Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych
19 września 2025
Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.
Nasze badania koncentrują się na chorobie atakującej medycznie delikatne niemowlęta zwanej martwica jelit, czyli NEC. Naszym celem jest odkrycie mechanizmów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną w NEC oraz opracowanie strategii wczesnego wykrywania i zapobiegania chorobie. Badanie reakcji komórek odpornościowych jelit u noworodków z NEC jest bardzo wymagające. Nasz protokół wypełnia tę lukę, pokazując jak odizolować komórki odpornościowe blaszki właściwej do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.
Aby rozpocząć, uzyskaj hodowlę bakterii jelitowych hodowane z niemowlęcia z martwica jelit totalis, czyli NEC. W dniu eksperymentu 0 o godzinie 15:00, za pomocą pipety przelej 20-mikrolitrową alikwotę hodowli do 15-mililitrowej eprubki hodowlanej zawierającej 2 mililitry bulionu Luria-Bertani. Inkubuj hodowlę bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w orbitalnym szale obrotowym ustawionym na 1G, upewniając się, że pokrywka eprubki jest w pozycji wentylowanej.
Równocześnie inkubować drugą epruwetkę hodowlę zawierającą tylko 2 mililitry bulionu Luria-Bertani jako kontrolę, aby sprawdzić ewentualne zanieczyszczenie. Następnego dnia o godzinie 7:00, przelej 125 mikrolitrów nocnej hodowli bakteryjnej do kolby hodowlowej T75 z wentylowanym wieczkiem zawierającej 25 mililitrów bulionu Luria-Bertani. Przygotuj łącznie cztery kolby T75 i inkubuj w pozycji pionowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w orbitalnym szale obrotowym ustawionym na 1G.
O godzinie 9:00 w dniach eksperymentu 1, 2 i 3, połącz 16 mililitrów mieszanki dla niemowląt z 8 mililitrów mleka dla szczeniąt w sterylnej 50-mililitrowej epruwetce do przygotowania mieszanki dla niemowląt. Odetnij nadstan od dwóch 50-mililitrowych epruwetek zawierających osiadłą hodowlę bakteryjną. Dokładnie resuspenduj każdą z dwóch osadów w 2 mililitrach przygotowanej mieszanki dla niemowląt.
Następnie przelej oba resuspendowane mieszaniny do pozostałej mieszanki dla niemowląt, aby stworzyć łącznie 24 mililitry mieszanki NEC. Oznakuj sześć 50-mililitrowych epruwetek z sześcioma punktami karmienia. Przelej 4 mililitry mieszanki NEC do każdej z sześciu oznakowanych epruwetek.
Następnie przygotuj sześć jednorazowych alikwot lipopolisacharydów w stężeniu 5 miligramów na mililitr i przechowuj w mikroepruwetkach o niskim wiązaniu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Tuż przed karmieniem rozmroź lipopolisacharyd i przemieszaj przez 15 sekund. Dodaj obliczoną objętość lipopolisacharydu do 4-mililitrowej epruwetki mieszanki NEC i dobrze przemieszaj za pomocą pipety.
Napełnij 1-mililitrową strzykawkę przygotowaną mieszanką NEC i podłącz ją do żyłkowej linii PICC dla noworodków. Aby podać mieszankę NEC każdemu szczeniakowi przez zgłębnik, delikatnie zaciśnij szczeniaka za luźną skórę u podstawy szyi i przytrzymaj go pionowo. Odległość wprowadzania linii PICC jest równa odległości od kącika ust do wierzchołka plamki mlecznej w żołądku.
Optymalny punkt wprowadzania na linii PICC powinien być zaznaczony za pomocą trwałego markera. Za pomocą kleszczy przeprowadź linię PICC do gardła i dalej do żołądka. Jeśli napotkasz opór, usuń linię PICC, przesuń ją i spróbuj ponownego wprowadzenia.
Wlej powoli 80 mikrolitrów mieszanki NEC do żołądka. Monitoruj szczeniaka pod kątem objawów aspiracji podczas karmienia. Po karmieniu usuń linię PICC i obserwuj szczeniaka pod kątem trudnego oddychania lub wymiotów.
Jeśli wystąpi wymioty, osusz usta i nos szczeniaka za pomocą bezfiltrowej szmatki laboratoryjnej. Powtórz proces karmienia we wszystkich punktach karmienia. W dniu eksperymentu 4, uzyskaj tkankę jelitową od eutanalizowanych myszy noworodków.
Za pomocą nożyczek przetnij jelito wzdłuż, aby je otworzyć, a następnie przekroj je poprzecznie na segmenty o długości 1-1,5 centymetra. Przenieś segmenty jelita do 15-mililitrowej epruwetki średnicowej zawierającej 10 mililitrów roztworu predygestywnego, który został schłodzony na lodzie. Następnie inkubujej epruwetkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym obracaniem przez 20 minut, aby rozpocząć dysocjację tkanki.
