Name: Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę obrazowania transportu endocytarnego białek transbłonowych w komórkach HeLa przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał VHH-mCherry. To podejście umożliwia badanie dynamiki endocytozy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Uniwersytet w Bazylei. Dziękujemy prof. Em. Dr Martin Spiess za tworzenie i rozmieszczenie figurek, Imaging Core Facility (IMCF) Biozentrum za wsparcie oraz PNAS za zgodę na ponowne wydanie.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nanociała stanowią szybko rozwijającą się klasę rusztowania wiążących białka, które oferują liczne zalety w porównaniu do konwencjonalnych przeciwciał: są małe, bardzo stabilne, monomeryczne, niesieciujące się, pozbawione wiązań dwusiarczkowych i mogą być selekcjonowane do wiązania o wysokiej afinitetności24. W naszym poprzednim badaniu opracowaliśmy i zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała produkowane przez ekspresję bakterii do znakowania białek wystawionych na powierzchnię oraz monitorowania ich transportu wewnątrzkomórkowego do różnych przedziałów, ze szczególnym uwzględnieniem transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego (TGN)17. Wykorzystaliśmy anty-GFP nanono, aby zapewnić wszechstronność, umożliwiając celowanie w białka fuzyjne oznaczone zewnętrznymi tagami GFP, YFP lub mCerulean – znacznikami fluorescencyjnymi szeroko dostępnymi i często już scharakteryzowanymi. Funkcjonalizacja nanoników anty-GFP z motywami sulfatacji mCherry, APEX2 lub tyrozyny pozwoliła nam wizualizować pobieranie ładunku za pomocą obrazowania stałego i żywego komórek, lokalizować przedziały transportu wstecznego na poziomie ultrastrukturalnym, przeprowadzić celowaną ablację przedziałów oraz ilościowo oceniać kinetykę transportu do TGN. Jednym z ograniczeń tego podejścia jest konieczność modyfikacji genetycznej docelowych linii komórkowych — poprzez stabilną nadekspresję lub endogenne oznaczanie — zanim funkcjonalizowane nanociała anty-GFP będą mogły być skutecznie stosowane. Jednak strategia ta może być łatwo dostosowana do rosnącego repertuaru nanociał skierowanych przeciwko nieoznakowanym, endogennym białkom docelowym generowanym poprzez szczepienia zwierząt lub selekcję in vitro z syntetycznych bibliotek VHH z wykorzystaniem technologii wyświetlania rybosomów lub fagów34. Ponadtow ostatnich latach opracowano nanociała skierowane do powszechnie używanych tagów epitopów, takich jak mCherry, V5 czy ALFA. Co istotne, niedawno wykorzystaliśmy nanobody odporny na sulfację anty-mCherry do badania retrogradacyjnego transportu CDMPR w komórkach HeLa uszczuconych GGA2 poprzez szybkie inaktywowaniefunkcjonalne 28. Małe znaczniki epitopowe oferują zaletę w zachowaniu rodzimej konformacji i funkcji docelowego białka, ponieważ rzadziej zakłócają kluczowe domeny strukturalne. Nanociała rozpoznawające te zwarte epitopy (np. ALFA, V5) mogą być płynnie zintegrowane z funkcjonalnym zestawem narzędzi nanono, aby zwiększyć jego użyteczność w badaniu mechanizmów endocytów i retrogradacji.
W niniejszym badaniu demonstrujemy zastosowanie VHH-mCherry w eksperymentach obrazowania z żywymi komórkami. Korzystając z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP jako białek reporterowych, mogliśmy wizualizować receptorowo-specyficzne endocytarne pobieranie i ich postęp w kierunku dystrybucji stacjonarnej. Ilościowa analiza transportu tych reporterów z błony plazmatycznej do ich odpowiednich przedziałów wewnątrzkomórkowych wykazała kinetykę zgodną z tą uzyskaną za pomocą testów biochemicznych przedstawionych na Rysunku 2 wcześniejszego badania17. Stwierdziliśmy, że pozorny okres półtrwania był znacznie dłuższy dla EGFP-CDMPR (~9 min) niż dla TfR-EGFP (~4 min), a sygnały stały się nasycone odpowiednio po około 43 i 20 minutach. Te ilościowe wyniki dobrze pokrywają się z wcześniej opublikowanymi danymi dotyczącymi dynamiki handlu ludźmi MPR i TfR 38,39,40. Warto zauważyć, że konstrukcja VHH-mCherry zyskała znaczące zainteresowanie środowiska badawczego, o czym świadczy liczne wnioski o dystrybucję Addgene, i została już pomyślnie wdrożona w kilku niezależnych badaniach 28,41,42,43,44.
W zależności od konfiguracji mikroskopu lub wymagań eksperymentalnych, nanociała anty-GFP oznaczone tagiem mCherry nie zawsze są optymalne. W takich przypadkach alternatywne fluorofory lub warianty białka fluorescencyjnego mogą zapewniać bardziej odpowiednie właściwości spektralne w połączeniu z liniami komórkowymi raportującymi GFP. Aby temu zaradzić, utworzyliśmy bibliotekę funkcjonalizowanych nanociał zawierającą różnorodne białka fluorescencyjne, w tym mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 oraz iRFP670 (243764-68). Te dodatkowe konstrukcje nanobody będą dostępne przez Addgene. Zastosowanie spektralnie odróżnionych fluoroforów umożliwia wyraźne rozdzielenie sygnałów wzbudzenia i emisji, co umożliwia optymalne, na żywo, w czasie rzeczywistym obrazowanie do trzech kanałów fluorescencyjnych przy minimalnym nakładaniu się spektralnego.
