Name: Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj metodę oceny dynamiki mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych przy użyciu mikroskopii konfokalnej i fluorescencji Dendra2. Technika ta umożliwia śledzenie transplantowanych mitochondriów i ocenę ich funkcjonalności w komórkach biorczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane grantami badawczymi z grantu National Institute of Health numer 5R01DK135470-03, grantem ISAC-NIH 5U24DK128851-03 oraz stypendium podoktorskim American Heart Association.

Cała praca ze zwierzętami była wykonywana zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Temple, Temple University (Protokół Zwierzęcy-5183). Myszy Pham, które mają mitochondria ekspresujące białko Dendra2, zostały zakupione.
1. Przygotowanie pożywki hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Izoluj komórki proksymalne nerki rurkowate zgodnie z protokołem po ich oddzieleniu od komórek śródbłonka kłębuszkowego za pomocą kulek24 (Rysunek 1A). Bouchareb i in. opracowali metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka kłębuszkowego (GEC) z nerek myszy transgenicznych, które ekspresują fluorescencyjne mitochondria (mito-dendra2) za pomocą kulek magnetycznych. Po izolacji GEC rurki pozostawione w osadzie są izolowane i hodowlane.</li>
	<li>Posiew komórek rurkowatych nerek bliższych w naczyniu o średnicy 10 cm z 10 mL DMF-12 wzbogaconym o 5% FBS (inaktywowane przez ciepło), penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (100 μg/mL). Hoduj kanaliki przez 2-3 dni, aż wyjdą z nich.</li>
	<li>Wybieraj komórki rurkowate według morfologii po głodzeniu (z DMF-12 bez FBS) przez 2 dni. UWAGA: Do eksperymentów używaj dysku z 50-70% zbieżnymi komórkami. Policz komórki hemocytometrem przed zasiewaniem.</li>
	<li>Rozsiewanie komórek do eksperymentów: Rozsiewaj komórki na szklanych płytach hodowlanych o gęstości 1-5 ×10-5 komórek na odwiert, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Pozwól komórkom przykleić się i rosnąć przez noc, zanim dodasz cisplatynę. UWAGA: Cisplatina to niebezpieczny lek chemioterapeutyczny, dlatego kluczowe jest przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa, aby chronić personel i środowisko. W tym celu należy stosować się do instrukcji dotyczących szafki bezpieczeństwa biologicznego klasy II, środków ochrony osobistej (PPE), dekontaminacji, kontroli wycieków oraz utylizacji odpadów (chemioterapia odpadami leków niebezpiecznych): noś podwójne rękawiczki, okulary, odczyszcz powierzchnię roboczą i trzymaj zestaw do usuwania rozcieków blisko stanowiska pracy, wyraźnie oznacz pojemnik na odpady. Dla DMSO noś środki ochrony osobistej, pracuj w okapie wypalającym i stosuj się do procedur dekontaminacji i usuwania rozcieków.</li>
</ol>
2. Indukcja stresu przy użyciu cisplatyny
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki cisplatynowej<ol>
		<li>Przygotuj roztwór zapasowy 50 mM cisplatyny, rozpuszczając ją w DMSO.</li>
		<li>Na płytkę hodowlową szklanej dolnej płytki przyłóż płytkę 1-5 x 10 x 10 bliskich komórek rurkowych, dodaj 2 mL podłoża DMF-12. UWAGA: Można użyć dowolnego dysku do hodowli szklanego dna.</li>
