Name: Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę dekalcynacji tętnic z zachowaniem RNA i morfologii do analizy przestrzennej. Protokół obejmuje barwienie Alizarin Red S, RNAscope oraz selekcję ROI na platformie Nanostring GeoMx DSP dla badań naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez grant początkowy od VA Puget Sound, nagrodę VA Merit I01 BX004975-02 oraz zasoby i korzystanie z obiektów w VA Puget Sound Health Care Center. Prace są autorstwa autorów i niekoniecznie odzwierciedlają stanowisko lub politykę Departamentu ds. Weteranów czy rządu Stanów Zjednoczonych. Chcielibyśmy podziękować za usługi obrazowania świadczone przez Histologię oraz Obrazowanie Core (HIC) na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Chcielibyśmy podziękować dr Shreeramowi Akileshowi za wsparcie w zakresie eksperymentów DSP na Uniwersytecie Waszyngtońskim oraz jego grupie w MANTIS Labs: UW Spatial Biology Core. Chcielibyśmy również podziękować Nishi Ivanovu z Diabetes Research Center na Uniwersytecie Waszyngtońskim za barwienie histologiczne.

Wszystkie procedury pobierania próbek tętniczych u ludzi zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Waszyngtońskiego Human Subjects Division oraz IRB VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). Przed pobraniem tkanek uzyskano od pacjentów pisemne świadome zgody. Materiały i sprzęt użyte do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przycinanie i utrwalanie tkanek
<ol>
	<li>Przycinanie tkanek<ol>
		<li>Przygotuj torbę transportową, używając wielowarstwowego opakowania, zawierającego dętkę wewnętrzną, pojemnik wtórny, zewnętrzny pojemnik transportowy oraz worek na próbki biologiczne. Napełnij wewnętrzną rurkę wirówki o pojemności 50 mL 30 mL nośnika Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) zawierającego 1% 4-[2-hydroksyetylo]-1-piperazineetanolosulfonowego kwasu (HEPES) oraz 1% penicylin-streptomycyny (P/S).</li>
		<li>Pobrane tętnice przednie piszczelowe (AT), tylne piszczelowe (PT) i piszczelowe (PR) (najlepiej > 5 cm) umieść osobno w rurkach do 50 mL wirówki. Przenieś kanistry na lodzie z sali operacyjnej do sali do sali hodowli tkanek. UWAGA: Zaleca się, aby długość pobranej próbki wynosiła co najmniej 5 cm, aby umożliwić replikacje oraz wystarczającą ilość tkanek do krioprzechowywania na potrzeby innych ocen lub walidacji.</li>
		<li>Przenieś każdą tętnicę do szalki Petriego o średnicy 100 mm razem z podłożem. Usuń nadmiar tkanek łącznych okołonaczyniowych za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, pozostawiając jedynie ścianę tętnicy (adventitia) skierowaną do środka. UWAGA: Należy obsłużyć i przyciąć tkanki w szafce zabezpieczającej biologicznie wyczyszczoną roztworem inaktywującym RNazę, aby zapobiec skażeniu RNA. Używaj sterylnych skalpeli i kleszczy; Między próbkami płucz je w wodzie sterylnej i beznukleazowej, aby usunąć resztki, a następnie dokładnie przetrzyj 70% etanolem.</li>
		<li>Krótko przepłucz przyciętą tętnicę solą fizjologiczną Dulbecco Phosphate Buffered (PBS) w nowej szalce Petriego. Umieść sterylną deskę do krojenia w świeżym naczyniu i przenieś tętnicę na nią.</li>
		<li>Przekrój poprzeczny tętnicy przekrój poprzeczny na segmenty o średnicy 1 cm za pomocą ostrza chirurgicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i przechowywanie tkanek<ol>
		<li>Szybko zamroz dwa segmenty w kriotubach do kriokonserwacji w ciekłym azocie (LN2) i przechowuj je do przyszłych badań nad białkami/RNA.</li>
		<li>Pozostałe segmenty umieść w probówkach o pojemności 15 mL zawierających 10% NBF i utrwal w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin dla segmentów tętniczych o średnicy 1 cm. UWAGA: Zaleca się stosowanie 10% NBF. Jeśli używasz 4% paradehydu (PFA), przygotuj go świeżo lub sprawdź neutralne pH przed użyciem, aby zminimalizować uszkodzenia RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dekalcyfikacja, przetwarzanie tkanek i sekcjonowanie
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór dekalcyfikacyjny: rozpuścić stały kwas etylen-diamin-tetraoctowy (EDTA) do 10% (w/v) w roztworze stabilizującym RNA (RSS). Filtracja nie jest wymagana. Reguluj pH do 9,2 za pomocą pelletów wodorotlenku sodu (NaOH), aby całkowicie rozpuścić EDTA, a następnie obniż do 5,2 przy 10 M HCl, co jest typowym pH roboczym RSS i pomaga zachować integralność RNA.</li>
	<li>Krótko ręcznie spłukaj utrwalone chusteczki w PBS. Przelej każdą próbkę do probówki 15 mL zawierającej roztwór dewapnifikujący i mieszaj w temperaturze 4 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Po zakończeniu odwapnienia należy przemyć próbki w PBS (2 × 5 min). Umieść tkanki w kasetach i załaduj je do procesora tkankowego, korzystając z programu do przetwarzania 4 godzin.</li>
	<li>Osadz wiele segmentów tętnic w każdym bloku tkankowym. Zaznacz obszar tkanki z ograniczonym dostępem na tylnych stronach i sprawdź, czy wszystkie fragmenty mieszczą się w tym obszarze.</li>
	<li>Usuń nadmiar parafiny. Bloki przecina się na 5 μm mikrotomem i niskoprofilowymi ostrzami, a przekroje tkanek montuje w wyznaczonym obszarze szkiełka. UWAGA: Pierwsze kilka sekcji po wyłożeniu odrzuć i pobierz kolejne fragmenty tkanki. Używaj pędzli wolnych od RNazy i czyść kąpiel wodną między partiami próbek.</li>
