS. Dodaj 500 mikrolitrów podłoża organoidowego zawierającego wystarczającą ilość cząstek wirusa, aby uzyskać wielokrotność zakażenia 0,1.

Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na godzinę, delikatnie mieszając talerz ręcznie co 20 do 30 minut. Przenieś odpowiednią ilość ekstraktu z błony podstawowej potrzebnej do powlekania z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czterech stopni Celsjusza i pozwól jej rozmrażać przez osiem godzin. Sprawdź VEO pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić rozmiar i ogólny stan zdrowia.

Potwierdź, że VEO mają około 100 mikrometrów średnicy, jednolitą morfologię okrągłą i minimalną liczbę pojedynczych komórek. Aspiruj podłoże komórkowe z dołków VEO i przemyj każdą dołek 500 mikrolitrami zimnego, sterylnego DPBS, utrzymującego się w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Po usunięciu DPBS należy dodać 200 do 500 mikrolitrów zimnego roztworu organoidowego do każdego otworu, zapewniając co najmniej 10-krotną objętość w porównaniu do kropli ekstraktu z błony podstawnej.

Następnie, używając pipety P200 powlekanej BSA, mechanicznie rozbij ekstrakt błony podstawnej. Teraz umieść płytę na orbitalnym potrząsaczu ustawionym na około 100 obrotów na minutę przy czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji użyj końcówki pipety powlekanej BSA, aby wymieszać i przenieść zawartość każdego dołku do stożkowej rurki o średnicy 15 mililitrów powlekanej BSA.

Włóż rurkę do wirówki i obracaj w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant. Przemyj granulat VEO pięcioma do dziesięcioma mililitrami zimnego DPBS i ponownie wiruj w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aspiruj DPBS, następnie używaj końcówki pipety P1000, ponownie zawiesz pellet w jednym mililitrze pożywki z hodowli organoidów T-komórkowych i umieszczaj zawiesinę VEO w lodzie, aż limfocyty T będą gotowe do współhodowli. Aby pobrać limfocyty T, sprawdź spoczynkowe limfocyty T pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić rozmiar i ogólny stan zdrowia. Potwierdź, że limfocyty T wykazują pewne skupiska, powiększoną morfologię i brak widocznych fragmentów czy zanieczyszczenia komórek.

Używając pipety P1000, ponownie zawiesij limfocyty T, pipetując w górę i w dół kilka razy w każdym rogu otworu. Zbierz stożkową rurkę i policz łączną liczbę żywych limfocytów T CD8. Następnie umieść zawiesinę ogniw T do wirówki i obracaj się w temperaturze 584 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń supernatant i ponownie zawiesij osad z limfocytów T w 10 mililitrach pożywki hodowli organoidów komórek T. Następnie przenieś odpowiednią liczbę limfocytów T do stożkowej rurki zawierającej wcześniej przygotowane VEO, aby połączyć komórki. Włóż połączoną zawieszinę VEO i ogniwa T do wirówki i obróć ponownie z częstotliwością 584 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij VEO i limfocyty T w odpowiedniej objętości ekstraktu z błony podstawnej. Następnie, używając kolejnej końcówki pipety, nakładam zawiesinę na wcześniej podgrzaną płytkę do hodowli tkanek, podawając 20 mikrolitrów na dołek na płytkę z 24 dołkami. Teraz odwróć płytkę do hodowli tkankowej i umieść ją do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Należy odczekać 30 minut na całkowitą przyczepność i zastygnięcie membrany podstawnej. Po okresie inkubacji ostrożnie dodaj uzupełniony kompletny pożywkę hodowli organoidów komórek T do każdego dołku. Podawaj 500 mikrolitrów na odwierć na płytę 24-dołkową lub 250 mikrolitrów na odwór na płytę 96-dołkową, dodając medium przy ścianie studni, aby nie zakłócać kropli ekstraktu z błony podstawnej.

Wymieniaj podłoże hodowlane co dwa dni, aż do pobrania próbek do analizy cytometrii przepływowej. Siedmiodniowe mysze VEO zakażone wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowych wykazujące żółte białko fluorescencyjne wykazywały obfitą replikację wirusa już cztery godziny po współhodowli, widoczną jako sygnały fluorescencyjne wewnątrz organoidów. Nagromadzenie komórek T CD8 w pobliżu zakażonych organoidów stało się wyraźne w późniejszych momentach podczas współhodowli.

Stopniowe agregowanie limfocytów T CD8 wiązało się z widocznym zmniejszeniem sygnału białka żółtej fluorescencji w zakażonych organoidach w późniejszych momentach. Limfocyty T CD8 współhodowane z zakażonymi VEO wykazały zwiększoną ekspresję CD 69 i CD 103 w czasie, co wskazuje na przejęcie fenotypu pamięci rezydencyjnej w tkance. Antygen-stymulowane CD69 pozytywne, CD103 pozytywne CD8 wykazały istotny wzrost produkcji intrakomórkowego interferonu gamma i interleukiny 2 w porównaniu z kontrolą niestymulowaną.

Protokół ten umożliwia badania in vitro komórek T pamięci CD8, umożliwiając efektywną manipulację komórkami nabłonkowymi i T bez uzależnienia od modeli zwierzęcych. Najważniejszym wyzwaniem w tym protokole jest utrzymanie zdrowych, żywotnych limfocytów T i nabłonka pochwy, ponieważ słaba żywotność lub infekcja zagrażają przeżyciu współkultury i efektom eksperymentalnym. Skupiliśmy się na analizie cytometrycznej przepływu, ale można zbierać współkultury do barwienia, obrazowania i sekwencjonowania.

Bezpieczne nośniki umożliwiają dalsze ELISA.