		<li>Dodaj cisplatynę do końcowego stężenia 2 μM na płytce eksperymentalnej, aby uzyskać 0,004% jako końcowe stężenie DMSO. UWAGA: Przygotuj 2 μL 50 mM cypplatyny rozcieńczonej w 1 998 μL wolnego nośnika FBS DMF-12 i dodaj 80 μL do płyty eksperymentalnej.</li>
		<li>Inkubuj komórki przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Wykorzystanie mikroskopu konfokalnego<ol>
		<li>Konfiguruj lasery na 405 nm (konwersja zdjęć Dendra2), 488 nm (nieprzekonwertowane wzbudzenie Dendra2) oraz 561 nm (fotokonwertowane Dendra2, Alexa 594).</li>
		<li>Włącz lasery i daj czas na stabilizację (~10 min)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie rozszczepienia i zdarzeń fuzji<ol>
		<li>Konfiguruj lasery na 405 nm (konwersja zdjęć Dendra2), 488 nm (nieprzekonwertowane wzbudzenie Dendra2) oraz 561 nm (fotokonwertowane Dendra2, Alexa 594).</li>
		<li>Włóż dysk hodowli do komory inkubacyjnej.</li>
		<li>Dodaj wodę wokół komory i ustaw temperaturę na 37 °C. Należy utrzymać dostawyCO2 .</li>
		<li>Pozwól komorze inkubacyjnej się wyrównać. Zmiana temperatury obciąża komórki.</li>
		<li>Wizualizuj komórki za pomocą większego powiększenia i rozdzielczości do obrazowania mitochondriów.</li>
		<li>Otwórz menu rozwijane w lewym górnym rogu i wybierz opcje FRAP (rysunek 2A-D).</li>
		<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania LAS X, gdzie będzie wykonywane fotobielenie. UWAGA: Obszar zainteresowania można narysować w dowolnym rozmiarze, co nie wpływa na wyniki, ponieważ analizowane są poszczególne mitochondria.</li>
		<li>Wykonaj serię zdjęć przed wybielaniem o niskiej intensywności lasera, aby ustalić bazową intensywność fluorescencji. Ustaw lasersto405nm długości fali dla przełączania zdjęć (0,00), 48 nm (0,20) i 56 nm (0,20), zapewniając ostrość ogniw. UWAGA: Wartości w nawiasach po długościach fal lasera wskazują intensywność lasera, którą można ustawić na dowolną wartość, ponieważ nie wpływa to na fotobielenie.</li>
		<li>Aby foto-wybielić komórki, należy zastosować impuls laserowy o wysokiej intensywności, aby wybielić w wyniku zwrotu z inwestycji. Ustaw lasery FRAP na 405 nm (4,00), 488 nm (0,00) i 561 nm (0,00). Ustaw poziom przedwybielania na 5,140 s przez 59 iteracji, a po wybielaniu na pożądany czas (Rysunek 2B) (intensywność lasera przed wybielaniem i po wybielaniu są wymienione w nawiasach).</li>
		<li>W przypadku obrazowania po wybielaniu kontynuuj wykonywanie zdjęć z niską intensywnością lasera, aby obserwować odzyskiwanie fluorescencji przez 10 minut. Utrzymuj lasery FRAP na 405 nm (0,00), 488 nm (0,50) i 561 nm (0,50). UWAGA: Czas wybielania może się różnić w zależności od typu komórek, w naszych rękach podobne czasy wybielania stosowano dla mitochondriów w komórkach rurkowych oraz komórkach międzymiąższowych zastawki (VIC). Po zakończeniu FRAP można wykonać zdjęcia lub obrazowanie żywych komórek (Rysunek 3 i Wideo uzupełniające 1), oprócz pozyskania zdjęć po wybielaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
UWAGA: Ponieważ mitochondria są oznaczone białkiem Dendra2, podczas fotobielenia nieodwracalna zmiana konformacyjna w białku dendra2 prowadzi do wzrostu czerwonej fluorescencji wykrywanej przez laser 561 nm. Gdy czerwone mitochondria łączą się z niewybielonymi zielonymi mitochondriami, połączenie nadaje żółty kolor. Wykorzystując to zjawisko, można zmierzyć dynamiczne zdarzenia rozszczepienia i fuzji.