	<li>Przygotuj co najmniej cztery sekcje seryjne na blok dla różnych barwników oraz eksperymentu cyfrowego profilowania przestrzennego (DSP). Przechowywać preparaty w temperaturze 4 °C aż do użycia (najlepiej < 6 miesięcy).</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja RNAscope in-situ (ISH) i barwienie histologiczne
<ol>
	<li>RNAscope ISH<ol>
		<li>Piecz się w suchym piecu w 60 °C przez noc, aby poprawić przyczepność tkanek do szkiełek.</li>
		<li>Deparafinizacja: Zanurzanie w ksylenie (3 × 5 min), a następnie 100% etanolu (2 × 3 min). Suche ślizgi w 60 °C przez 7 minut.</li>
		<li>Wykonaj test RNAscope 2.5 HD Red ISH zgodnie z protokołem producenta. Blokuj endogenną nadoksydazę 3%H2O2 przez 10 minut w RT; płucz w wodzie destylowanej (DI).</li>
		<li>Inkubuj preparaty w podgrzanym buforze 100 °C (rozcieńczonym 1:10 w wodzie DI) przez 15 minut (użyj 200 mL bufora wyciągowego dla regału do 24 preparatów w parownicy), zanurz 100% etanolu 5 razy i susz w 60 °C przez 7 minut. Stwórz barierę hydrofobową dla roztworów wokół tkanki za pomocą hydrofobowego penetratora PAP.</li>
		<li>Umieść szkiełka w suszarni do piekarnika hybrydyzacyjnego, dodaj 200 μL suplementu enzymów trawiennych (wstępnie rozcieńczonego przez sprzedawcę w butelkach z zakraplaczami) do każdego preparatu i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 15 minut. Dwa razy opłucz szkiełka wodą DI.</li>
		<li>Na preparaty należy nałożyć Human Ppib z sondy pozytywnej kontroli i inkubować przez 2 godziny w 40 °C. Preparaty przemyć 2 razy w buforze do płukania.</li>
		<li>Wykonaj sekwencyjne wzmocnienie: AMP1 w temperaturze 40 °C przez 30 minut; AMP2 w 40 °C przez 15 minut; AMP3 w 40 °C przez 30 minut; AMP4 w 40 °C przez 15 minut; AMP5 na RT przez 30 minut; oraz AMP6 na RT przez 15 minut. Pierz przez 2 x 2 minuty pomiędzy.</li>
		<li>Dodaj roztwór roboczy Fast Red, inkubuj w RT przez 10 minut. Spuszczam wody, zanurzam szkiełki w wodzie DI, a następnie zanurz 5 razy w słodkiej wodzie DI. Potwierdź, że punkty pozytywnej kontroli Ppib pojawiają się jako wyraźne, punktowane czerwone kropki.</li>
		<li>Kontrbarwienie z 1 hematoksyliną Gill's, zanurzenie 5 razy w 2 zmianach wody DI, niebieskie w 0,02% wodorotlenku amonu i zanurzenie 5 razy w 2 zmianach wody DI. Potwierdź, że jądra barwią się na niebiesko, a morfologia tkanek jest zachowana. Pozwól szkiełom wyschnąć przez noc i przesuń się z podłożem montażowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Alizarin Red S<ol>
		<li>Dla dodatkowych sekcji seryjnych powtórz deparafinizację i nawodnienie w krokach 3.1.2.</li>
		<li>Sprawdź, że pH roztworu roboczego Alizarin Red S wynosi 4,1-4,3.</li>
		<li>Zanurz preparaty w Alizarin Red S na 30-60 sekund lub aż osady wapnia nabiorą pomarańczowo-czerwonego koloru.</li>
		<li>Strząśnij się z nadmiaru barwnika barwnego. Susz 20 szybkich zanurzeń w 100% acetonie, a potem 20 razy w acetonie i ksylenie (1:1).</li>
		<li>Oczyścić preparaty w dwóch świeżych kąpielach z ksylenem, każda po 3 minuty. Pokrywa z medium montażowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie slajdów DSP GeoMx DSP i wybór zwrotu z inwestycji
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem oczyść cały sprzęt i pojemniki roztworem inaktywującym RNAse oraz wysuszyć lub przepłuczyć wodą impregnowaną DEPC, aby zapobiec skażeniu RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami do testu przestrzennego RNA.</li>
	<li>Piecz się w suchym piecu w 60 °C przez noc, aby poprawić przyczepność tkanek do szkiełek.</li>
	<li>Deparafinizacja i nawodnienie: Zanurz zjeżdżalnie w ksylenie (3 × 5 min), następnie 100% etanol (2 × 5 min) oraz 95% etanol rozcieńczony w wodzie DEPC przez 5 minut. Przenieś slajdy na 1× PBS na 1 minutę.</li>
	<li>Inkubuj preparaty w podgrzewanym buforze antygenowym o temperaturze 100 °C o pH 9,0 przez 20 minut, a następnie przenosi preparaty do 1× PBS przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Inkubuj preparaty w podgrzewanej proteinazie K o stężeniu 1,0 μg/ml przez 15 minut i płucz w 1× PBS przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Umieść zamki w 10% NBF (200 μL na zsuwanie) przez 5 minut w RT, a płukanie w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z PBS, stuknij w ręcznik papierowy, wytrzyj nadmiar płynu otaczającego tkankę Kimwipe i umieść w stojaku do barwienia hybrydyzacji.</li>
	<li>Dodaj 200 μL roztworu hybrydyzacyjnego (rozcieńczonego 1:10 w buforze W) do każdego preparatu i nałóż slip hybrydyzacyjny. Zamknij komorę hybrydyzacji, włóż do piekarnika i inkubuj w 37 °C przez noc.</li>
	<li>Zanurz się w buforze soli fizjologicznej i cytrynianu sodu (SSC, 2×), pozwalając żeby ślizgi hybrydyzacyjne same zsunęły się w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Opłucz ślizgi w rygorystycznym buforze płukania, złożonym z równych części 4× SSC i dejonizowanego formamidu w temperaturze 37 °C, 25 minut na płukanie. Myj szkiełki w 2× buforze SSC, 2 minuty na każde pranie.</li>
	<li>Zablokuj slajdy Buffer W na RT przez 30 minut.</li>