Chociaż monitorowanie endocytów do stanu ustalonego może wydawać się proste, śledzenie transportu wstecznego białek do TGN stanowi większe wyzwanie eksperymentalne. Oprócz VHH-mCherry oraz białka reporterowego tagowanego GFP, do wizualizacji i ilościowości potrzebny jest dodatkowy marker fluorescencyjny lub barwnik-sprzężony TGN. Jednak niektóre białka rezydentów Golgiego wykazują częściową nieszczelność na powierzchnię komórki, co może być dodatkowo pogłębiane przez zaburzenia szlaków transportu wewnątrzkomórkowego, takie jak te wprowadzane przez eksperymentalną manipulację komponentami mechanizmów transportowych. TGN46, na przykład, jest powszechnie używany jako marker rezydentny w Golgi, mimo że pełni funkcję receptora ładunkowego pośredniczącego w transporcie TGN do powierzchni komórek niektórych ładunkówwydzielniczych 16,45. Podobnie w błonie plazmatycznej wykryto glikozylotransferazy, takie jak β-1,4-galaktosyltransferaza. Chociaż te białka mogą cyklować na powierzchnię, ich dominująca lokalizacja w stanie stacjonarnym pozostaje w TGN. Oznaczanie takich markerów spektralnie odrębnym białkiem fluorescencyjnym lub tagiem zgodnym z barwnikami (np. SNAP, Halo itp.) i stabilne współekspresowanie za pomocą transbłonowego reportera tagowanego GFP umożliwiłoby ilościowe obrazowanie przybycia TGN w żywych komórkach. Można to zmierzyć analogicznie do opisanego powyżej workflow, z ilościową ilością opartą na akumulacji sygnału mCherry w kanale fluorescencyjnym odpowiadającym białkowi fuzyjnemu rezydentnemu w Golgi. Obecne strategie badania handlu retrogradacyjnego w stałych lub żywych komórkach często opierają się na konstruktach receptorów chimerycznych w połączeniu z przeciwciałami IgG (np. CD8)46,47. Jednak ryzyko sieciowania krzyżowego, wynikające z dwuwalencji konwencjonalnych IgG podczas znakowania powierzchniowego, może znacząco zmienić losy wewnątrzkomórkowe oznakowanego białka, często kierując je w kierunku degradacji lizosomalnej po endocytozie 48,49. Natomiast nanociała, ze względu na swój monovalentyjny charakter i stechiometrię wiążącą 1:1, nie indukują sieciowania, zachowując tym samym fizjologiczne szlaki transportu docelowego białka. To sprawia, że podejścia oparte na nanociałach są szczególnie cenne do badania autentycznej retrogradacyjnej dynamiki transportu bez wprowadzania sztucznych artefaktów trasowania.
Optymalne działanie tego protokołu do obrazowania żywych komórek wymaga starannej dawkowania stężenia nano, ponieważ jego nadmierne ilości prowadzą do podwyższonej fluorescencji tła spowodowanej niewiązanymi nanonikami w ośrodku. Ponadto różnice w poziomach ekspresji linii komórkowych GFP reporterowych muszą być uwzględniane podczas miażdżenia, aby zapewnić dokładne porównania ilościowe. Do produkcji nanoników indukcja niskotemperaturowa w E. coli jest kluczowa, aby sprzyjać prawidłowemu składaniu domeny mCherry. Wyższe temperatury indukcji zazwyczaj powodują nieprawidłowo fałdowane lub degradowane białko i dlatego nie są zalecane.
Sukces tego protokołu zależy krytycznie od trzech kluczowych aspektów: po pierwsze, wysokiej wydajności ekspresji i czystości funkcjonalnych konstrukcji nanono, aby zapewnić spójne oznakowanie i minimalne tło; po drugie, wykorzystanie dobrze scharakteryzowanych linii komórkowych stabilnie ekspresujących białka reporterowe tagowane GFP z lokalizacją powierzchni komórki do rekapitulacji szlaków fizjologicznych transportu; oraz po trzecie, optymalne obsługiwanie i konfiguracja zestawu mikroskopii fluorescencyjnej, w tym parametry obrazowania i separacja spektralna, umożliwiająca dokładną ilościową i jakościową analizę dynamiki transportu ładunku.
Przedstawiona tutaj metoda i protokół, skupione na wykorzystaniu nanociał anty-GFP oznaczonych tagiem mCherry, umożliwiają zarówno ilościowe, jak i jakościowe śledzenie białek cargo od powierzchni komórki do przedziałów endocytów w hodowanych komórkach ssaków. W połączeniu z fluorescencyjnie oznakowanym markerem rezydentnym Golgiego, to podejście pozwala na dalszą analizę szlaków transportu wstecznego. W związku z tym narzędzie to stanowi potężną strategię monitorowania wewnątrzkomórkowego transportu białek transbłonowych i receptorów powierzchni komórek, które wcześniej były niedostępne do znakowania z powodu braku specyficznych ligandów lub kompatybilnych odczynników wiążących monomery.

Endocytoza receptorów i innych białek transbłonowych (TM) z błony plazmatycznej do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych jest istotna dla utrzymania homeostazy błony 1,2. Po internalizacji przez endocytozę zależną od klatryny lub niezależną, ładunki białkowe najpierw zapełniają wczesne endosomy, skąd są dalej sortowane wzdłuż układu endolizosomalnego, recyklingowane do błony plazmatycznej lub retrogradywnie wysyłane do sieci trans-Golgiego (TGN)3,4,5. Recykling z endosomów i/lub powierzchni komórki do TGN jest częścią cyklu funkcjonalnego wielu transbłonowych receptorów ładunkowych, takich jak receptory manozy-6-fosforanu zależne od kationów i niezależne od kationów (CDMPR i CIMPR), dostarczające nowo syntetyzowane hydrolazy lizosomatowe z TGN do późnych endosomów i lizosomów 6,7,8. Wntless (WLS) transportuje ligandy Wnt na powierzchnię komórki9, 10,11,12, czyli TGN46, które eskortują rozpuszczalne białka wydzielnicze ładunku, w tym czynnik podwyższony (PAUF) i inne ładunki CARTS, z obszaru TGN 13,14,15,16. Podczas gdy wszystkie te receptory cargo przechodzą przez TGN w celu zbierania nowych białek klienckich, receptor transferynowy (TfR), który internalizuje transferrynę wiązaną żelazem, jest wyłączony z powrotu Golgiego 17,18,19,20,21.