<ol>
	<li>Profilowanie połączonych czerwonych i zielonych mitochondriów<ol>
		<li>Zainstaluj wtyczkę profilera RGB, aby profilować czerwony i zielony sygnał na całym wybranym miejscu. UWAGA: Stosuj się do instrukcji na stronie, aby dodać wtyczkę do sekcji Fiji.</li>
		<li>Otwórz ImageJ (Rysunek 4A).</li>
		<li>W menu File znajdź i otwórz plik, aby go przeanalizować (rysunek 4B).</li>
		<li>Wybierz tryb kolorowy kompozycji, sprawdź opcję automatycznego skalowania i otwórz wideo do analizy (Rysunek 4C).</li>
		<li>Wybierz prostokątny obszar do analizy (Rysunek 4D).</li>
		<li>Najedź kursorem w pobliżu wybranego obszaru prostokąta, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz duplikat (Rysunek 4E).</li>
		<li>Wybierz opcję duplikacji hiperstosu , która duplikuje wszystkie stosy obrazów (rysunek 4F).</li>
		<li>Aby przekonwertować zduplikowany stos do formatu RGB, wybierz obraz i wybierz opcję RGB w rozwijanym menu obrazu (Rysunek 4G-H).</li>
		<li>Obraz RGB jest zdublowany, wybierając tylko jedną klatkę (Rysunek 4I).</li>
		<li>Jeśli mitochondria na obrazie są zakrzywione, narysuj linię wzdłuż ich długości. Następnie przejdź do menu Edytuj , wybierz Wybrane i kliknij Wyprostowanie (Rysunek 5A).</li>
		<li>Wybierz tytuł obrazu i ustaw szerokość linii na 20 pikseli (rysunek 5B).</li>
		<li>Po wyprostowaniu mitochondriów narysuj linię wzdłuż interesujących ich mitochondriów, aby upewnić się, że są one w linii prostej (rysunek 5C).</li>
		<li>Otwórz wtyczkę RGB Profiler (Rysunek 5D).</li>
		<li>Po aktywacji wtyczka wygeneruje wykres pokazujący intensywność fluorescencji czerwonej i zielonej wzdłuż narysowanej linii. Wysokość każdego szczytu jest bezpośrednio proporcjonalna do intensywności fluorescencji (Rysunek 5E). UWAGA: Morfologię mitochondriów można również obliczyć za pomocą wtyczki analizatora mitochondriów25. Wybierz obszary używane do ekspozycji, przeanalizuj próg w wybranych obszarach, a następnie zmierz morfologię mitochondriów i analizę 2D. Można wybrać obwód obszaru i inne parametry.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analizuj zdarzenia fuzji
<ol>
	<li>Ustalenie poziomu bazowego przed fuzją: Przed fuzją mitochondriów potwierdzić, że czerwona fluorescencja (561 nm) jest zlokalizowana w jednym mitochondrionie, a zielona (488 nm) w sąsiednim. Odpowiedni wykres intensywności powinien przedstawiać dwa wyraźne szczyty, jeden czerwony i jeden zielony, z minimalnym nakładaniem się.</li>
	<li>Potwierdź zdarzenie po fuzji: Po fuzji czerwony sygnał (reprezentujący zawartość macierzy Dendra2) powinien rozprzestrzenić się do sąsiedniego zielonego mitochondrium, wskazując na mieszanie zawartości. Wykres intensywności pokaże teraz nakładające się czerwone i zielone szczyty, potwierdzając zdarzenie fuzji.</li>
	<li>Ocena zdarzeń fuzji może być określona poprzez staranny dobór zdrowych mitochondriów oraz fotowybielonych mitochondriów do fuzji w obrazowaniu żywych komórek. Zmiana stosunku czerwieni do zieleni w czasie wskazywałaby na zdarzenie fuzji.</li>
</ol>

<ol><li>Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+mammalian+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease.</a> Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).</li>
<li>Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+mitophagy%2C+and+metabolic+disease%3A+towards+assembling+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle.</a> Cell Stress. 4 (6), 147-150 (2020).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+segmentation+and+function+prediction+in+live-cell+images+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial segmentation and function prediction in live-cell images with deep learning.</a> Nat Commun. 16, 743(2025).</li>
<li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitocytosis%2C+a+migrasome-mediated+mitochondrial+quality-control+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial quality-control process.</a> Cell. 184 (11), 2896-2910.e13 (2021).</li>
<li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPBP8+modulates+mitochondrial+fission+through+a+Drp1-dependent+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPBP8 modulates mitochondrial fission through a Drp1-dependent process.</a> J Cell Sci. 137 (8), jcs261612(2024).</li>
<li>San-Millán, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+mitochondrial+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">The key role of mitochondrial function in health and disease.</a> Antioxidants. 12 (4), 782(2023).</li>
<li>Ponte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drp1-mediated+mitochondrial+fission+regulates+calcium+and+F-actin+dynamics+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Drp1-mediated mitochondrial fission regulates calcium and F-actin dynamics during wound healing.</a> Biol Open. 9 (5), bio048629(2020).</li>
<li>Sabouny, R., Shutt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dynamics+in+mtDNA+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dynamics in mtDNA maintenance.</a> J Cell Sci. 134 (24), jcs258944(2021).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+tracking+with+two-photon+phosphorescent+terpyridyl+iridium%28III%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics tracking with two-photon phosphorescent terpyridyl iridium(III) complexes.</a> Sci Rep. 6, 20887(2016).</li>
<li>Chen, W., Zhao, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+health+and+disease%3A+mechanisms+and+potential+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 333(2023).</li>
<li>Sabouny, R., Shutt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+mitochondrial+fission+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of mitochondrial fission and fusion.</a> Trends Biochem Sci. 45 (7), 564-577 (2020).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+adaptation+in+cancer+drug+resistance%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial adaptation in cancer drug resistance: prevalence, mechanisms, and management.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 97(2022).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+scaffold+SLP2+anchors+a+proteolytic+hub+in+mitochondria+containing+PARL+and+the+i-AAA+protease+YME1L%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The membrane scaffold SLP2 anchors a proteolytic hub in mitochondria containing PARL and the i-AAA protease YME1L.</a> EMBO Rep. 17 (12), 1844-1856 (2016).</li>