	<li>Okryj tkankę pierwotnym roztworem przeciwciał (Rabbit anty-CD45) na 1 godzinę w pudełku z komorą wilgotności na RT, przemyj buforem 2× SSC 3 razy.</li>
	<li>Nałóż wtórny roztwór przeciwciał (Koza antykróliczy IgG-AF647) przez 1 godzinę i przemyj w buforze SSC o 2×.</li>
	<li>Okryj tkankę oznakowanym przeciwciałem (Myszy anty-SMA-AF488) na 1 godzinę w pudełku z wysuwaniem komory wilgotności w RT. Przemyj w buforze SSC 2×.</li>
	<li>Barw szkiełka przez 10 minut w 2 μM markerze jądrowym Syto83 rozcieńczonym w buforze W przez 10 minut.</li>
	<li>Zeskanuj preparaty instrumentem do profilowania RNA, aby zwizualizować barwienie markerów morfologicznych. Wybierz ROI od bliższych i dalszych do zwapniałych zmian tkanki tętnicowej, notując lokalizację specyficzną dla każdej warstwy ROI. UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas nakładania slipu hybrydyzacyjnego na przekroje tkanek.</li>
</ol>

<ol><li>Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+tissue+architecture+using+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics.</a> Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).</li>
<li>Dries, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+spatial+transcriptomic+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in spatial transcriptomic data analysis.</a> Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).</li>
<li>Schmitd, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+transcriptomic+analysis+of+perineural+invasion+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer.</a> Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).</li>
<li>Bassiouni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomic+analysis+of+a+diverse+patient+cohort+reveals+a+conserved+architecture+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer.</a> Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).</li>
<li>Hirz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+suppressive+human+prostate+tumor+microenvironment+via+integrated+single-cell+and+spatial+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses.</a> Nat Commun. 14 (1), 663(2023).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptome+analysis+reveals+the+cellular+heterogeneity+of+liver+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer.</a> Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).</li>
<li>Eyers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+of+the+microenvironment+of+muscle+invasive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer.</a> Commun Biol. 7 (1), 737(2024).</li>
<li>Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+spatial+transcriptomics+data+using+giotto%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing spatial transcriptomics data using giotto.</a> Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).</li>
<li>Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+single-cell+RNA-seq+and+spatial+gene+expression+integration+and+interactive+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).</li>
<li>Ibarra-Lopez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+profiling+of+protein+and+rna+expression+in+tissue%3A+An+approach+to+fine-tune+virtual+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection.</a> J Vis Exp. (185), e62651(2022).</li>
<li>Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+enable+spatial+transcriptomics+of+bone+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues.</a> J Vis Exp. (207), e66850(2024).</li>
<li>Sun, P., Li, M., Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+decipher+complex+spatial+transcriptomics+data+using+stminer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer.</a> STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).</li>
<li>Luo, Z., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+preparing+fresh+frozen+soybean+tissues+for+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics.</a> STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gene+expression+of+human+coronary+arteries+revealed+the+molecular+features+of+diffuse+intimal+thickening+in+explanted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts.</a> Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).</li>
<li>Pelisek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+vascular+biobank%3A+Evaluation+of+optimal+extraction+method+and+admission+solution+for+preserving+RNA+from+human+vascular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue.</a> J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).</li>
<li>Nam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+and+storage+of+human+tissue+samples+on+nucleic+acid+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation.</a> Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).</li>
<li>Juwayria,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+integrated+spatial+transcriptomics+%28MIST%29+for+affordable+and+robust+digital+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Syst+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology.</a> NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+benchmarking+of+imaging+spatial+transcriptomics+platforms+in+ffpe+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Smith, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+spatial+transcriptomics+performed+on+clinically+sourced+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues.</a> Lab Invest. 104190, (2025).</li>
