Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

W naszym laboratorium dążymy do przeszczepienia mitochondriów do uszkodzonych narządów, aby je odzyskać. Dlatego opracowujemy nowy protokół operacyjny, aby izolować wydajne i dynamicznie aktywne mitochondria. Wyzwania obejmują śledzenie przeszczepionych mitochondriów bez barwienia oraz dokładną ocenę ich integracji, funkcjonalności i dynamicznego zachowania z nowymi komórkami biorcą.

Aby rozpocząć nasiewanie komórek rurkowych nerek w szklanych płytkach hodowlanych na dnie. Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyleganie i wzrost. Następnego dnia dodaj cisplatynę do płytki eksperymentalnej, osiągając ostateczne stężenie dwóch mikrotrzonowców.

Następnie skonfiguruj lasery mikroskopu konfokalnego na 405 nanometrów, 488 nanometrów dla wzbudzenia nieprzekształconego Dendra2 oraz 561 nanometrów. Włącz lasery i daj około 10 minut na stabilizację. Włóż dysk hodowli do komory inkubacyjnej.

Dodaj wodę wokół komory i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić utrzymanie dopływu dwutlenku węgla. Pozwól komorze inkubacyjnej się wyrównać przed obrazowaniem. Wizualizuj komórki za pomocą większego powiększenia i rozdzielczości do obrazowania mitochondriów.

Otwórz rozwijane menu w lewym górnym rogu i wybierz Opcje FRAP. Za pomocą oprogramowania LAS X zdefiniuj obszar zainteresowania, w którym będzie wykonywane fotobielenie. Teraz zastosuj impuls laserowy o wysokiej intensywności, aby wybielić obszar zainteresowania, ustawiając lasery FRAP na 405 nanometrów przy 4,00 i 488 nanometrów przy 0,00.

I 561 nanometrów przy 0,00. Ustaw czas przed wybielaniem na 5,140 sekundy przez 59 iteracji i określ czas po wybielaniu. W przypadku obrazowania po wybielaniu kontynuuj pobieranie obrazów z niską intensywnością lasera przez 10 minut, używając laserów FRAP na 405 nanometrów przy 0,00, 488 nanometrów przy 0,50.

I 561 nanometrów przy 0,50. Aby profilować połączone zielone i czerwone mitochondria, najpierw zainstaluj wtyczkę RGB Profiler. Otwórz oprogramowanie ImageJ, a następnie z menu File znajdź i otwórz plik obrazu, aby go przeanalizować.

Wybierz tryb kolorowy Composite, zaznacz opcję Autoscale i otwórz wideo lub stos obrazów do analizy. Narysuj prostokątny obszar nad obrazem i kliknij prawym przyciskiem, aby wybrać Zduplikuj. Wybierz opcję Duplicate hyperstack, aby zduplikować wszystkie stosy obrazów.

Wybierz obraz i wybierz RGB w rozwijanym menu Obraz, aby przekonwertować zduplikowany stos do formatu RGB. Zduplikuj obraz RGB i wybierz tylko jedną klatkę. Jeśli mitochondria wydają się zakrzywione, narysuj linię wzdłuż ich długości, następnie przejdź do menu edycji, wybierz Wybrane i kliknij Wyprostuj.

Teraz wybierz tytuł dla wyprostowanego obrazu i ustaw szerokość linii na 20 pikseli. Narysuj linię wzdłuż wyprostowanego mitochondrium, aby prawidłowo go wyrównać. I otwórz wtyczkę RGB Profiler.

Po aktywacji wtyczka wygeneruje wykres pokazujący intensywność fluorescencji czerwonej i zielonej wzdłuż narysowanej linii. Wysokość każdego piku będzie bezpośrednio proporcjonalna do intensywności fluorescencji. Po fuzji potwierdzić, że czerwona fluorescencja rozprzestrzeniła się na sąsiednie zielone mitochondrium, co wskazuje na mieszanie zawartości.

Sprawdź, czy wykres intensywności pokazuje nakładające się czerwone i zielone piki. Aby ocenić fuzję, wybierz zdrowe mitochondria i fotowybielone mitochondria do fuzji w obrazowaniu żywych komórek. Monitoruj zmiany stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej w czasie, aby wskazać zdarzenia fuzji.

Komórki kontrolne wykazały wydłużone mitochondria z żółtą matrycą, co wskazuje na połączenie mitochondriów macierzy czerwonej i zielonej. Komórki leczone cyplatyną wykazywały fragmentowane mitochondria z ograniczonym nakładaniem się sygnałów czerwonych i zielonych, co sugerowało zaburzenia zespolenia. Odzyskiwanie fluorescencji w obszarze fotowybielonym spadło z czasem w komórkach kontrolnych, co wskazuje na aktywną fuzję mitochondriów.

Komórki leczone cisplatyną utrzymywały niemal stabilny stosunek fluorescencji, co wskazuje na zaburzenia fuzji mitochondriów. Ekspresja CLRS-1 była istotnie zmniejszona w komórkach leczonych Cisplatiną w porównaniu z grupami kontrolnymi. Wykorzystanie ekspresji fluorescencji komórkowej oraz mitochondriów przełączalnych fotoprzełączalnymi pomaga śledzić mitochondria i oceniać ich dynamikę w komórkach biorców.

Pomiar morfologii mitochondriów żywych komórek ujawnia stan zdrowia komórek w czasie rzeczywistym, oznaczanie genów oraz białka z możliwością przełączania zdjęć zwiększają dokładność i wytrzymałość. Przyszłe badania będą dotyczyć maszyn komórkowych, zarówno mitochondricznych, jak i cytoplazmatycznych, które koordynują przebudowy, aby ukształtować mitochondria rurkowe, sferyczne lub okrągłe.