<li>Schiavon, C. R., Shadel, G. S., Manor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+mobility+in+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial mobility in Charcot-Marie-Tooth disease.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 624823(2021).</li>
<li>Sivakumar, A., Shanmugarajan, S., Subbiah, R., Balakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+PTEN-L+determines+cell+fate+between+apoptosis+and+survival+during+chronic+alcohol+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial PTEN-L determines cell fate between apoptosis and survival during chronic alcohol consumption.</a> Apoptosis. 25 (7-8), 590-604 (2020).</li>
<li>Simula, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+sustains+CD8%2B+T+cell+migration+for+an+efficient+infiltration+into+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism sustains CD8+ T cell migration for an efficient infiltration into solid tumors.</a> Nat Commun. 15 (1), 2203(2024).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924(2015).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+the+arrangement+of+inner+membrane+protein+complexes+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria.</a> J Cell Sci. 134 (13), jcs252197(2021).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interactome+of+intact+mitochondria+by+cross-linking+mass+spectrometry+provides+evidence+for+coexisting+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The interactome of intact mitochondria by cross-linking mass spectrometry provides evidence for coexisting respiratory supercomplexes.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (2), 216-232 (2018).</li>
<li>Karbowski, M., Cleland, M. M., Roelofs, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarbowski%2C+M+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. , Elsevier. Netherlands. (2014).</li>
<li>Kleih, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+impact+of+cisplatin+on+mitochondria+induces+ROS+production+that+dictates+cell+fate+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Direct impact of cisplatin on mitochondria induces ROS production that dictates cell fate of ovarian cancer cells.</a> Cell Death Dis. 10 (11), 851(2019).</li>
<li>Bouchareb, R., Yu, L., Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cells+with+fluorescent+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria.</a> J Vis Exp. (187), e64147(2022).</li>
<li>Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Phys%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Front Phys. 10, 855775(2022).</li>
<li>Montecinos-Franjola, F., Ramachandran, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontecinos-Franjola%2C+F+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. , Springer, US. (2020).</li>
<li>Gaspar, M. L., Chang, Y. F., Jesch, S. A., Aregullin, M., Henry, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+repressor+Opi1p+and+ER+membrane+protein+Scs2p+facilitates+transit+of+phosphatidic+acid+from+the+ER+to+mitochondria+and+is+essential+for+INO1+gene+expression+in+the+presence+of+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction between repressor Opi1p and ER membrane protein Scs2p facilitates transit of phosphatidic acid from the ER to mitochondria and is essential for INO1 gene expression in the presence of choline.</a> J Biol Chem. 292 (45), 18713-18728 (2017).</li>
<li>Karbowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarbowski%2C+M+%22Adv+Exp+Med+Biol%22">Adv Exp Med Biol</a>. , Springer, US. (2010).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+quantitatively+revealed+by+STED+nanoscopy+with+an+enhanced+squaraine+variant+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe.</a> Nat Commun. 11 (1), 3699(2020).</li>
<li>Opstad, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+data+of+mitochondria+and+lysosomes+in+cardiomyoblasts+under+normal+and+galactose-adapted+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy data of mitochondria and lysosomes in cardiomyoblasts under normal and galactose-adapted conditions.</a> Sci Data. 9 (1), 98(2022).</li>
<li>Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expansion+microscopy+to+visualize+and+characterize+the+morphology+of+mitochondrial+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 617(2020).</li>
<li>Teixeira, P., Galland, R., Chevrollier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopies%2C+technological+breakthrough+to+decipher+mitochondrial+structure+and+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic.</a> Semin Cell Dev Biol. 159 - 160, 38-51 (2024).</li>
<li>Kirchweger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+mitochondrial+fission+imaged+by+cryo-scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Snapshots of mitochondrial fission imaged by cryo-scanning transmission electron tomography.</a> J Cell Sci. 138 (9), jcs263639(2025).</li>
<li>Collins, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+morphology+and+mitophagy+in+heart+diseases%3A+qualitative+and+quantitative+analyses+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial morphology and mitophagy in heart diseases: qualitative and quantitative analyses using transmission electron microscopy.</a> Front Aging. 2, 670267(2021).</li>
<li>Marshall, A. G., Damo, S. M., Hinton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Revisiting focused ion beam scanning electron microscopy.</a> Trends Biochem Sci. 48 (6), 585-586 (2023).</li>
<li>Adebayo, M., Singh, S., Singh, A. P., Dasgupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission%3A+the+fine-tune+balance+for+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission: the fine-tune balance for cellular homeostasis.</a> FASEB J. 35 (6), e21620(2021).</li>
<li>Munro, D., Baldy, C., Pamenter, M. E., Treberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exceptional+longevity+of+the+naked+mole-rat+may+be+explained+by+mitochondrial+antioxidant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The exceptional longevity of the naked mole-rat may be explained by mitochondrial antioxidant defenses.</a> Aging Cell. 18 (3), e12916(2019).</li>
<li>Varuzhanyan, G., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics during spermatogenesis.</a> J Cell Sci. 133 (14), jcs235937(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają nic do ujawnienia.

Rozszczepienie/fuzja mitochondriów to kluczowe, dynamiczne procesy utrzymujące homeostazę mitochondrialną i żywotność komórek26. Właściwa ocena tych procesów wymaga zaawansowanych technik obrazowania do wizualizacji i ilościowego określenia morfologii, dynamiki oraz funkcji mitochondriów27,28. Do pomiaru rozszczepienia i fuzji mitochondriów stosowano różne techniki. Do zaawansowanych narzędzi należą nanoskopia Stymulowanego Emisyjnego Uszc...

Mitochondria to dynamiczny organelle odgrywający kluczową rolę w produkcji energii, śmierci komórek oraz transdukcji sygnału1. Morfologia mitochondriów odnosi się do wielkości i kształtu przedziałów mitochondrialnych, które są bardzo wrażliwe na warunki wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe oraz są kluczowe dla utrzymania zdrowia komórkowego2. Morfologia mitochondriów może dostarczyć kluczowych informacji na temat ich funkcji, jednak zmiany w kształcie mitochondriów mogą wpływać na metabolizm komórkowy i ogólny stan zdrowia3. Zaburzenia morfologii mitochondriów wiążą się z kilkoma chorobami, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, nowotworami i chorobami metabolicznymi4. Morfologia mitochondriów jest dynamicznie regulowana przez zdarzenia fuzji i rozszczepienia/fuzji, które są kluczowe dla utrzymania homeostazy komórkowej i reagowania na różne potrzeby metaboliczne 5,6.
Dynamika mitochondrialna pomaga organellom reagować na różne stresory i potrzeby metaboliczne7. Polega na ciągłym rozszczepieniu/fuzji oraz przemieszczaniu mitochondriów wewnątrz komórek lub między nimi. Mitochondria adaptują się do potrzeb energetycznych komórek poprzez zmiany morfologii w wyniku zdarzeń rozszczepienia i fuzji8. Procesy te określają kształt mitochondriów i wpływają na funkcje mitochondriów, takie jak produkcja energii wydzielanej, produkcja reaktywnych rodzajów tlenu (ROS) oraz kontrola jakości mitochondriów 7,9,10. Ponadto rozszczepienie/fuzja mitochondrialna to mechanizmy równoważące utrzymujące funkcjonalną sieć mitochondrialną11. Fuzja umożliwia wymianę zawartości mitochondrialnej, sprzyjając komplementarności i buforowaniu przed lokalnymi uszkodzeniami, natomiast rozszczepienie umożliwia segregację i usuwanie uszkodzonych mitochondriów za pomocą mitofagii 7,12. Ponadto rozszczepienie pomaga segregować uszkodzone elementy mitochondriów, które następnie są usuwane przez mitofagię, selektywny proces autofagii13. Fuzja natomiast pozwala na komplementarzację zawartości mitochondrialnej, rozcieńczając uszkodzone składniki14. Kluczowymi uczestnikami w rozszczepieniu/fuzji mitochondrialnej są mitofuzyny (MFN1/2), niezbędne do fuzji błony mitochondrialnejzewnętrznej 15,16 (OPA1): ta dynamynopodobna GTPaza odpowiada za fuzję błony mitochondrialnej16. Białka rozszczepienia obejmują białko związane z dynaminą 1 (Drp1), białko pro-rozszczepienie13,17. Białko rozszczepienia mitochondrialnego 1 (Fis1), czynnik rozszczepienia mitochondrialnego (Mff) oraz regulator rozszczepienia mitochondrialnego 1 (MTFR1L). Do badania ultrastruktury mitochondrialnej18 zastosowano kilka technik, takich jak superrozdzielczość EM. Do wizualizacji pojedynczych mitochondrialnych mRNA i powiązanych białek (smFISH) połączona z mikroskopią STED i MINFLUX superrozdzielczością (nanoskopia) zostały wykorzystane do wizualizacji pojedynczego mitochondrialnego mRNA i powiązanych białek18. Techniki mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki (SMLM) śledzą zmiany w rozstawie błon19. Mikroskopia stochastyczna optyczna rekonstrukcyjna (STORM) umożliwia badanie wewnętrznych kompleksów błon mitochondrialnych20. Jednak korzystanie z tego zaawansowanego sprzętu nie jest łatwo dostępne. Mikroskopia konfokalna jest dostępna i wymaga mniej doświadczenia. Ponadto rozwój białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na mitochondria znacząco przyspieszył badania dynamiki mitochondrialnej w żywych komórkach21, ponieważ używamy fotoaktywowalnego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) do wizualizacji i ilościowej identyfikacji fuzji mitochondrialnej22.
Aby badać rozszczepienie i fuzję mitochondriów, komórki są poddawane stresowi lub narażonym na działanie leków takich jak cisplatyna, które wiążą się z DNA i powodują uszkodzenia DNA, co kończy się apoptozą wywołaną przez mitochondria23. W tym badaniu wykorzystaliśmy mitochondria Dendra2 z fotoaktywowalnymi i oznakowanymi mitochondriami z fotoaktywowalnych myszy do badania rozszczepienia i fuzji w komórkach rurkowodów nerek objętych cisplatiną, ponieważ są one bogate w mitochondria i mają wysoką zdolność regeneracji. Jednak protokół ten może być stosowany w dowolnym typie komórek, które mają mitochondria Dendra2 oznaczone fotoprzełączalnie (Rysunek 1A-C).

<table><tbody><tr><td><silna>hodowla komórek&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Podstawa podłoża&nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. Nr 11320033 )&nbsp;</td><td>Hodowla komórek rurkowatych w bliskim proksym;</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodu (FBS) &nbsp;</td><td>5-10% suplementacji&nbsp;</td><td>(Biowest/Cat. Nr S181B) &nbsp;</td><td>Wzbogacanie medium kulturowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>100X&nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. Nr 15140122) &nbsp;</td><td>Ochrona antybiotykowa &nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagen IV i bezpłodny;</td><td>powłoka &nbsp;</td><td>(Sigma-C5533-5M) i cnot;</td><td>Powłoka płytowa Ibidi &nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>0,25% roztworu&nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. Nr 25200056) &nbsp;</td><td>Odłączenie komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS) &nbsp;</td><td></td><td>(Gibco/Cat. Nr 10010023 )&nbsp;</td><td>Mycie komórek &nbsp;</td></tr><tr><td><silne>Treatments&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin&nbsp;</td><td>2 & mikro; M koncentracja robocza &nbsp;</td><td>(Selleck Chemicals/Cat. Nr S1166) &nbsp;</td><td>Indukcja naprężeń&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO) &nbsp;</td><td>kontrola pojazdów&nbsp;</td><td>(Fisher Scientific/Cat. Nr D1391) &nbsp;</td><td>Kontrola rozpuszczalnika cisplatyny&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaging&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium bez fenolu czerwonego (Phenol Red-Free&nbsp);</td><td>obrazowanie na żywo&nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. nr 21041025) &nbsp;</td><td>Zmniejszona fluorescencja tła&nbsp;</td></tr><tr><td>Biologia molekularna&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&reg; &nbsp;</td><td>Ekstrakcja RNA&nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. nr 15596018) &nbsp;</td><td>Całkowita izolacja RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix &nbsp;</td><td>qPCR chemia&nbsp;</td><td>(Termo Naukowe/Cat. Nr K0221) &nbsp;</td><td>Ekspresja genów dynamiki mitochondrialnej (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) &nbsp;</td></tr><tr><td>Narzędzia fluorescencyjne &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dendra2&nbsp;</td><td>Tag matrycy mitochondrialnej&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacsona (PhAM<nad>wycięte</nad>)&nbsp;</td><td>Fotoprzełączalny reporter (konwersja 405nm, obrazowanie 488/561nm) &nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopes&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Leica DMi8&nbsp;</td><td>obrazowanie żywymi komórkami oraz FRAP&nbsp;</td><td>Lasery 405nm/488nm/561nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Obraz J&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka RGB Profiler & nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html.&nbsp;</td><td>Analiza zdarzeń fuzji (nakładanie się czerwonych i zielonych sygnałów)&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Assessment of Mitochondrial Fission/Fusion Dynamics in Kidney Proximal Tubular Cells

Mitochondria są najbardziej znane ze swojej roli w syntezie ATP i stanowią kluczowe regulatory metabolizmu komórkowego. Dynamika mitochondriów obejmuje ruch wewnątrzkomórkowy i międzykomórkowy mitochondriów, a także procesy rozszczepienia i fuzji. Te zdarzenia są kluczowe dla utrzymania funkcji mitochondriów poprzez utrzymanie homeostazy komórkowej, morfologii, bioenergetyki, kontroli jakości oraz reakcji na stres. Z kolei dysregulacja dynamiki mitochondriów wpływa na morfologię i funkcjonowanie komórek. Precyzyjne pomiary zdarzeń rozszczepienia i fuzji mitochondriów mogą świadczyć o zdrowiu komórkowym. Obecne metody pomiaru dynamiki mitochondriów wykorzystują zaawansowane obrazowanie, takie jak mikroskopia superrozdzielczości, techniki fluorescencji (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) do łączności oraz narzędzia optogenetyczne do kontroli przestrzenno-czasowej. Analiza ilościowa wykorzystuje narzędzia obliczeniowe do pomiaru parametrów takich jak długość, liczba i rozgałęzienie, które wskazują na równowagę rozszczepienia i fuzji. Jednak te metody wymagają umiejętności i zaawansowanych instrumentów. W tym artykule opisujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej w połączeniu z darmowymi narzędziami w ImageJ (Fidżi) do badania zdarzeń rozszczepienia i fuzji z wykorzystaniem właściwości przełączania zdjęć białka dendra2, oznaczonego jako cytochrom mitochondrialny c.

Pierwotne komórki nabłonkowe rurkowate zostały wyizolowane z nerki myszy przez trawienie enzymatyczne i hodowane w DMF-12 z dodatkiem 5% FBS oraz 1% penicylin-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Po osiągnięciu 80% konfluencji komórki były trypsynizowane (0,25% trypsyna-EDTA) i zasiewane z gęstością 5 × 104 komórek na dołek do szklanych płytek hodowlanych, wstępnie pokrytych kolagenem.
Pożywka hodowla zawierała cisplatynę w końcowym stężeniu μM w DMF-12, uzupełnion...

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Mitochondria are best recognized for their role in ATP synthesis and serve as key regulators of cellular metabolism. Mitochondrial dynamics comprehend the ...

W naszym laboratorium dążymy do przeszczepienia mitochondriów do uszkodzonych narządów, aby je odzyskać. Dlatego opracowujemy nowy protokół operacyjny, aby izolować wydajne i dynamicznie aktywne mitochondria. Wyzwania obejmują śledzenie przeszczepionych mitochondriów bez barwienia oraz dokładną ocenę ich integracji, funkcjonalności i dynamicznego zachowania z nowymi komórkami biorcą.Aby rozpocząć nasiewanie komórek rurkowych nerek w szklanych płytkach hodowlanych na dnie. Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyleganie i wzrost. Następnego dnia dodaj cisplatynę do płytki eksperymentalnej, osiągając ostateczne stężenie dwóch mikrotrzonowców.Następnie skonfiguruj lasery mikroskopu konfokalnego na 405 nanometrów, 488 nanometrów dla wzbudzenia nieprzekształconego Dendra2 oraz 561 nanometrów. Włącz lasery i daj około 10 minut na stabilizację. Włóż dysk hodowli do komory inkubacyjnej.Dodaj wodę wokół komory i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić utrzymanie dopływu dwutlenku węgla. Pozwól komorze inkubacyjnej się wyrównać przed obrazowaniem. Wizualizuj komórki za pomocą większego powiększenia i rozdzielczości do obrazowania mitochondriów.Otwórz rozwijane menu w lewym górnym rogu i wybierz Opcje FRAP. Za pomocą oprogramowania LAS X zdefiniuj obszar zainteresowania, w którym będzie wykonywane fotobielenie. Teraz zastosuj impuls laserowy o wysokiej intensywności, aby wybielić obszar zainteresowania, ustawiając lasery FRAP na 405 nanometrów przy 4,00 i 488 nanometrów przy 0,00.I 561 nanometrów przy 0,00. Ustaw czas przed wybielaniem na 5,140 sekundy przez 59 iteracji i określ czas po wybielaniu. W