<li>Amancherla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+responses+to+rejection+in+the+transplanted+human+heart+revealed+through+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBolen%2C+M+%22Ffpe+tissue+microarray+protocol%22">Ffpe tissue microarray protocol</a>. , (2024).</li>
<li>Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+construction+of+a+tissue+microarray+using+the+tape+method+and+a+handheld+microarrayer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer.</a> J Vis Exp. (184), e63086(2022).</li>
<li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+a+critical+role+of+novel+pro-inflammatory+endothelial+cells+in+mediating+adverse+remodeling+in+coronary+artery-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip.</a> Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+coronary+perivascular+adipose+tissue+from+end-stage+heart+failure+patients+identifies+SPP1%2B+macrophage+subpopulation+as+a+target+for+alleviating+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).</li>
<li>Mao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+coronary+heterogeneity+and+identifies+CD133%2B+TRPV4high+endothelial+subpopulation+in+regulating+flow-induced+vascular+tone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+the+carotid+artery+and+femoral+artery+of+rats+exposed+to+hindlimb+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading.</a> Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).</li>
<li>Deroo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vein+wall+cell+atlas+of+murine+venous+thrombosis+determined+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing.</a> Commun Biol. 6 (1), 130(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Protokół ten szczegółowo opisuje kroki niezbędne do przygotowania zwapniałych tętnic piszczelowych do profilowania transkryptomicznego przestrzennego na NanoString GeoMx DSP. Tętnice piszczelowe, jak wszystkie naczynia, posiadają koncentryczne warstwy intim, ośrodka i adventitia, z których każda zawiera odrębne populacje komórek koordynujących uszkodzenia i naprawę. Utrzymanie architektury tych warstw jest niezbędne dla analiz transkryptomicznych z rozdzielczością warstwową, jednak kilka często pomijanych etapów przygoto...

W ciągu ostatniej dekady sekwencjonowanie nowej generacji i obrazowanie wysokorozdzielcze połączyły się w rozwoju transkryptomiki przestrzennej, metody kwantyfikacji całego transkryptomu przy jednoczesnym zachowaniu precyzyjnego umiejscowienia każdego transkryptu w przekrojach tkanek 1,2. W połączeniu z szybko dojrzewającym polem sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), podejścia przestrzenne zapewniają efektywną drogę łączenia sygnatur genowych z konkretnymi typami komórek, stanami i niszami w tkance lub narządzie, co znacznie wzbogaca nasze zrozumienie mechanizmów chorób 3,4,5,6,7 . Rozwijane są liczne komercyjne platformy, takie jak 10X Visium, NanoString GeoMx i CosMx, Slide-seq oraz DBiT-seq, każda wspierana protokołami zoptymalizowanymi pod miękkie, wysokokomórkowe tkanki, takie jak guzy i tkanka mózgowa. Dziedzina ta doświadcza gwałtownego wzrostu, a PubMed indeksuje około 150 publikacji w 2023 roku, prawie 300 w 2024 roku oraz zmierza do przekroczenia 500 w 2025 roku. Pomimo tego wzrostu, biologia naczyń pozostaje niedostatecznie reprezentowana w porównaniu z nowotworami, neurobiologią i immunologią.
Twarde lub mineralizowane tkanki, takie jak kości, chrząstki, zęby oraz tętnice lub żyły pełne płytki nazębnej, zwapiałe i zwapiałe, okazały się znacznie mniej podatne na ustępstwo. Przeszkody techniczne są wielowymiarowe. Po pierwsze, tkanki o gęstych matrycach mineralnych wymagają chelatacji lub usunięcia kwasowego, agresywnych zabiegów, które mogą fragmentować RNA i zniekształcać morfologię tkanek. Po drugie, chore tkanki, zarówno uszkodzone, jak i włókniste, często zawierają niewiele żywych komórek osadzonych w obfitej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co zmniejsza wydajność transkryptu i komplikuje normalizację danych. Ponadto tkanki naczyniowe posiadają cienką, koncentryczną strukturę (intima, media, adventitia) owiniętą wokół pustego lumenu. Ograniczona grubość ścianek, zwłaszcza intimów pojedynczej warstwy, sprawia, że obszary przechwytu mogą zawierać skąpe tkanki, a przekroje mogą się rozerwać lub odłączyć podczas wielogodzinnych etapów barwienia i hybrydyzacji. W rezultacie badania transkryptomii przestrzennej tkanki naczyniowej pozostają rzadkie, mimo że choroby sercowo-naczyniowe konsekwentnie należą do głównych przyczyn zgonów i poważnych zachorowalności na całym świecie. Istniejące artykuły protokołowe w dużej mierze kładą nacisk na przetwarzanie, wizualizację danych lub platformy inne niż NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13. Wśród tych artykułów niewiele opisuje metody laboratoryjne do przetwarzania chorych tętnic piszczeliowych, będących klinicznie istotnym naczyniem w chorobie tętnic obwodowych (PAD), zwłaszcza u pacjentów z cukrzycą, którzy stanowią rosnący odsetek populacji dotkniętej chorobą.
Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy kompleksowy przepływ pracy dla zwapniałych tętnic piszczelowych uzyskanych od pacjentów z PAD, którzy przeszli amputację. Protokół obejmuje następujące kroki: (1) przycinanie tkanek i sekcje bezpośrednio po pobieraniu z sali operacyjnej; (2) prawidłowe utrwalanie tkanek i odwapnianie, które zachowują integralność morfologii tkanek i RNA; (3) budowę oszczędnych mikromacierzy tkankowych (TMA) w celu minimalizacji efektów wsadowych; (4) hybrydyzacja in situ RNA oraz histologiczne barwienie wapnia dla kontroli jakości; oraz (5) Strategia wyboru regionu zainteresowania (ROI) specjalnie zaprojektowana dla zwapniałych tętnic piszczelowych na platformie GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Etapy te obejmują wszystkie procedury przed pobraniem próbek na instrumentie DSP, przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie oraz analizę danych.
Chociaż są zademonstrowane na referencyjnej platformie DSP, zasady te mogą kierować przygotowaniem tkanek do 10X Visium lub innych platform, a metodologia jest łatwo adaptowalna do dodatkowych łóżek naczyniowych lub modeli zwierzęcych. Protokół ten może być dostosowany do biobanków i tkanek pośmiertnych, ale jego skuteczność zależy w kluczowej mierze od warunków zachowania, utrwalenia i przechowywania tkanek. Tkanki należy utrwalić natychmiast po zbiorze, aby zminimalizować czas niedokrwienności (najlepiej w ciągu 1 godziny). Standardowa formacyna z buforem neutralnym 10% (NBF) jest zalecana przez co najmniej 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT). Tkanki powinny być natychmiast osadzone po utrwaleniu i nie powinny być przechowywane w etanolu dłużej niż 3 dni. Bloki z parafiną zakorzenioną w formalinie (FFPE) przetwarzane i przechowywane w zalecanych warunkach pozostają odpowiednie do profilowania przestrzennego przez około 3 lata, choć jakość RNA spada wraz ze starzeniem bloku. W związku z tym zaleca się ocenę jakości RNA dla próbek o niskiej komórkowości, bloków przechowywanych przez 6 miesięcy, próbek biobankowych oraz tkanek pośmiertnych. Minimalna akceptowalna jakość RNA zależy od wybranego testu, wyboru zwrotu z inwestycji, pożądanej rozdzielczości oraz rekomendacji głównych placówek. W praktyce zaleca się około 50-100 jąder na segment, aby uzyskać solidne rezultaty. Platforma DSP obsługuje zarówno FFPE, jak i świeże mrożone chusteczki. W tym protokole koncentrujemy się na tkankach FFPE.
Chociaż badanie koncentruje się na transkryptomice przestrzennej, jest łatwo zintegrowane z scRNA-seq. Korzystając z opublikowanych zbiorów danych scRNA-seq oraz obliczeniowej dekonwolucji przestrzennej, można oszacować proporcje typów komórek dla każdego miejsca przestrzennego, a stany komórek zdefiniowane przez scRNA-seq na architekturę tkanki. Utrzymując zarówno strukturę, jak i integralność RNA, nasz protokół umożliwia późniejszą walidację pojedynczych lub pojedynczych cząsteczek, maksymalizując biologiczne wglądy z cennych próbek naczyniowych oraz szersze zastosowanie transkryptomiki przestrzennej w badaniach biologii naczyniowej.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowany Medium Eagle's Dulbecco (DMEM), wysokoglukozowy, piruwatowy &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowy (HEPES), 1 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S), 10 000 U/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna formalina buforowana (NBF)</td><td>Millipore Sigma</td><td>65346-M</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylen-diaminowy-tetraoctowy (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie stabilizacyjne RNAlater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7024</td><td>Roztwór stabilizujący RNA (RSS)</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>322335</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odzyskiwania celów</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>322001</td><td></td></tr><tr><td>Protease Plus</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>322331</td><td>suplementacja enzymów trawiennych</td></tr><tr><td>DapB (kontrola negatywna)</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>Bufor płukania RNAscope (zestaw do analizy RNAscope 2.5 HD Red ISH)</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>320058</td><td></td></tr><tr><td>AMP1</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324511</td><td></td></tr><tr><td>AMP2</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324512</td><td></td></tr><tr><td>AMP3</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324513</td><td></td></tr><tr><td>AMP4</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324514</td><td></td></tr><tr><td>AMP5 Red</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324515</td><td></td></tr><tr><td>AMP6 Red</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324516</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red A</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>324517</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie PPIB</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>313901</td><td></td></tr><tr><td>Gill' S hematoksylyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>Pobranie antygenów, Tris/EDTA pH 9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4956-58</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie hybrydyzacji - Hs WTA</td><td>Nanostruny</td><td>121401102</td><td></td></tr><tr><td>Hybrislip</td><td></td><td></td><td>Slip hybrydyzacyjny</td></tr><tr><td>Rozwiązanie hybrydyzacyjne - Bufor R</td><td>Nanostruny</td><td>121300313</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anty-CD45&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>1317</td><td></td></tr><tr><td>Bufor W</td><td>Nanostruny</td><td>121300313</td><td></td></tr><tr><td>IgG-AF647 przeciwko kozom</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-605-144</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-SMA-AF488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>53-9760</td><td></td></tr><tr><td>Syto83&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11364</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>BD Biosciences</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost&nbsp; Plus szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Pióro ImmEdge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łopatki mikrotomowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-500-125</td><td></td></tr><tr><td>PROSZĘ DO WOLI</td><td></td><td></td><td>Roztwór inaktywujący RNazę</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HybEZ do pieca hybrydyzacyjnego &nbsp;</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>Nanostring&nbsp;</td><td>Model: GeoMx DSP Platforma dostępu do danych: GeoMx DSP Control Center (wersja 3.1.2.12)</td><td>Ustawienie skanowania kanału: dla FITC czas eksplozji wynosi 300 ms, a fluorofor to AlexaFluro 488; dla kanału Cy3 czas naświetlania wynosi 50 ms, a fluorofor to Syto83; a dla kanału Cy5 czas naświetlania wynosi 300 ms, a fluorofor to AlexaFluor 647.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i rna do cyfrowego profilowania przestrzennego

Calcified Artery Preparation and Processing with Preserved Morphology and RNA for Digital Spatial Profiling

Transkryptomika przestrzenna mapuje profile całego transkryptomu bezpośrednio na przekroje tkanek, korelując sąsiedztwa komórkowe z ekspresją genów oraz to, jak te działania wpływają na zdrowie i chorobę. Chociaż podejście to zrewolucjonizowało onkologię, neurobiologię, immunologię, nauki rozwojowe i wiele innych dziedzin, jest mniej powszechnie stosowane w biologii naczyniowej, mimo że choroby naczyń pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie. Dwie przeszkody wyróżniają się: tętnice i żyły oferują niewielką płaską powierzchnię do przecięcia, a chore okazy, często miażdżyce, zakrzepowe, pełne blaszek nazębnych lub zwapniałe, wymagają surowych zabiegów, takich jak odwapnienie, które zagrażają morfologii i integralności RNA. Jednak te same naczynia, ze swoimi koncentrycznymi strukturami warstwowymi intim, media i adventitia, są idealne do analizy przestrzennej, ponieważ każda warstwa zawiera różne typy komórek i programy genowe, które oddziałują na ścianie.
Niewiele szczegółowych protokołów dotyczy przygotowania tkanek naczyniowych do transkryptomiki przestrzennej. Ten niedobór ogranicza zdolność badaczy do pełnego wykorzystania potencjału tej techniki. Aby zniwelować tę lukę, przedstawiamy krok po kroku workflow zoptymalizowany pod kątem tętnic piszczelowych z zaawansowanymi zmianami. Protokół obejmuje obsługę tkanek, fiksację oraz właściwą dewapnifikację, które zachowują strukturę i jakość RNA, a następnie występuje barwienie histologiczne do poziomu skali zwapnienia. Opisujemy również konstrukcję mikromacierzy tkankowej (TMA) w celu ograniczenia efektów wsadowych i strategii wyboru obszarów zainteresowania (ROI) na NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). 
Poprzez obniżenie barier technicznych, protokół ten umożliwia badaczom naczyniowym generowanie wiarygodnych danych transkrypcji przestrzennej oraz badanie specyficznych dla warstw aktywności transkrypcyjnej w zdrowych i chorych naczyniach. Przewidujemy, że przyspieszy to odkrywanie mechanizmów leżących u podstaw zwapnienia, stanu zapalnego, miażdżycy i innych patologii naczyniowych oraz sprzyja szerszemu wdrażaniu transkryptomiki przestrzennej w biologii naczyniowej.

Opisany tutaj protokół prowadzi badaczy od otrzymania tętnic piszczelowych do generowania szkiełów TMA, które zachowują zarówno morfologię, jak i integralność RNA do analizy transkryptomiki przestrzennej. Opisuje również metody histologiczne wizualizacji osadów wapnia w tętnicach, barwienie markerów morfologicznych oraz strategie selekcji ROI.
Na Rysunku 1 tętnice są utrwalone w 10% NBF (krok 2). NBF szybko przenika tkankę, minimalizując degradację RNA, a jego buf...

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Spatial transcriptomics maps whole-transcriptome profiles directly onto tissue sections, correlating between cellular neighborhoods and gene expression ...

Transkryptomika przestrzenna oferuje przewagę nad zarówno pojedynczą komórką RNA, jak i sekwencją RNA objętościową, zachowując informacje przestrzenne w tkance. Dzięki narzędziom takim jak RNAscope, dekonwolucja obliczeniowa oraz publicznie dostępne zbiory danych pojedynczych komórek można odwzorować zachowanie komórkowe na niszę i profile genów oraz zbudować zintegrowany obraz biologii tkanek. Ta technologia eksploduje.Dwa artykuły w Nature z maja 2025 roku koncentrują się na badaniach transkryptomiki przestrzennej. Jeśli spojrzymy na wykres PubMed, krzywa jest jeszcze bardziej stroma: około 150 artykułów przestrzennych w 2023 roku, prawie 300 w 2024 roku i zmierza się do przekroczenia 500 publikacji w 2025 roku. Transkryptomika przestrzenna już przekształciła kilka głównych obszarów badawczych, takich jak biologia nowotworów, neurobiologia, immunologia i biologia rozwojowa.Jednak biologia naczyń pozostaje w tyle. Heterogeniczność i unikalna geometria tętnic i żył sprawiają, że są one trudne do przyczepania tkanek i zachowania RNA. Ponadto zaawansowane zmiany naczyniowe charakteryzują się zwapnieniem i zakrzepicą, które dodatkowo obniżają integralność tkanek.Protokół ten został specjalnie zaprojektowany dla konstrukcji przypominających naczynia. Uwzględniamy także metody obniżające koszty oraz niezbędne procesy barwienia do oceny RNA, depozycji wapnia oraz interesujących komórek. Biorąc pod uwagę obecny niedobór badań transkryptomiki przestrzennej skoncentrowanej na naczyniach w porównaniu z innymi dziedzinami, protokół ten został zaprojektowany tak, aby był opłacalny i przyjazny początkującym, zapewniając badaczom naczyniowym dostępne narzędzia do wdrażania transkryptomiki przestrzennej w ich badaniach.Protokół ten może być również pomocny dla dużych prób kohortowych w eksperymentach klinicznych. W tym protokole opisujemy szczegółowe procedury obejmujące staranne obchodzenie się z zwapniałymi tkankami tętnic, metody wapnienia właściwości mające na celu zachowanie jakości RNA i morfologii tkanek, techniki barwienia dla weryfikacji i wytycznych podczas wyboru ROI oraz końcowe barwienie markerów morfologicznych na przygotowanych preparatach, zapewniając ich gotowość do obróbki na cyfrowym przyrządzie profilującym przestrzennym. Ludzkie tętnice piszczelowe, w tym tętnice piszczelowe przednie, tylne i kroczowe, zostały pobrane z próbek amputacji pacjenta i przechowywane w DMEM zawierającym 1% HEPES i 1% Strep-Gym.Każda tętnica jest przenoszona do 100-milimetrowej szalki Petriego wraz z ośrodkiem. Nadmiar tkanki łącznej okołonaczyniowej usuwa się za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, pozostawiając jedynie ścianę tętnicy. Przycięta tętnica jest przenoszona do nowej szalki Petriego.Wewnątrz naczynia przygotowuje się sterylną deskę do krojenia. Tętnice są przecinane na segmenty o średnicy jednego centymetra za pomocą ostrza chirurgicznego. Dwa segmenty każdej tętnicy są zamrażane w kriotubach w ciekłym azocie w celu kriokonserwacji i przechowywania na przyszłe badania białkowe lub RNA.Pozostałe segmenty umieszcza się w probówkach o średnicy 15 mililitrów zawierających 10% neutralnej buforowanej formaliny i utrwala w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Przygotowuje się roztwór dekalcyfikacyjny z 10% EDTA w roztworze stabilizującym RNA, regulując pH do 5,2 dla roztworu roboczego. Utrwalone tkanki są przenoszone do nowej misy zawierającej PBS, a chusteczki są krótko myte.Każda próbka jest przenoszona do probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej roztwór dewapnifikujący i mieszana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po zakończeniu odwapnienia próbki są myte dwukrotnie za pomocą PBS z delikatnym mieszaniem przez pięć minut. Tkanki są przenoszone do kaset.Kasety są umieszczane w procesorze tkankowym. Przetwarzanie formaliny trwa co najmniej cztery godziny. Czas może być zmieniany w zależności od macierzy próbki.Na każdy blok umieszcza się wiele segmentów tętnic. Blok wypełnia się parafiną i pozwala mu całkowicie ostygnąć. Preparaty przygotowuje się przez zaznaczenie ograniczonej powierzchni tkanki na tylnych stronach preparatów.Potwierdź, że wszystkie segmenty mieszczą się w obszarze ograniczonym wymaganym przez instrument DSP GeoMx. Nadmiar parafiny jest usuwany z bloków. Następnie bloki są dzielone na pięć mikronów za pomocą niskoprofilowych łopat.Wstążki z chusteczek są montowane w wyznaczonym obszarze. W eksperymencie DSP zamontowane są co najmniej cztery sekcje seryjne na blok dla różnych barwników. Przechowywać zamki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia.Następnie wykonywana jest hybrydyzacja RNAscope in-situ oraz barwienie histologiczne na seryjnie przygotowanych preparatach. Ponadto inny zestaw preparatów jest barwiony markerami morfologicznymi, takimi jak CD45 dla komórek odpornościowych oraz alfa-SMA dla komórek mięśni gładkich. Procedura hybrydyzacji RNAscope in-situ składa się krótko z czterech głównych etapów: wypiekanie szkiełków jako preparat wstępny, standardowa deparafinizacja i rehydratacja, odzyskiwanie celu, hybrydyzacja sondą z amplifikacją sygnału oraz barwienie barwnikami w celu wizualizacji RNA.Do walidacji histologicznej wykonywane są zarówno barwienia H&E, jak i Alizarin Red S, aby umożliwić precyzyjną lokalizację osadów wapnia. Na koniec barwienie markerów morfologicznych przeprowadza się za pomocą standardowego protokołu immunohistochemicznego w celu identyfikacji interesujących komórek i wyznaczania selekcji ROI. W tym badaniu porównano dwa protokoły oparte na EDTA: jeden – 10% EDTA samodzielnie przez 72 godziny oraz drugi, 10% EDTA i roztwór stabilizujący RNA przez ten sam czas.Morfologia i jakość RNA oceniano za pomocą hybrydyzacji in-situ w RNAscope. Obie metody zachowały architekturę naczyń, ale preparaty poddane EDTA i koktajlu stabilizującego RNA wykazały wyraźnie silniejsze sygnały RNA, co pokazano na prawym panelu, wskazując, że roztwór stabilizujący RNA chroni transkrypty, podczas gdy EDTA cheluje krystaliczny fosforan wapnia i stopniowo zmiękcza próbkę bez aktywacji RNaz. Po zoptymalizowaniu strategii zachowania RNA i potwierdzeniu jakości demonstrujemy kroki barwienia histologicznego przy depozycji wapnia przy użyciu hematoksyliny, eozyny i Alizarin Red S. Alizarin selektywnie wiąże jonowe sole wapniowe i zmienia odcień z pomarańczowego na ceglasty czerwony, wyraźnie podkreślając mikro i makro zwapnienia, choć zapewnia mniej szczegółów macierzy komórkowej i zewnątrzkomórkowej niż H&E.Stosowanie obu barwników maksymalizuje informacje strukturalne i składowe. Po barwieniu markerów morfologicznych preparaty są skanowane na platformie GeoMx. Przeciwciało CD45 oznacza komórki odpornościowe, podczas gdy alfa-mięśniowa aktyna oznacza komórki mięśni gładkich naczyń obfitych w ośrodku.Wybrane ROI obejmują około 100 do 150 jąder z odpowiednią wydajnością RNA. ROI zostały umieszczone obok i w odległości od zwapnionych obszarów, aby porównać przestrzenne wzorce ekspresji genów istotne dla zwapnienia przyśrodkowej tętnicy piszczelowej. Pomimo pewnej utraty tkanek podczas wielogodzinnych etapów przetwarzania, w każdej sekcji tętnicy zidentyfikowano wiele odpowiednich zwrotów z inwestycji.Podsumowując, ten workflow obejmuje obsługę zwapniałych tkanek tętnic oraz odwapnianie poprzez walidacyjne barwienie i wybór zwrotu z inwestycji w badanie transkryptomiki przestrzennej. W szczególności połączenie H&E z barwieniem alizarynowym specyficznym dla wapnia zapewnia precyzyjną lokalizację wapnienia naczyniowego oraz maksymalizuje zarówno informacje strukturalne, jak i składowe dla umieszczenia ROI. Analiza RNAscope pokazuje, że zdewapnifikowane przekroje tętnic pozostają w dużej mierze nienaruszone przy odpowiedniej ilości RNA.

calcified-artery-preparation-processing-with-preserved-morphology-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje procedurę z użyciem barwnika Sudan IV do barwienia złogów tłuszczu w pobranym łuku aorty myszy w celu wizualizacji blaszek miażdżycowych i określenia zakresu miażdżycy.

Barwienie Sudan IV: procedura barwienia blaszek miażdżycowych obciążonych lipidami w pobranym łuku aorty myszy

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia u myszy Rosa26tdtomato (wszechobecne w wszystkich komórkach)/Cre (specyficznie wyrażane w chondrocytach): jeden z 2.3Col1a1-GFP (specyficzny dla osteoblastów) i jeden z immunofluorescencją (specyficzny dla komórek kostnych). Dane wskazują na bezpośrednią transformację chondrocytów w komórki kostne.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na odwapnienie świeżo pobranych tkanek kostnych i zachowanie wysokiej jakości RNA. Przedstawiono również metodę cięcia próbek niezdemineralizowanych kości z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie (FFPE) w celu uzyskania dobrej jakości wyników, jeśli świeże tkanki nie są dostępne lub nie można ich pobrać.

Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Aspiracja tkanki tłuszczowej z poduszeczki tłuszczowej jest preferowaną, małoinwazyjną i niskokosztową metodą wykrywania amyloidu w diagnostyce amyloidozy systemowej w porównaniu z innymi technikami. Niniejszy artykuł wideo przedstawia schemat procedury wykonywania aspiracji tkanki tłuszczowej wraz z odpowiednim przygotowaniem preparatu w celu uzyskania optymalnego wyniku diagnostycznego.

Wykonanie i przetwarzanie cienkoigłowej aspiracji (FNA) przedniej poduszki tłuszczowej w kierunku amyloidozy

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Poznaj metodę dekalcynacji tętnic z zachowaniem RNA i morfologii do analizy przestrzennej. Protokół obejmuje barwienie Alizarin Red S, RNAscope oraz selekcję ROI na platformie Nanostring GeoMx DSP dla badań naczyniowych.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Przeglądaj więcej filmów