Delikatnie obróć epruwetkę, aby unieść rozluźnioną tkankę, a następnie wylej zawartość przez sitko komórkowe o średnicy 100 mikrometrów umieszczone na szczycie 50-mililitrowej epruwetki średnicowej. Przenieś pozostałe fragmenty tkanki do nowej 15-mililitrowej epruwetki średnicowej zawierającej 10 mililitrów roztworu trawiennego podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Inkubuj próbkę z ciągłym obracaniem przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przelej zawartość do automatycznej epruwetki do dysocjacji tkanki. Uruchom program z czterema 15-sekundowymi cyklami obrotu naprzemiennie w kierunku wskazówek i przeciwnie do wskazówek zegara. Gdy dysocjacja jest zakończona, delikatnie przemieszaj zawiesinę komórek
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół indukcji martwiczego zapalenia jelit (NEC) u noworodków myszy, który stanowi model ściśle naśladujący przebieg tej choroby u przedwcześnie urodzonych niemowląt. Protokół łączy karmienie mieszanką mlekozastępczą, przerywaną hipoksję, doustne podanie lipopolisarydu (LPS) oraz bakterii jelitowych pochodzących od niemowlęcia z NEC, aby wiarygodnie odtworzyć kluczowe cechy patologiczne i immunologiczne NEC. Dodatkowo w artykule opisano metody izolacji komórek odpornościowych z własnej blaszki błony śluzowej jelita cienkiego, co umożliwia kompleksowe profilowanie immunologiczne za pomocą cytometrii przepływowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neonatalna gastroenterologia
- Immunologia
- Eksperymentalne modelowanie chorób
Wstęp
- Martwicze zapalenie jelit (NEC) to zagrażająca życiu choroba zapalna dotykająca jelita wcześniaków.
- NEC charakteryzuje się uszkodzeniem nabłonka, dysbiozą mikrobiologiczną oraz rozregulowaną odpowiedzią immunologiczną.
- Modele zwierzęce są niezbędne do zrozumienia patogenezy NEC i opracowywania metod leczenia.
- Modele mysie, które odwzorowują cechy ludzkiego NEC, znacząco przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny.
Cel badania
- Stworzenie powtarzalnego neonatalnego modelu NEC u myszy, który odzwierciedla charakterystykę choroby u ludzi.
- Umożliwienie badania odpowiedzi immunologicznych w NEC poprzez izolację komórek blaszki właściwej.
- Ułatwienie szczegółowego profilowania komórek immunologicznych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
Zastosowane metody
- Indukcja NEC u noworodków myszy poprzez karmienie preparatem mlekozastępczym, przerywaną hipoksję, podawanie LPS doustnie oraz bakterie jelitowe od pacjenta z NEC.
- Ocena histologiczna uszkodzenia jelit.
- Izolacja komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego.
- Analiza cytometryczna populacji komórek odporności wrodzonej i nabytej.
Główne wyniki
- Protokół ten wiarygodnie indukuje cechy histologiczne, transkrypcyjne i immunologiczne zgodne z ludzkim NEC.
- Umożliwia szczegółowe profilowanie populacji komórek odpornościowych jelit.
- Wspiera badania nad wrodzonymi i adaptacyjnymi odpowiedziami immunologicznymi w NEC.
- Przyczynił się do wielu kluczowych odkryć w badaniach nad NEC.
Wnioski
- Ten neonatalny model mysi stanowi niezawodne narzędzie do badania patogenezy NEC oraz odpowiedzi immunologicznych.
- Protokół ten wspiera badania translacyjne nakierowane na opracowanie nowych terapii NEC.
- Izolacja i profilowanie komórek odpornościowych są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Solidne modele przedkliniczne są niezbędne do ograniczania ryzyka wczesnych hipotez terapeutycznych w przypadku zapalnych chorób jelit, takich jak martwicze zapalenie jelit (NEC). Ten noworodkowy model mysi, w połączeniu z profilowaniem komórek odpornościowych blaszki właściwej, umożliwia analizę mechanistyczną szlaków chorobowych i odpowiedzi immunologicznych istotnych dla ludzkiego NEC. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o postępach translacyjnych w zakresie strategii immunomodulacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w badaniach nad szlakami odpornościowymi zaangażowanymi w patogenezę NEC.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez odtworzenie cech ludzkiej choroby in vivo.
- Ułatwia analizę uszkodzeń nabłonka i dysregulacji odpornościowej w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiew i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, istotny w kontekście choroby system do oceny związków immunomodulujących.
- Umożliwia ilościowe profilowanie komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wspiera standaryzację testów i porównywalność między badaniami w ramach procesów przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia przedkliniczne profilowanie immunologiczne ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów w NEC.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację kandydatów terapeutycznych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój celów immunologicznych w chorobach jelit u noworodków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten sytuuje badanie szlaków odpornościowych na styku wczesnego etapu odkryć i walidacji przedklinicznej, wspierając identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne w zakresie NEC.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i biologiczną ocenę ryzyka mechanizmów odpornościowych w NEC.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne odczyty komórek odpornościowych do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia analizę cytometryczną populacji odporności wrodzonej i nabytej na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z przedklinicznymi punktami końcowymi zorientowanymi na biomarkery.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia platformę wielokrotnego użytku do profilowania odpornościowego w ramach programów B+R skoncentrowanych na NEC.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych oraz zapewnia klarowność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i profilowanie komórek odpornościowych w celu uzyskania reprodukowalnych i skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji go/no-go i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach w portfolio NEC.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów immunologicznych i kandydatów terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w pracy z noworodkami myszy oraz w technikach izolacji komórek odpornościowych.
- Wymaga dostępu do aparatury do cytometrii przepływowej i infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów izolacji i profilowania komórek pomiędzy zespołami.
- Możliwe może być dostosowanie metody do innych modeli chorobowych lub grup wiekowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność modelu oraz zmienność techniczną procedur u noworodków.