przypadku obrazowania po wybielaniu kontynuuj pobieranie obrazów z niską intensywnością lasera przez 10 minut, używając laserów FRAP na 405 nanometrów przy 0,00, 488 nanometrów przy 0,50.I 561 nanometrów przy 0,50. Aby profilować połączone zielone i czerwone mitochondria, najpierw zainstaluj wtyczkę RGB Profiler. Otwórz oprogramowanie ImageJ, a następnie z menu File znajdź i otwórz plik obrazu, aby go przeanalizować.Wybierz tryb kolorowy Composite, zaznacz opcję Autoscale i otwórz wideo lub stos obrazów do analizy. Narysuj prostokątny obszar nad obrazem i kliknij prawym przyciskiem, aby wybrać Zduplikuj. Wybierz opcję Duplicate hyperstack, aby zduplikować wszystkie stosy obrazów.Wybierz obraz i wybierz RGB w rozwijanym menu Obraz, aby przekonwertować zduplikowany stos do formatu RGB. Zduplikuj obraz RGB i wybierz tylko jedną klatkę. Jeśli mitochondria wydają się zakrzywione, narysuj linię wzdłuż ich długości, następnie przejdź do menu edycji, wybierz Wybrane i kliknij Wyprostuj.Teraz wybierz tytuł dla wyprostowanego obrazu i ustaw szerokość linii na 20 pikseli. Narysuj linię wzdłuż wyprostowanego mitochondrium, aby prawidłowo go wyrównać. I otwórz wtyczkę RGB Profiler.Po aktywacji wtyczka wygeneruje wykres pokazujący intensywność fluorescencji czerwonej i zielonej wzdłuż narysowanej linii. Wysokość każdego piku będzie bezpośrednio proporcjonalna do intensywności fluorescencji. Po fuzji potwierdzić, że czerwona fluorescencja rozprzestrzeniła się na sąsiednie zielone mitochondrium, co wskazuje na mieszanie zawartości.Sprawdź, czy wykres intensywności pokazuje nakładające się czerwone i zielone piki. Aby ocenić fuzję, wybierz zdrowe mitochondria i fotowybielone mitochondria do fuzji w obrazowaniu żywych komórek. Monitoruj zmiany stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej w czasie, aby wskazać zdarzenia fuzji.Komórki kontrolne wykazały wydłużone mitochondria z żółtą matrycą, co wskazuje na połączenie mitochondriów macierzy czerwonej i zielonej. Komórki leczone cyplatyną wykazywały fragmentowane mitochondria z ograniczonym nakładaniem się sygnałów czerwonych i zielonych, co sugerowało zaburzenia zespolenia. Odzyskiwanie fluorescencji w obszarze fotowybielonym spadło z czasem w komórkach kontrolnych, co wskazuje na aktywną fuzję mitochondriów.Komórki leczone cisplatyną utrzymywały niemal stabilny stosunek fluorescencji, co wskazuje na zaburzenia fuzji mitochondriów. Ekspresja CLRS-1 była istotnie zmniejszona w komórkach leczonych Cisplatiną w porównaniu z grupami kontrolnymi. Wykorzystanie ekspresji fluorescencji komórkowej oraz mitochondriów przełączalnych fotoprzełączalnymi pomaga śledzić mitochondria i oceniać ich dynamikę w komórkach biorców.Pomiar morfologii mitochondriów żywych komórek ujawnia stan zdrowia komórek w czasie rzeczywistym, oznaczanie genów oraz białka z możliwością przełączania zdjęć zwiększają dokładność i wytrzymałość. Przyszłe badania będą dotyczyć maszyn komórkowych, zarówno mitochondricznych, jak i cytoplazmatycznych, które koordynują przebudowy, aby ukształtować mitochondria rurkowe, sferyczne lub okrągłe.

assessment-mitochondrial-fissionfusion-dynamics-kidney-proximal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do analizy zmian w gęstości mitochondriów i dystrybucji podłużnej za pomocą obrazowania mięśni szkieletowych na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej do skanowania sieci mitochondrialnej.

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Poznaj metodę oceny dynamiki mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych przy użyciu mikroskopii konfokalnej i fluorescencji Dendra2. Technika ta umożliwia śledzenie transplantowanych mitochondriów i ocenę ich funkcjonalności w komórkach biorczych.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Przeglądaj więcej filmów