Name: In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek T CD8 w pamięć rezydentną za pomocą współhodowli z organoidami nabłonkowymi. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznych in vitro bez konieczności stosowania modeli zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, grant nasienny Uniwersytetu Browna (dla L.K.B.) oraz F31AI186444 (dla Y.L.). Chcielibyśmy podziękować dr Dorianowi B. McGavernowi (NINDS, NIH) za dostarczenie wirusa zapalenia mózgów limfocytarnych ekspresujących YFP. Dziękujemy za pomoc dr. Sanghyunowi Lee i jego laboratorium za pomoc przy obrazowaniu Cytation-5 oraz rdzeniu cytometrii przepływowej Uniwersytetu Brown, który ułatwia testy oparte na przepływie.

<ol><li>Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resident+memory+T+cells+and+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Tissue resident memory T cells and viral immunity.</a> Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nat Med. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346 (6205), 98-101 (2014).</li>
<li>Ariotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-resident+memory+CD8+%2B+T+cells+trigger+a+state+of+tissue-wide+pathogen+alert%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert.</a> Science. 346 (6205), 101-105 (2014).</li>
<li>Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifaceted+Role+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).</li>
<li>Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+memory+T+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Resident memory T cells and cancer.</a> Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).</li>
<li>Christo, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+tissue+microenvironments+instruct+diversity+in+resident+memory+T+cell+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+tissue-resident+memory+T+cells+requires+exogenous+lipid+uptake+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism.</a> Nature. 543, 252-256 (2017).</li>
<li>Hasan, M. H., Beura, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+resident+memory+T+cell+establishment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function.</a> Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).</li>
<li>Ulibarri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+organoid+supports+resident+memory+CD8+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation.</a> Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).</li>
<li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+expression+profiling+resolves+circulating+and+resident+memory+T+cell+diversity+across+tissues+and+infection+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts.</a> Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%2B+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).</li>
<li>Künzli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+T+follicular+helper+cells+retain+plasticity+and+help+sustain+humoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity.</a> Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).</li>
<li>Kang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+alveolar+assembloids+with+functional+alveolar-like+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages.</a> Nat Commun. 16, 3346(2025).</li>
<li>Lin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+gastrointestinal+assembloids+to+study+the+interplay+between+epithelial+crypts+and+their+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche.</a> Nat Commun. 14, 3025(2023).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Quintard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+integrating+functional+vascularized+organoids-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip.</a> Nat Commun. 15, 1452(2024).</li>
<li>Vincenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+CD8%2B+T+cells+cooperate+with+CD4%2B+T+cells+to+drive+compartmentalized+immunopathology+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS.</a> Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.

CD8 TRM opierają się na lokalnych sygnałach środowiskowych w celu rozróżnienia i konserwacji. Te sygnały wprowadzają programowanie specyficzne dla tkanek, które pozwala TRM CD8 dostosować się do otoczenia i wykonywać obowiązki immunosurveillance w razie potrzeby. Niestety, TRM nie przetrwały in vitro po wyodrębnieniu z tkanki, co ograniczyło ich szczegółową analizę12,13. W tym protokole przedstawiliśmy metodę, dzięki której komórki CD8 T mogą być współho...

Komórki T pamięci CD8 (TRM) stanowią unikalną populację komórek pamięci CD8, które są trwale zatrzymywane w tkankach obwodowych, bez rutynowego krążenia przez krew i tkanki limfatyczne. Te komórki TRM są strategicznie rozmieszczone w narządach barierowych, w tym skórze, płucach, jelicie i drógu rozrodczym, gdzie działają jako strażnicy przed patogenami i rodzącymi się guzami 1,2. Po wykryciu patogenu komórki CD8 TRM szybko uwalniają cytotoksyczne granulki, które bezpośrednio eliminują zainfekowane komórki, jednocześnie wydzielając cytokiny zapalne, które alarmują otaczające komórki tkankowe i rekrutują krążące efektory immunologiczne do powstrzymania rozprzestrzeniania patogenów 3,4. Skuteczność CD8 TRM w odporności przeciwpatogenowej oraz immunoterapii przeciwnowotworowej została już wykazana 5,6. W związku z tym umieszczenie obfitej ilości funkcjonalnie sprawnej TRM CD8 w tkankach błonowych bariery śluzowej jest kluczowym celem szczepionek i strategii immunoterapeutycznych.
Tworzenie i utrzymanie CD8 TRM w narządach obwodowych jest krytycznie zależne od lokalnego programowania tkankowego. Te lokalne sygnały środowiskowe obejmują unikalne cytokiny pochodzenia tkankowego i czynniki metaboliczne, a także interakcje międzykomórkowe, które wspólnie wymuszają tkankowo-specyficzną tożsamość TRM 7,8,9. To programowanie tkankowe pozwala TRM dostosować się do specyficznych wymagań tkankowych w wykonywaniu obowiązków immunonadzoru. Jednak nasza wiedza na temat natury tych interakcji jest niepełna z powodu braku solidnych systemów modelowych, które wiernie oddają te procesy. Modele małych zwierząt, choć bardzo informacyjne, często cierpią na silnie powiązaną, złożoną sieć interakcji, które utrudniają szybkie badania o wysokiej przepustowości.
Tutaj opisujemy alternatywę in vitro dla modelu mysza, która pozwoli na badanie szczegółów molekularnych sygnałów pochodzących z komórek nabłonkowych, które stoi za różnicowaniem CD8 TRM. Poprzez współhodowlowanie preformowanych nabłonkowych organoidów pochwy (VEO) z aktywowanymi komórkami T CD8, wygenerowaliśmy TRM CD8 in vitro. Szczegółowy opis procesu aktywacji i współhodowli komórek T CD8 umożliwi szersze wdrożenie tego procesu w tkankach, prowadząc do lepszego zrozumienia interakcji komórkowych kształtujących pamięć komórek T CD8 w tkankach na pierwszej linii.