Aby zbadać ruch endocytarny i retrogradacyjny, wcześniej opracowaliśmy zestaw narzędzi oparty na nanociałach, zaprojektowany do znakowania i śledzenia białek cargo od powierzchni komórki do przedziałów wewnątrzkomórkowych17. Nanocciała stanowią nową klasę wiążących białek pochodzących z homodymerycznych przeciwciał tylko na łańcuch ciężkich (hcAbs), naturalnie występujących u wielbłądów i ryb chrząstkowych22,23. Reprezentują zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VHH) hcAbs i oferują liczne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami (np. IgG): są monomeryczne, małe (~15 kDa), bardzo rozpuszczalne, pozbawione wiązań dwusiarczkowych, mogą być ekspresowane bakteriami i są podatne na selekcję do wiązania o wysokiej afinitecie24. Aby zwiększyć wszechstronność i szerokie zastosowanie tego zestawu narzędzi nano, zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała anty-GFP do znakowania powierzchniowego i śledzenia białek oznaczonych tagami GFP na ich domenach zewnętrznych lub lumenalnych. Poprzez rekombinowaną konjugację nanociał z mCherry, peroksydazą askorbianową 2 (APEX2) lub sekwencjami sulfatacji tyrozyny, retrogradacyjny transport prawdziwych białek transbłonowych ładunków można analizować za pomocą stałej i żywej mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii elektronowej lub testów biochemicznych z użyciem autoradiografii. Biorąc pod uwagę, że sulfatacja tyrozyny, katalizowana przez tyrozyloproteinowe sulfotransferazy TPST1 i TPST2, jest modyfikacją posttranslacyjną ograniczoną do trans-Golgi/TGN, ta strategia umożliwia bezpośrednią ocenę dynamiki transportu i kinetyki z powierzchni komórki do przedziału Golgiego 25,26,27. Ostatnio rozszerzyliśmy ten repertuar funkcjonalizowanych wiążących białek o derywowane nanociała anty-mCherry. Te odczynniki okazały się kluczowe w rozkładaniu maszynowo zależnych szlakow transportowych MPR, szczególnie CDMPR17,28, do TGN poprzez analizy biochemiczne.
Podczas gdy poprzednie badanie koncentrowało się głównie na zastosowaniu nanociał modyfikowanych sekwencjami sulfatacji tyrozyny do biochemicznej oceny przybycia TGN za pomocą autoradiografii19, ten artykuł metodyczny opisuje generowanie fluorescencyjnie oznakowanych, funkcjonalizowanych nanociał (VHH-mCherry) oraz linii komórkowych raportujących do obrazowania komórek żywych transportu endocytów. W połączeniu z dodatkowym fluorescencyjnym białkiem reporterowym rezydenta Golgiego, protokół ten może być dalej adaptowany, aby służyć jako solidny workflow do ilościowej analizy obrazowania obrazowania komórek żywych transportu z endosomu do TGN wybranych białek cargo.
Przed zastosowaniem tego protokołu badacze powinni upewnić się, że docelowe białko jest wyrażane jako konstrukcja fuzji oznaczona tagiem GFP, zazwyczaj generowana standardowymi metodami klonowania molekularnego. Funkcjonalizowane nanociała można łatwo wytwarzać w bakteriach przy wydajności wystarczającej do eksperymentów z oznakowaniem powierzchniowym, przy czym stężenia robocze w niskim zakresie nanomolowych są odpowiednie do większości testów obrazowania komórek żywych. Użytkownicy powinni również pamiętać, że kinetyka transportu może się różnić między białkami cargo, co wymaga regulacji czasu znakowania lub częstotliwości obrazowania, aby optymalizować transport endocytów lub endosomów do TGN.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała przeciw GFP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Produkt dystrybuowany jest przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche</td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane komórek o średnicy 100 mm</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciwaktynowe</td><td>EMD Millipore &nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw HA</td><td>z laboratorium</td><td>powstała z hybrydymy 12CA5</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-His6</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw T7 & nbsp;</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetencja&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwęglan</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M</td></tr><tr><td>Sól karbenicylina z dissodem</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, zapas wynosi 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Jaskrawy niebieski)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>rozpuszczony w sterylnym 500 mM NaH2PO4 lub DMSO</td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalania PD10</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, brak glutaminy, brak fenolu czerwonego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosforanem buforowana sól fizjologiczna (DPBS) bez Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0,45 & mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik transfekcyjny FuGENE HD</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pokrywki (nr 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Kozy antymyszy HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>Kozy antykrólicze HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Jego zestaw buforowy</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>Jego felietony GraviTrap</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &mikro;-Dobrze zrób slajd 4, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>Ibidi</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M</td></tr><tr><td>Siarczan kanamicyny</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, zapas wynosi 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Produkt dystrybuowany jest przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche</td></tr><tr><td>Heksahydrat chlorku magnezu</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX żele, 4-20%, 15-dołek</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane HeLa Kyoto</td><td>z laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alfa Kompetentna E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 przygotowań</td><td>Macherey-Nagel &nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Bioconcept&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Fenylosulfonylofluorek (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>rozpuszczony w 40% DMSO, 60% izopropanol, zapas w 500 mM</td></tr><tr><td>Linia komórkowa Phoenix ampho</td><td>Laboratorium Nolana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibren (bromek heksadymetarynowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 5 M</td></tr><tr><td>Pirotrowęglan sodu & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy &nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Endocytoza receptorów i innych białek transbłonowych od powierzchni komórki po endosomy i dalej jest kluczowa dla homeostazy, fizjologii i funkcjonowania. Aby zbadać endocyty i wsteczny transport białek, opracowaliśmy wszechstronny zestaw narzędzi zawierający funkcjonalizowane nanociała do monitorowania transportu z powierzchni komórki do sieci trans-Golgiego (TGN) za pomocą obrazowania stałego i żywego komórek, mikroskopii elektronowej oraz elektroforezy żelowej w połączeniu z autoradiografią. Opracowaliśmy pochodne nanociała skierowane na zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub mCherry – monomeryczne, niesieciujące i wysoko powinowujące białka wiążące białka – które można dodawać do linii komórkowych wyrażających interesujące białka błonowe z odpowiednimi zewnętrznymi znacznikami fluorescencji. Po związaniu z transbłonowymi reporterami tagowanymi GFP lub mCherry, nanociała są specjalnie internalizowane i przesyłane równolegle z endogennymi trasami sortowania reporterów. Te nanociałka zostały funkcjonalizowane z wybranymi fluoroforami do śledzenia transportu retrogradacyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania na żywo, z peroksydazą askorbatową 2 (APEX2) do rozdzielenia lokalizacji ultrastrukturalnej mikroskopią elektronową oraz z motywami sulfatacji tyrozyny do ilościowej oceny kinetyki przybycia TGN. W tym badaniu metodologicznym szczegółowo przedstawiamy ogólny protokół ekspresji bakterii i oczyszczania funkcjonalizowanych nanociał, a także generowanie stabilnych linii komórkowych GFP-reporter. Przykładem użyteczności tego podejścia do obrazowania komórek żywych jest wykorzystanie mCherry-modyfikowanego nanonono-GFP (VHH-mCherry) do analizy endocytarnego pobierania receptora transferyny (TfR) oraz kationowozależnego receptora mannozy-6-fosforanu (CDMPR).

Aby zbadać wsteczny transport białek do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, niedawno uruchomiliśmy narzędzie oparte na nanociałkach anty-GFP do oznaczania i śledzenia rekombinowanych białek fuzji z powierzchni komórki17. Tutaj opisujemy bakteryjną produkcję takich derivatyzowanych nanociał i pokazujemy ich przydatność w monitorowaniu endocytów za pomocą obrazowania żywych komórek. W połączeniu z fluorescencyjnym reporterem rezydentnym w Golgi, protokół ten oferuje solidną platformę do ilościowego badania wstecznego transportu wybranych białek cargo do sieci trans-Golgiego (TGN) w czasie rzeczywistym.
Wygenerowaliśmy zbiór odrębnych, funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, które dzielą wspólną modułową architekturę, wykorzystując standardowe techniki klonowania molekularnego17. Chociaż obecne badanie koncentruje się na fluorescencyjnym wariancie VHH-mCherry, dodajemy także dodatkowe derivatyzowane nanociała, aby zilustrować wszechstronność tego zestawu narzędzi i podkreślić ich potencjał do przyszłych zastosowań. Nasza najprostsza konstrukcja, VHH-std (standardowa std), obejmuje domenę VHH, epitopy T7 i HA do wykrywania na bazie przeciwciał, C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania oraz sekwencję akceptorów biotyny (BAP) umożliwiającą enzymatyczną biotinylację i testy pulldown oparte na streptawidynie o wysokiej afinitetności (Rysunek 1A). Z tego rdzenia opracowano różne pochodne nano, które ułatwiają badania endocytów i retrogradacji poprzez analizę biochemiczną, obrazowanie komórek stałych i żywych oraz mikroskopię elektronową.
Do obrazowania transportu endocytarnego w żywych komórkach zaprojektowaliśmy fluorescencyjną anty-GFP nanonobody zawierającą fluorofor z widmami wzbudzenia i emisji odmiennymi od tych GFP, zapewniając tym samym optymalną separację widmowę podczas mikroskopii fluorescencyjnej. Na podstawie jego lepszych właściwości fałdowania u E. coli indukowanego przez IPTG oraz dobrze scharakteryzowanych właściwości fotofizycznych, wybraliśmy mCherry jako flagowy tag z wyboru. Inne fluorofory przesunięte ku czerwieni, takie jak monomeryczne białko fluorescencyjne czerwonego (mRFP), również byłyby odpowiednimi alternatywami w teorii, ale mCherry okazał się szczególnie wytrzymały i skuteczny w tym układzie.
Jaki jest potencjał innych funkcjonalizowanych nanociał niż VHH-mCherry? Aby zbadać transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego (TGN), wykorzystaliśmy specyficzną lokalizację TPST specyficzną dla przedziałów, które występują wyłącznie w TGN i cisternae trans-Golgiego. W tym celu zmodyfikowaliśmy VHH-std za pomocą tandemowego motywu sulfatacji tyrozyny (2xTS) pochodzącego z procholecystokininy29 szczurów, umożliwiając tym samym biochemiczny odczyt przybycia ładunku do tych przedziałów. Podczas gdy fuzja VHH-std z mCherry umożliwia bezpośrednią wizualizację transportu retrogradacyjnego za pomocą obrazowania komórek stałych lub żywych, funkcionalizacja peroksydazami takimi jak APEX230 umożliwia lokalizację ultrastrukturalną za pomocą mikroskopii elektronowej, celowanej ablacji cytochemicznej lub testów biotynylizacji opartych na bliskości. Ponadto włączenie miejsca rozszczepienia proteazy wirusa wystrawionego tytoniu (TEV) w rusztowaniu nanononoioidów zapewnia biochemiczny sposób rozróżniania między zinternalizowanymi a powierzchniowymi nanociałkami (Rysunek 1A). Wcześniej stosowaliśmy konstrukcję VHH-tev do monitorowania kinetyki recyklingu nanociał związanych z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP17. Ponowne pojawienie się receptorów oznaczonych nanociałami na powierzchni komórki można było łatwo wykryć poprzez zastosowanie rekombinowanej proteazy TEV pozakomórkowej, co skutkowało specyficzną utratą kasety epitopu C-końcowego nanociała. Analogicznie, włączenie miejsca rozszczepienia TEV w przedstawionym mCherry funkcionalyzowanym nanoniku, VHH-mCherry umożliwia dynamiczną ocenę recyklingu raportu EGFP za pomocą obrazowania żywych komórek. Funkcjonalizację z alternatywnymi domenami białkowymi – takimi jak dodatkowe fluorofory, znaczniki enzymatyczne lub motywy sekwencji do modyfikacji posttranslacyjnej – można łatwo osiągnąć poprzez subklonowanie pożądanych insertów do szkieletu VHH-std przez miejsca restrykcyjne SpeI i EcoRI. Wszystkie funkcjonalizowane konstrukcje nanononikowe anty-GFP użyte w oryginalnym badaniu17 zostały zdeponowane w Addgene do publicznej dystrybucji.
Korzystając z opisanego powyżej protokołu, wszystkie warianty nanono, przedstawione tutaj, zostały oczyszczone do wysokiej wydajności i czystości (rysunek 1B). Tylko fuzja mCherry wykazała niewielkie przecięcie domen białkowych po oczyszczeniu (Rysunek 1B, ścieżka 5). Dwa obserwowane produkty degradacji najprawdopodobniej odpowiadają poszczególnym domenom VHH i mCherry, co można wywnioskować na podstawie ich pozornych mas cząsteczkowych i potwierdzić detekcją immunoblotową specyficzną dla epitopu (rysunek 1C). W przypadku braku współekspresyjnego BirA, VHH-mCherry zazwyczaj odzyskiwał wydajność około 20 mg na preparat. Na podstawie naszych doświadczeń, współekspresja BirA konsekwentnie zmniejsza wydajność nano-aA o około 1/3do 1/2. Biotynowalacja była dość kompletna, ponieważ nanociała z mieszaniny 1:1 z BSA zostały w pełni odzyskane przez streptawidynę-agarozę (Rysunek 1D).
Aby ocenić przydatność tego zestawu narzędzi nanono-do badania transportu endocytowego, stworzyliśmy stabilne linie komórkowe HeLa ekspresujące białka receptorów powierzchniowych oznaczone tagowaniem EGFP o wyraźnych szlakach transportu wewnątrzkomórkowego. Wśród nich były TfR, które cykluje między błoną plazmatyczną a wczesnymi (sortującymi i recyklingowymi) endosomami; TGN46, który komunikuje się między błoną plazmatyczną a TGN za pomocą wczesnych endosomów; oraz oba MPR, które przemieszczają się między TGN, błoną plazmatyczną oraz zarówno wczesnym, jak i późnym endosomem17. EGFP został zfuzowany z domeną zewnątrzkomórkową każdego receptora – konkretnie wstawiony pomiędzy peptyd sygnałowy a sekwencję receptorową dla CDMPR, CIMPR i TGN46 – oraz z końcowym punktem C TfR. Ten projekt zachował natywne domeny cytoplazmatyczne, zapewniając, że wszystkie znane sygnały sortujące pozostały nienaruszone, a tag EGFP był dostępny do wiązania przez zewnętrzne nanociała anty-GFP (Rysunek 1E). Dla CIMPR, którego domena zewnątrzkomórkowa jest wyjątkowo duża, zastosowano wersję skróconą, zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że takie skracanie zachowuje normalne zachowanie transportu31,32.
Stabilne linie komórkowe zostały ustanowione przez transdukcję retrowirusową, a następnie przez fluorescencyjne aktywowane sortowanie komórek (FACS), aby wyizolować jednorodne populacje komórek o umiarkowanym i porównywalnym poziomie ekspresji. Warto zauważyć, że EGFP-CDMPR konsekwentnie występował jako podwójny pas u immunoblotów, podobnie jak jego endogenny odpowiednik33, co wskazuje na heterogenną glikozylację. Aby ocenić, czy białka fuzyjne EGFP odtwarzają wzorce lokalizacji i ekspresji endogennych białek w stanie stacjonarnym, komórki stabilnie ekspresujące zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej (Rysunek 2B). Sygnał EGFP wiernie odzwierciedlał rozkład odpowiadających im endogennych białek. Jak można się spodziewać, CDMPR, CIMPR i ich wersje oznaczone tagowaniem EGFP lokalizowały się głównie w obszarze okołojądrowym – odzwierciedlając TGN i późne przedziały endosomalne – z dodatkowym oznakowaniem w endosomach obwodowych. Zarówno endogenne, jak i tagowane EGFP-tagowane TGN46 występowały niemal wyłącznie w TGN okołojądrowym, podczas gdy TfR i TfR-EGFP wykazywały charakterystyczny wczesny rozkład endosomów, z wyraźnym sortowaniem obwodowym i recyklingiem okojądrowym. Chociaż użyte przeciwciała wykrywały zarówno endogenne, jak i oznaczone EGFP (z wyjątkiem CIMPR), ogólna intensywność barwienia nie wzrosła znacząco w komórkach ekspresujących białka fuzyjne, co sugeruje, że konstrukty EGFP nie były znacząco nadekspresowane. Uwzględniliśmy EGFP-TGN46 i EGFP-CIMPR na Rysunku 2B dla bezpośredniego porównania z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Protokoły stosowane do utrwalania komórek i obrazowania mikroskopią fluorescencyjną zostały opisane w poprzednich badaniach 17,19.
Za pomocą VHH-mCherry transport endocytowy białek raportujących oznaczonych EGFP można monitorować za pomocą obrazowania komórek żywych. Do tego celu użyliśmy jako przykładów komórek wyrażających EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Komórki były obrazowane w czasie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po dodaniu VHH-mCherry do medium (Wideo 1 i Wideo 2). Na rysunku 3 pokazano zdjęcia z różnych momentów czasowych. Absorpcję określono poprzez pomiar sygnału w kanale mCherry, odejmowanie tła autofluorescencji i normalizację do sygnału EGFP, aby wyeliminować fluktuacje spowodowane ruchem oznakowanych przedziałów lub potencjalnymi niewielkimi przesunięciami płaszczyzny ogniskowej. Fluorescencja VHH-mCherry w ośrodku przy 25 nM była pomijalna i nie kolidowała z pomiarami. Analiza transportu reporterów z powierzchni komórki do ich przedziałów wewnątrzkomórkowych, do rozkładu stacjonarnego, dała te same wyniki kinetyczne co eksperymenty biochemiczne pokazane na Rysunku 2 poprzedniej publikacji17, z pozornym okresem półtrwania absorpcji ~9 min dla EGFP-CDMPR i ~4 min dla TfR-EGFP, a nasyceniem po ~43 min i ~20 min, odpowiednio. Wartości te były porównywalne z wynikami uzyskanymi z eksperymentów biochemicznych z użyciem testów immunoblottingowych17. Zasadniczo można również analizować kinetykę transportu wstecznego do obszarów podkomórkowych zainteresowania, takich jak obszar okołojądrowy o najwyższym stężeniu MPR. Jednak region okołojądrowy zawiera nie tylko Golgi/TGN, ale jest także wzbogacony o późne endosomy i endosomy recyklingowe. Kinetyka pochłaniania nano-nanicow do obszaru okołojądrowego nie jest wystarczająco precyzyjna, aby przeanalizować transport wsteczny do określonego organellu. Aby wiarygodniej ocenić transport z błony plazmatycznej do TGN, inne białko fluorescencyjne, białko transbłonowe obecne w TGN, musi być stabilnie współekspresowane wraz z białkiem reporterowym GFP, w taki sposób, aby nie dochodziło do spektralnego nakładania się właściwości fluoroforu. Wykorzystanie tego dodatkowego markera pozwala na wykrywanie VHH-mCherry importowanego przez reportera, analogicznego do sulfatacji tyrozyny pośredniczonej przez TPST, jak wcześniej udokumentowano19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Projektowanie i produkcja derivatyzowanych nanociał do śledzenia białek powierzchni komórek oznaczonych tagiem EGFP. (A) Schematyczny przegląd derivatyzowanych nanociał. Standardowy konstrukt nanoinoioidowy obejmuje domenę VHH specyficzną dla GFP, tagi epitopowe T7 i HA, akceptor biotyny (BAP) oraz C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania. Dodatkowe warianty nanonoioidów obejmują modyfikacje z tandemowymi miejscami sulfatacji tyrozyny (2xTS), inżynieryjną peroksydazą APEX2 lub fluorescencyjnym białkiem mCherry. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). (B) Nanociała o ekspresji bakteryjnej i oczyszczonej powinowactwie (20-50 μg) zostały przeanalizowane za pomocą gradientowego SDS-PAGE i zwizualizowane za pomocą barwienia Coomasie. Standardy masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po lewej stronie. Niewielkie przecięcie proteolityczne zaobserwowano tylko dla VHH-mCherry, prawdopodobnie występujące pomiędzy domenami VHH i mCherry. (C) Analiza immunoblowata preparatów nanonikowych (10 ng) z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom T7, HA lubHis 6 , lub wykrywana przez streptawidynę-HRP (SA-HRP) do oceny biotinylacji. (D) Zakres biotynylacji nanonanoplazmy oceniono poprzez inkubację nanociał w stosunku 1:1 z BSA, a następnie nastąpiło pulldown, granulowanie i mycie kulek przez streptawidynę-agarozę. Równoważne objętości supernatantu (S) i materiału z kulkami (B) zostały następnie przeanalizowane za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomasie. Ilościowe odzyskanie nanoników w frakcji związanej z kulkami wskazuje na całkowitą biotinylację. Obecność fragmentów VHH i mCherry w frakcji wiązanej sugeruje częściową degradację, prawdopodobnie podczas przygotowania próbki do analizy SDS-PAGE. Biała linia między pasami 2 i 3 oznacza usunięcie dwóch niepowiązanych pasów. Liczba ta została zmieniona z17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Ekspresja i wewnątrzkomórkowa lokalizacja fluorescencyjnie oznakowanych receptorów cargo oznaczonych EGFP. (A) Schematyczne przedstawienie konstrukcji fuzji EGFP. Sekwencje pochodzące z białek sekretornych transbłonowych są przedstawione na czarno, a peptydy sygnałowe N terminalne i domeny transbłonowe wewnętrzne są podświetlone na żółto. Część EGFP jest zilustrowana na zielono. Dla CDMPR, TfR i TGN46 powstały pełnowymiarowe konstrukcje, natomiast dobrze scharakteryzowany wariant skrócony użyto dla CIMPR, aby zachować normalne zachowanie handlowe. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). EGFP-CDMPR i TfR-EGFP zostały opisanewcześniej 17. (B) Aby ocenić lokalizację podkomórkową, komórki HeLa stabilnie wyrażające białka fuzyjne EGFP zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane mikroskopią fluorescencyjną. Pasek skali oznacza 10 μm. (C) komórki HeLa stabilnie wyrażające białka raportujące tagowane EGFP zostały zlikwidowane, a ekstrakty białkowe poddane SDS-PAGE, a następnie immunoblotting z użyciem przeciwciał przeciwko GFP i aktynie. Markery masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po prawej stronie. Liczba ta została zmieniona z17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Obrazowanie kinetyki endocytów nano-komórek żywymi pośredniczone przez EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Obrazowanie żywymi komórkami wykonano po dodaniu 25 nM VHH-mCherry do komórek HeLa stabilnie wyrażających (A) EGFP-CDMPR lub (B) TfR-EGFP w kompletnym medium wolnym od fenolu w temperaturze 37 °C. Komórki były obrazowane w kanałach GFP i mCherry za pomocą półautomatycznego mikroskopu fluorescencyjnego szerokiego pola w odstępach 36 sekund. Pokazane są reprezentatywne połączone zdjęcia nieruchome, wraz z powiększonym widokiem obszaru okołojądrowego (powiększenie: 2,2x) w poszczególnych kanałach poniżej. (Pręty skalowe, 10 μm.) Zobacz także Wideo 1 i Wideo 2. Analiza ilościowa kinetyki pobierania nanonoenzymów w (C) EGFP-CDMPR i (D) TfR-EGFP została przeprowadzona na podstawie danych z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował około 40 pojedynczych komórek. Aby uwzględnić ruch organelli i zmienność płaszczyzny ogniskowej, intensywność fluorescencji mCherry została znormalizowana (normowa) do sygnału GFP i nakreślona jako średnia ± SD we wszystkich komórkach z trzech eksperymentów. Średni maksymalny sygnał pochwycenia został znormalizowany do 1. Kinetyka pochłaniania dla każdej komórki była indywidualnie dopasowana za pomocą modelu kinetycznego pierwszego rzędu. Wykresy przedstawiają uśrednione krzywe wyprowadzone ze średniej odpowiadających stałych prędkości. Liczba ta została zmieniona z17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Film 1: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanonobody przez EGFP-CDMPR. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące EGFP-CDMPR były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium zawierającym 25 nM VHH-mCherry i obrazowane w kanałach fluorescencyjnych EGFP i mCherry co 36 sekund. Film był renderowany z częstotliwością odtwarzania 5 klatek/s, co odpowiada kompresji w czasie rzeczywistym 3 min/s. Ten film został zmodyfikowany z17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanono-wychwytu przez TfR-EGFP. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące TfR-EGFP były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium uzupełnionym o 25 nM VHH-mCherry i obrazowane pod kątem fluorescencji EGFP i mCherry w odstępach 36 sekund. Film był renderowany z prędkością 5 klatek/s, co reprezentuje szybkość poklatkową 3 minut/s. Ten film został zmodyfikowany z17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Endocytosis of receptors and other transmembrane proteins from the cell surface to endosomes and beyond is critical for homeostasis, physiology, and ...

Badamy endocytowy i retrogradacyjny ruch białek transbłonowych oraz mechanizmy umożliwiające transport. Do badania przepływu białek z powierzchni komórki zazwyczaj stosuje się konwencjonalne przeciwciała, które mogą jednak sprzyjać sieciowaniu krzyżowemu i celowaniu lizosomalnemu. Na początek pobierz granulat bakterii Escherichia coli przekształcony w VHH-mCherry.Dodaj 30 mililitrów buforu wiążącego lodowato zimno zawierającego 20 milimolarnych imidazolu w PBS do osadu komórek bakteryjnych. Pipetą dokładnie ponownie zawiesz pellet, pipetując w górę i w dół. Przelej ponownie zawiesinowaną mieszankę do oznaczonej rurki wirówki o pojemności 50 mililitrów.Uzupełnij ponownie zawiesowane komórki o 200 mikrogramów lizozymu na mililitr, 20 mikrogramów na mililitr DNazy I, jeden milimolowy chlorek magnezu i jeden milimolowy fenylometylosulfonylowy fluorek. Po wysiabowaniu rurki w temperaturze pokojowej przez 10 minut umieść ją na rotatorze pełnym i kontruj inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie włóż sześciomilimetrową stałą końcówkę soniatora bezpośrednio do zawiesiny komórki.Mechanicznie rozbij komórki bakteryjne za pomocą trzech jednominutowych impulsów sonikacyjnych o amplitudzie 40% oraz cyklu pracy o jednej sekundzie włączonej i jednej sekundy wyłączonej. Pozwala na minutowy odstęp chłodzenia między każdym impulsem. Po wirowaniu trzymaj wyczyszczony lizat na lodzie, przygotowując się do chromatografii powinowactwa unieruchomionego metalu, używając wcześniej zapakowanych, jednorazowych kolumn oczyszczających tag, zaprojektowanych do pracy z przepływem grawitacyjnym.Przymocuj kolumny kwasu niklowo-nitrylotienowego na metalowym stojaku lub odpowiednim uchwytie na kolumny. Następnie całkowicie opróżni bufor magazynowy z kolumny. Wyrównaj kolumnę, dodając 10 mililitrów buforu wiążącego zawierającego 20 milimolowych imidazolu w PBS.Pozwól buforowi przechodzić przez niego grawitacją. Stopniowo należy nakładać około 30 mililitrów usuniętego lizatu bakteryjnego do wyrównanej kolumny. Pozwól mu przejść przez drogę grawitacją i odrzuć przepływ.Następnie przemyj kolumnę, nakładając dwie kolejne objętości 10-mililitrowego buforu wiążącego zawierającego 20-milimolowy imidazol w PBS. Elutuj związane nanociała, aplikując dwa mililitry buforu elutycznego zawierającego 500 milimolarnych imidazolu w PBS do dwumililitrowej mikrowirówki. Wyrównuj kolumnę odsalania zasianą w adapterze rurki o pojemności 50 milimetrów, spłukując pięć razy pięcioma mililitrami PBS.Pozwól, by bufor całkowicie wszedł do upakowanej żywicy, a potem wyrzuć przepływ przez nią. Po ostatnim płukaniu wiruj kolumnę w 1000 x g przez dwie minuty. Następnie przenieś kolumnę z adapterem na nową probówkę 50 mililitrów po wyrzuceniu przepływu.Załaduj dwa mililitry eluowanego funkcjonalizowanego nanonoioidu na wstępnie wyważoną kolumnę odsalania. Następnie ponownie wiruj w 1000 x g przez dwie minuty, aby zebrać eluat przed potwierdzeniem ekspresji i czystości VHH-mCherry. Uruchom oprogramowanie automatycznego systemu obrazowania żywych komórek.Przenieś komorę mikroskopową ibidi na podium mikroskopu. Ustaw dwa kanały obrazujące z filtrami wzbudzenia i emisji dla EGFP i mCherry. Wybierz krótki czas naświetlania i niską intensywność oświetlenia, aby uniknąć wybielania zdjęć.Utrzymuj ustawienia stałe dla wszystkich eksperymentów. Miejsca mogą się różnić między reporterami. Dla każdego warunku przechowuj współrzędne 10 różnych pól widzenia zawierających od trzech do czterech ogniskowych komórek w liście punktów.Następnie wykonuje pojedyncze zdjęcie każdej pozycji z listy punktów, aby służyć jako obraz referencyjny, zanim dodam VHH-mCherry. Aby rozpocząć endocytozę, delikatnie dodaj 350 mikrolitrów podgrzanego roztworu VHH-mCherry do każdego dołka, minimalizując zakłócenia monowarstwy. Następnie przejdź do akwizycji obrazu.Wykonaj akwizję poklatkową na 100 klatek w 32. odstępie, utrzymując temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby analizować endocytyczny pobór VHH-mCherry, załaduj zestawy obrazów poklatkowych do oprogramowania do analizy obrazów. Stosuj narzędzia segmentacji i śledzenia do ilościowego określenia zinternalizowanej fluorescencji w czasie w różnych obszarach zainteresowania.Wszystkie funkcjonalizowane warianty nanono-nanicowe zostały oczyszczone do wysokiej wydajności i czystości, przy czym jedynie VHH-mCherry wykazywał niewielką degradację proteolityczną. Produkty degradacji VHH-mCherry zostały potwierdzone jako poszczególne domeny VHH-mCherry za pomocą detekcji immunoblot specyficznej dla epitopu. W braku BirA VHH-mCherry odzyskiwano w ilości około 20 miligramów na preparat.Biotinylacja została potwierdzona przez pulldown agarozy streptawidyny w mieszaninach nano-BSA. Białka fuzyjne oznaczone tagiem EGFP wyrażane w komórkach HeLa wykazywały wzorce lokalizacji podkomórkowej zgodne z ich endogennymi odpowiednikami, w tym lokalizację perijądrową EGFP-CDMPR i EGFP-CIMPR. Wyłączna lokalizacja perijądrowa EGFP-TGN46 oraz obwodowa lokalizacja TfR-EGFP.VHH-mCherry umożliwił wizualizację transmisji endocytów komórek endocytalnych EGFP-CDMPR, wykazując rosnącą kolokalizację w ciągu 60 minut. Pochłanianie VHH-mCherry do komórek ekspresujących EGFP-CDMPR osiągnęło plateau po około 43 minutach, z okresem półtrwania dziewięciu minut. W komórkach ekspresujących TfR-EGFP VHH-mCherry szybko narastała międzykomórkowo z okresem półtrwania wynoszącym cztery minuty i nasyceniem po 20 minutach.Opracowaliśmy wszechstronny zestaw narzędzi oparty na nanociałkach do analizy transportu dowolnego białka transbłonowego z powierzchni komórki. Używamy fluorescencyjnego nanociał do oznaczania białek ładunku na powierzchni, a następnie badamy ich transport endocytarny za pomocą mikroskopii żywej komórki. Dzięki naszemu podejściu opartemu na nanociałach opartym na żywych komórkach chcemy odkryć ścieżki napędzające transport ładunków z powierzchni do sieci trans-Golgi.

live-cell-imaging-endocytic-transport-using-functionalized-nanobodies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Źródło: Zhang, Y., et al. Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do wizualizacji endolizosomalnej przebudowy w ludzkich komórkach nabłonka zakażonych przez bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inwazji bakteryjnej patogeny manipulują cytoszkieletem gospodarza i układem endolizosomalnym, tworząc wakuole z wypustkami rurkowymi, które...

Wizualizacja endo-lizosomalnej przebudowy za pośrednictwem nanocząstek w komórkach zakażonych bakteriami

Ten film demonstruje metodę badania absorpcji i transportu wstecznego funkcjonalizowanych nanociał w celu zrozumienia ich wewnątrzkomórkowych szlaków transportowych. Dzięki wprowadzeniu znakowanego radioaktywnie siarczanu oraz wykorzystaniu technik izolacji i wykrywania, metoda ta umożliwia badanie wychwytu endocytarnego i docierania białek ładunkowych do sieci trans-Golgiego.

Monitorowanie przybycia białek powierzchniowych znakowanych GFP do sieci trans-Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Wsteczny transport białek z powierzchni komórki do Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony. W tym miejscu opisujemy metodę biochemicznej analizy transportu białek rekombinowanych z powierzchni komórki do Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w komórkach HeLa.

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Poznaj metodę obrazowania transportu endocytarnego białek transbłonowych w komórkach HeLa przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał VHH-mCherry. To podejście umożliwia badanie dynamiki endocytozy w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów