Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Transkryptomika przestrzenna oferuje przewagę nad zarówno pojedynczą komórką RNA, jak i sekwencją RNA objętościową, zachowując informacje przestrzenne w tkance. Dzięki narzędziom takim jak RNAscope, dekonwolucja obliczeniowa oraz publicznie dostępne zbiory danych pojedynczych komórek można odwzorować zachowanie komórkowe na niszę i profile genów oraz zbudować zintegrowany obraz biologii tkanek. Ta technologia eksploduje.

Dwa artykuły w Nature z maja 2025 roku koncentrują się na badaniach transkryptomiki przestrzennej. Jeśli spojrzymy na wykres PubMed, krzywa jest jeszcze bardziej stroma: około 150 artykułów przestrzennych w 2023 roku, prawie 300 w 2024 roku i zmierza się do przekroczenia 500 publikacji w 2025 roku. Transkryptomika przestrzenna już przekształciła kilka głównych obszarów badawczych, takich jak biologia nowotworów, neurobiologia, immunologia i biologia rozwojowa.

Jednak biologia naczyń pozostaje w tyle. Heterogeniczność i unikalna geometria tętnic i żył sprawiają, że są one trudne do przyczepania tkanek i zachowania RNA. Ponadto zaawansowane zmiany naczyniowe charakteryzują się zwapnieniem i zakrzepicą, które dodatkowo obniżają integralność tkanek.

Protokół ten został specjalnie zaprojektowany dla konstrukcji przypominających naczynia. Uwzględniamy także metody obniżające koszty oraz niezbędne procesy barwienia do oceny RNA, depozycji wapnia oraz interesujących komórek. Biorąc pod uwagę obecny niedobór badań transkryptomiki przestrzennej skoncentrowanej na naczyniach w porównaniu z innymi dziedzinami, protokół ten został zaprojektowany tak, aby był opłacalny i przyjazny początkującym, zapewniając badaczom naczyniowym dostępne narzędzia do wdrażania transkryptomiki przestrzennej w ich badaniach.

Protokół ten może być również pomocny dla dużych prób kohortowych w eksperymentach klinicznych. W tym protokole opisujemy szczegółowe procedury obejmujące staranne obchodzenie się z zwapniałymi tkankami tętnic, metody wapnienia właściwości mające na celu zachowanie jakości RNA i morfologii tkanek, techniki barwienia dla weryfikacji i wytycznych podczas wyboru ROI oraz końcowe barwienie markerów morfologicznych na przygotowanych preparatach, zapewniając ich gotowość do obróbki na cyfrowym przyrządzie profilującym przestrzennym. Ludzkie tętnice piszczelowe, w tym tętnice piszczelowe przednie, tylne i kroczowe, zostały pobrane z próbek amputacji pacjenta i przechowywane w DMEM zawierającym 1% HEPES i 1% Strep-Gym.

Każda tętnica jest przenoszona do 100-milimetrowej szalki Petriego wraz z ośrodkiem. Nadmiar tkanki łącznej okołonaczyniowej usuwa się za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, pozostawiając jedynie ścianę tętnicy. Przycięta tętnica jest przenoszona do nowej szalki Petriego.

Wewnątrz naczynia przygotowuje się sterylną deskę do krojenia. Tętnice są przecinane na segmenty o średnicy jednego centymetra za pomocą ostrza chirurgicznego. Dwa segmenty każdej tętnicy są zamrażane w kriotubach w ciekłym azocie w celu kriokonserwacji i przechowywania na przyszłe badania białkowe lub RNA.

Pozostałe segmenty umieszcza się w probówkach o średnicy 15 mililitrów zawierających 10% neutralnej buforowanej formaliny i utrwala w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Przygotowuje się roztwór dekalcyfikacyjny z 10% EDTA w roztworze stabilizującym RNA, regulując pH do 5,2 dla roztworu roboczego. Utrwalone tkanki są przenoszone do nowej misy zawierającej PBS, a chusteczki są krótko myte.

Każda próbka jest przenoszona do probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej roztwór dewapnifikujący i mieszana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po zakończeniu odwapnienia próbki są myte dwukrotnie za pomocą PBS z delikatnym mieszaniem przez pięć minut. Tkanki są przenoszone do kaset.

Kasety są umieszczane w procesorze tkankowym. Przetwarzanie formaliny trwa co najmniej cztery godziny. Czas może być zmieniany w zależności od macierzy próbki.

Na każdy blok umieszcza się wiele segmentów tętnic. Blok wypełnia się parafiną i pozwala mu całkowicie ostygnąć. Preparaty przygotowuje się przez zaznaczenie ograniczonej powierzchni tkanki na tylnych stronach preparatów.

Potwierdź, że wszystkie segmenty mieszczą się w obszarze ograniczonym wymaganym przez instrument DSP GeoMx. Nadmiar parafiny jest usuwany z bloków. Następnie bloki są dzielone na pięć mikronów za pomocą niskoprofilowych łopat.

Wstążki z chusteczek są montowane w wyznaczonym obszarze. W eksperymencie DSP zamontowane są co najmniej cztery sekcje seryjne na blok dla różnych barwników. Przechowywać zamki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia.

Następnie wykonywana jest hybrydyzacja RNAscope in-situ oraz barwienie histologiczne na seryjnie przygotowanych preparatach. Ponadto inny zestaw preparatów jest barwiony markerami morfologicznymi, takimi jak CD45 dla komórek odpornościowych oraz alfa-SMA dla komórek mięśni gładkich. Procedura hybrydyzacji RNAscope in-situ składa się krótko z czterech głównych etapów: wypiekanie szkiełków jako preparat wstępny, standardowa deparafinizacja i rehydratacja, odzyskiwanie celu, hybrydyzacja sondą z amplifikacją sygnału oraz barwienie barwnikami w celu wizualizacji RNA.

Do walidacji histologicznej wykonywane są zarówno barwienia H&E, jak i Alizarin Red S, aby umożliwić precyzyjną lokalizację osadów wapnia. Na koniec barwienie markerów morfologicznych przeprowadza się za pomocą standardowego protokołu immunohistochemicznego w celu identyfikacji interesujących komórek i wyznaczania selekcji ROI. W tym badaniu porównano dwa protokoły oparte na EDTA: jeden – 10% EDTA samodzielnie przez 72 godziny oraz drugi, 10% EDTA i roztwór stabilizujący RNA przez ten sam czas.

Morfologia i jakość RNA oceniano za pomocą hybrydyzacji in-situ w RNAscope. Obie metody zachowały architekturę naczyń, ale preparaty poddane EDTA i koktajlu stabilizującego RNA wykazały wyraźnie silniejsze sygnały RNA, co pokazano na prawym panelu, wskazując, że roztwór stabilizujący RNA chroni transkrypty, podczas gdy EDTA cheluje krystaliczny fosforan wapnia i stopniowo zmiękcza próbkę bez aktywacji RNaz. Po zoptymalizowaniu strategii zachowania RNA i potwierdzeniu jakości demonstrujemy kroki barwienia histologicznego przy depozycji wapnia przy użyciu hematoksyliny, eozyny i Alizarin Red S. Alizarin selektywnie wiąże jonowe sole wapniowe i zmienia odcień z pomarańczowego na ceglasty czerwony, wyraźnie podkreślając mikro i makro zwapnienia, choć zapewnia mniej szczegółów macierzy komórkowej i zewnątrzkomórkowej niż H&E.

Stosowanie obu barwników maksymalizuje informacje strukturalne i składowe. Po barwieniu markerów morfologicznych preparaty są skanowane na platformie GeoMx. Przeciwciało CD45 oznacza komórki odpornościowe, podczas gdy alfa-mięśniowa aktyna oznacza komórki mięśni gładkich naczyń obfitych w ośrodku.

Wybrane ROI obejmują około 100 do 150 jąder z odpowiednią wydajnością RNA. ROI zostały umieszczone obok i w odległości od zwapnionych obszarów, aby porównać przestrzenne wzorce ekspresji genów istotne dla zwapnienia przyśrodkowej tętnicy piszczelowej. Pomimo pewnej utraty tkanek podczas wielogodzinnych etapów przetwarzania, w każdej sekcji tętnicy zidentyfikowano wiele odpowiednich zwrotów z inwestycji.

Podsumowując, ten workflow obejmuje obsługę zwapniałych tkanek tętnic oraz odwapnianie poprzez walidacyjne barwienie i wybór zwrotu z inwestycji w badanie transkryptomiki przestrzennej. W szczególności połączenie H&E z barwieniem alizarynowym specyficznym dla wapnia zapewnia precyzyjną lokalizację wapnienia naczyniowego oraz maksymalizuje zarówno informacje strukturalne, jak i składowe dla umieszczenia ROI. Analiza RNAscope pokazuje, że zdewapnifikowane przekroje tętnic pozostają w dużej mierze nienaruszone przy odpowiedniej ilości RNA.