<table><tbody><tr><td>Roztwór wodny paraformaldehydu 16%</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki wielodołkowe z polistyrenem nieobrzeźbionym</td><td>VWR International</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>3 mL sterylnych strzykawek</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-457</td><td></td></tr><tr><td>5 mL,&nbsp; Snap Cap,&nbsp; Jałowe probówki polistyrenowe o okrągłym dnie</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70 & mu; m Sita komórek sterylnych</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłyty z polistyrenem z okrągłym dnem z 96 dołkami</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>Wielodołkowe płytki do hodowli wielodołkowej z polistyrenem nieobrzedzonym</td><td>VWR International</td><td>10861-562</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydła/ułamek V</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>J6465518</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Amfocerycyna B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dodatek B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 Medium</td><td>Cytiva</td><td>SH30271. FS</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli buforowanej fosforanem Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminetetraoctowy (roztwór 0,5 m/pH 8,0)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki do mikro-rozcinania</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu – leczone węglem drzewnym/dektranem</td><td>R& D Systems</td><td>S11650</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Flowjo v10</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FlowJo (RRID:SCR_008520)</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie HEPES</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Magnes 5mL</td><td>Biolegenda</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>Mysz CD8 Na&iuml; ve T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegenda</td><td>480044</td><td></td></tr><tr><td>Myszy EGF Rekombinowany Białko</td><td>Gibco</td><td>315091MG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów nieistotnych (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>MP Biomedicals</td><td>0215255780</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony antymyszy CD3 i epsilon; Przeciwciała</td><td>Biolegenda</td><td>100360</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz B7.1 (CD80)-Fc Chimera (wolna od nośników)</td><td>Biolegenda</td><td>555406</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-12 (p70) (bez nośników)</td><td>Biolegenda</td><td>577004</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-2 (bez nośników)</td><td>Biolegenda</td><td>575406</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z bazowej błony o obniżonym współczynniku wzrostu</td><td>R& D Systems</td><td>BME001-10</td><td></td></tr><tr><td>Multimedia RPMI 1640</td><td>Cytiva</td><td>SH30027.LS</td><td></td></tr><tr><td>Azidek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% proteaza z trypsyną wieprzową</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żywotności (Red 780)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>13-0865-T100</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro dyferencjacja komórek t cd8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek t nabłonkowych

In Vitro Resident Memory CD8 T Cell Differentiation Using Epithelial Organoid-T Cell Co-culture System

Barierowe tkanki śluzowe odgrywają ważną rolę w różnicowaniu i funkcjonowaniu rezydujących komórek T. Wśród różnorodnych populacji komórek w tych tkankach, komórki nabłonkowe są kluczowymi czynnikami różnicowania limfocytów T. Jednak nasza wiedza na temat sygnałów pochodzących z nabłonka nabłonkowego, które kształtują biologię komórek T w środowiskach śluzowych, pozostaje ograniczona, głównie z powodu braku konkretnych narzędzi oraz złożoności dostępnych systemów modelowych. Tutaj opisujemy system współhodowli nabłonka pochwy myszy z komórkami T CD8, który modeluje dynamiczne interakcje między zakażonym nabłonkiem a specyficznymi dla wirusa komórkami T CD8. Protokół ten umożliwia fenotypową i funkcjonalną analizę odpowiedzi limfocytów T w fizjologicznie istotnym, trójwymiarowym mikrośrodowisku nabłonkowym. Za pomocą tego systemu demonstrujemy różnicowanie efektorowych komórek T CD8 do komórek T pamięci (TRM) rezydencyjnych w tkankach. Ten wszechstronny system hodowli in vitro daje redukcjonistyczne możliwości badania molekularnych szczegółów nabłonkowych sygnałów stojących za różnicowaniem komórek T CD8, które regulują odporność ochronną oraz immunopatologię narządów barierowych.

Mikroskopowa wizualizacja współkultury organoidów zakażonych limfocytami CD8 T Przygotowane mysie VEO zostały zakażone LCMV i współhodowane z limfocytami CD8 specyficznymi dla LCMV. Przeprowadziliśmy również te współhodowle z modelem zakażenia HSV-2, aby potwierdzić wszechstronność protokołu, ale pokazujemy dane mikroskopowe dla modelu LCMV i uwzględniliśmy dane różnicowania limfocytów T w modelu HSV-2 poniżej. LCMV wyraża żółte białko fluorescencyjne (YFP), dzięki czemu zakażone komórki można zobac...

Aby badać różnicowanie i funkcjonowanie komórek T CD8 in vitro, komórki T CD8 można wyizolować z myszy i długoterminowo współhodować z wcześniej zakażonymi nabłonkami nabłonka pochwy myszy. Tutaj opisujemy ten proces i oceniamy nabycie rezydentnych markerów komórek T pamięci podczas współhodowli.

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Barrier mucosal tissues play an important role in the differentiation and function of resident T cells. Among the diverse cell populations within these ...

Nasze badania dotyczą komórek T pamięci CD8 w kobiecym drógu rozrodczym, analizując, jak infekcje i choroby wpływają na ich zdolność zamieszkania, funkcjonowanie, utrzymanie oraz potencjał terapeutyczny. Istniejące metody ograniczają przeżywalność i stabilność fenotypową komórek T pamięci rezydentnych. Protokół ten umożliwia skalowalne badania in vitro poprzez indukcję rezydencji tkanek poprzez kultową hodowlę komórek T organoidalnych.Na początek należy narządy nabłonka pochwy (VEO) o gęstości 10 000 komórek w 20 mikrolitrach ekstraktu z błony podstawnej na dołek płytki 24-dołkowej. Włóż talerz do inkubatora i utrzymuj hodowle przez siedem do dziesięciu dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dzień przed kokulturą aspiruj podłoże komórkowe z wyznaczonych studni i przemyj je DPBS.Aspiruj DPBS, a następnie podaj 600 mikrolitrów podgrzanego 0,25% trypsyny EDTA do studni. Używając pipety P1000 powlekanej BSA, dokładnie ponownie zawiesz, aby mechanicznie rozbić ekstrakt błony podstawnej i przenieść zawartość studni do sterylnej rurki stożkowej o średnicy 15 mililitrów powłokowanej BSA. Teraz umieść stożkową rurkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po pięciu minutach dodaj 10 mililitrów 10% FBS w RPMI, aby stłumić trypsynizację. Następnie umieść probówkę w wirówce i obróć ją w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć supernatant. Używając końcówki pipety pokrytej BSA, ponownie zawiesij granulat w 100 do 300 mikrolitrach pożywki hodowli organoidów T-komórkowych lub zwykłego DMEMF 12.Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość wirusa potrzebną do osiągnięcia wielokrotności zakażeń 0,1, używając całkowitej liczby komórek i znanego miana wirusa. Aspiracja podłoża komórkowego z dołków VEO wybranych do infekcji.Każdą jamkę przemyj 500 mikrolitrami podgrzanego DPBS i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po pięciu minutach odłóż DPBS. Dodaj 500 mikrolitrów podłoża organoidowego zawierającego wystarczającą ilość cząstek wirusa, aby uzyskać wielokrotność zakażenia 0,1.Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na godzinę, delikatnie mieszając talerz ręcznie co 20 do 30 minut. Przenieś odpowiednią ilość ekstraktu z błony podstawowej potrzebnej do powlekania z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czterech stopni Celsjusza i pozwól jej rozmrażać przez osiem godzin. Sprawdź VEO pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić rozmiar i ogólny stan zdrowia.Potwierdź, że VEO mają około 100 mikrometrów średnicy, jednolitą morfologię okrągłą i minimalną liczbę pojedynczych komórek. Aspiruj podłoże komórkowe z dołków VEO i przemyj każdą dołek 500 mikrolitrami zimnego, sterylnego DPBS, utrzymującego się w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Po usunięciu DPBS należy dodać 200 do 500 mikrolitrów zimnego roztworu organoidowego do każdego otworu, zapewniając co najmniej 10-krotną objętość w porównaniu do kropli ekstraktu z błony podstawnej.Następnie, używając pipety P200 powlekanej BSA, mechanicznie rozbij ekstrakt błony podstawnej. Teraz umieść płytę na orbitalnym potrząsaczu ustawionym na około 100 obrotów na minutę przy czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji użyj końcówki pipety powlekanej BSA, aby wymieszać i przenieść zawartość każdego dołku do stożkowej rurki o średnicy 15 mililitrów powlekanej BSA.Włóż rurkę do wirówki i obracaj w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant. Przemyj granulat VEO pięcioma do dziesięcioma mililitrami zimnego DPBS i ponownie wiruj w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aspiruj DPBS, następnie używaj końcówki pipety P1000, ponownie zawiesz pellet w jednym mililitrze pożywki z hodowli organoidów T-komórkowych i umieszczaj zawiesinę VEO w lodzie, aż limfocyty T będą gotowe do współhodowli. Aby pobrać limfocyty T, sprawdź spoczynkowe limfocyty T pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić rozmiar i ogólny stan zdrowia. Potwierdź, że limfocyty T wykazują pewne skupiska, powiększoną morfologię i brak widocznych fragmentów czy zanieczyszczenia komórek.Używając pipety P1000, ponownie zawiesij limfocyty T, pipetując w górę i w dół kilka razy w każdym rogu otworu. Zbierz stożkową rurkę i policz łączną liczbę żywych limfocytów T CD8. Następnie umieść zawiesinę ogniw T do wirówki i obracaj się w temperaturze 584 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń supernatant i ponownie zawiesij osad z limfocytów T w 10 mililitrach pożywki hodowli organoidów komórek T. Następnie przenieś odpowiednią liczbę limfocytów T do stożkowej rurki zawierającej wcześniej przygotowane VEO, aby połączyć komórki. Włóż połączoną zawieszinę VEO i ogniwa T do wirówki i obróć ponownie z częstotliwością 584 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij VEO i limfocyty T w odpowiedniej objętości ekstraktu z błony podstawnej. Następnie, używając kolejnej końcówki pipety, nakładam zawiesinę na wcześniej podgrzaną płytkę do hodowli tkanek, podawając 20 mikrolitrów na dołek na płytkę z 24 dołkami. Teraz odwróć płytkę do hodowli tkankowej i umieść ją do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Należy odczekać 30 minut na całkowitą przyczepność i zastygnięcie membrany podstawnej. Po okresie inkubacji ostrożnie dodaj uzupełniony kompletny pożywkę hodowli organoidów komórek T do każdego dołku. Podawaj 500 mikrolitrów na odwierć na płytę 24-dołkową lub 250 mikrolitrów na odwór na płytę 96-dołkową, dodając medium przy ścianie studni, aby nie zakłócać kropli ekstraktu z błony podstawnej.Wymieniaj podłoże hodowlane co dwa dni, aż do pobrania próbek do analizy cytometrii przepływowej. Siedmiodniowe mysze VEO zakażone wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowych wykazujące żółte białko fluorescencyjne wykazywały obfitą replikację wirusa już cztery godziny po współhodowli, widoczną jako sygnały fluorescencyjne wewnątrz organoidów. Nagromadzenie komórek T CD8 w pobliżu zakażonych organoidów stało się wyraźne w późniejszych momentach podczas współhodowli.Stopniowe agregowanie limfocytów T CD8 wiązało się z widocznym zmniejszeniem sygnału białka żółtej fluorescencji w zakażonych organoidach w późniejszych momentach. Limfocyty T CD8 współhodowane z zakażonymi VEO wykazały zwiększoną ekspresję CD 69 i CD 103 w czasie, co wskazuje na przejęcie fenotypu pamięci rezydencyjnej w tkance. Antygen-stymulowane CD69 pozytywne, CD103 pozytywne CD8 wykazały istotny wzrost produkcji intrakomórkowego interferonu gamma i interleukiny 2 w porównaniu z kontrolą niestymulowaną.Protokół ten umożliwia badania in vitro komórek T pamięci CD8, umożliwiając efektywną manipulację komórkami nabłonkowymi i T bez uzależnienia od modeli zwierzęcych. Najważniejszym wyzwaniem w tym protokole jest utrzymanie zdrowych, żywotnych limfocytów T i nabłonka pochwy, ponieważ słaba żywotność lub infekcja zagrażają przeżyciu współkultury i efektom eksperymentalnym. Skupiliśmy się na analizie cytometrycznej przepływu, ale można zbierać współkultury do barwienia, obrazowania i sekwencjonowania.Bezpieczne nośniki umożliwiają dalsze ELISA.

in-vitro-resident-memory-cd8-t-cell-differentiation-using-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, raportujemy in vitro model różnicowania komórek B do komórek plazmatycznych.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Poznaj metodę różnicowania komórek T CD8 w pamięć rezydentną za pomocą współhodowli z organoidami nabłonkowymi. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznych in vitro bez konieczności stosowania modeli zwierzęcych.

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów