Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Badamy endocytowy i retrogradacyjny ruch białek transbłonowych oraz mechanizmy umożliwiające transport. Do badania przepływu białek z powierzchni komórki zazwyczaj stosuje się konwencjonalne przeciwciała, które mogą jednak sprzyjać sieciowaniu krzyżowemu i celowaniu lizosomalnemu. Na początek pobierz granulat bakterii Escherichia coli przekształcony w VHH-mCherry.

Dodaj 30 mililitrów buforu wiążącego lodowato zimno zawierającego 20 milimolarnych imidazolu w PBS do osadu komórek bakteryjnych. Pipetą dokładnie ponownie zawiesz pellet, pipetując w górę i w dół. Przelej ponownie zawiesinowaną mieszankę do oznaczonej rurki wirówki o pojemności 50 mililitrów.

Uzupełnij ponownie zawiesowane komórki o 200 mikrogramów lizozymu na mililitr, 20 mikrogramów na mililitr DNazy I, jeden milimolowy chlorek magnezu i jeden milimolowy fenylometylosulfonylowy fluorek. Po wysiabowaniu rurki w temperaturze pokojowej przez 10 minut umieść ją na rotatorze pełnym i kontruj inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie włóż sześciomilimetrową stałą końcówkę soniatora bezpośrednio do zawiesiny komórki.

Mechanicznie rozbij komórki bakteryjne za pomocą trzech jednominutowych impulsów sonikacyjnych o amplitudzie 40% oraz cyklu pracy o jednej sekundzie włączonej i jednej sekundy wyłączonej. Pozwala na minutowy odstęp chłodzenia między każdym impulsem. Po wirowaniu trzymaj wyczyszczony lizat na lodzie, przygotowując się do chromatografii powinowactwa unieruchomionego metalu, używając wcześniej zapakowanych, jednorazowych kolumn oczyszczających tag, zaprojektowanych do pracy z przepływem grawitacyjnym.

Przymocuj kolumny kwasu niklowo-nitrylotienowego na metalowym stojaku lub odpowiednim uchwytie na kolumny. Następnie całkowicie opróżni bufor magazynowy z kolumny. Wyrównaj kolumnę, dodając 10 mililitrów buforu wiążącego zawierającego 20 milimolowych imidazolu w PBS.

Pozwól buforowi przechodzić przez niego grawitacją. Stopniowo należy nakładać około 30 mililitrów usuniętego lizatu bakteryjnego do wyrównanej kolumny. Pozwól mu przejść przez drogę grawitacją i odrzuć przepływ.

Następnie przemyj kolumnę, nakładając dwie kolejne objętości 10-mililitrowego buforu wiążącego zawierającego 20-milimolowy imidazol w PBS. Elutuj związane nanociała, aplikując dwa mililitry buforu elutycznego zawierającego 500 milimolarnych imidazolu w PBS do dwumililitrowej mikrowirówki. Wyrównuj kolumnę odsalania zasianą w adapterze rurki o pojemności 50 milimetrów, spłukując pięć razy pięcioma mililitrami PBS.

Pozwól, by bufor całkowicie wszedł do upakowanej żywicy, a potem wyrzuć przepływ przez nią. Po ostatnim płukaniu wiruj kolumnę w 1000 x g przez dwie minuty. Następnie przenieś kolumnę z adapterem na nową probówkę 50 mililitrów po wyrzuceniu przepływu.

Załaduj dwa mililitry eluowanego funkcjonalizowanego nanonoioidu na wstępnie wyważoną kolumnę odsalania. Następnie ponownie wiruj w 1000 x g przez dwie minuty, aby zebrać eluat przed potwierdzeniem ekspresji i czystości VHH-mCherry. Uruchom oprogramowanie automatycznego systemu obrazowania żywych komórek.

Przenieś komorę mikroskopową ibidi na podium mikroskopu. Ustaw dwa kanały obrazujące z filtrami wzbudzenia i emisji dla EGFP i mCherry. Wybierz krótki czas naświetlania i niską intensywność oświetlenia, aby uniknąć wybielania zdjęć.

Utrzymuj ustawienia stałe dla wszystkich eksperymentów. Miejsca mogą się różnić między reporterami. Dla każdego warunku przechowuj współrzędne 10 różnych pól widzenia zawierających od trzech do czterech ogniskowych komórek w liście punktów.

Następnie wykonuje pojedyncze zdjęcie każdej pozycji z listy punktów, aby służyć jako obraz referencyjny, zanim dodam VHH-mCherry. Aby rozpocząć endocytozę, delikatnie dodaj 350 mikrolitrów podgrzanego roztworu VHH-mCherry do każdego dołka, minimalizując zakłócenia monowarstwy. Następnie przejdź do akwizycji obrazu.

Wykonaj akwizję poklatkową na 100 klatek w 32. odstępie, utrzymując temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby analizować endocytyczny pobór VHH-mCherry, załaduj zestawy obrazów poklatkowych do oprogramowania do analizy obrazów. Stosuj narzędzia segmentacji i śledzenia do ilościowego określenia zinternalizowanej fluorescencji w czasie w różnych obszarach zainteresowania.

Wszystkie funkcjonalizowane warianty nanono-nanicowe zostały oczyszczone do wysokiej wydajności i czystości, przy czym jedynie VHH-mCherry wykazywał niewielką degradację proteolityczną. Produkty degradacji VHH-mCherry zostały potwierdzone jako poszczególne domeny VHH-mCherry za pomocą detekcji immunoblot specyficznej dla epitopu. W braku BirA VHH-mCherry odzyskiwano w ilości około 20 miligramów na preparat.

Biotinylacja została potwierdzona przez pulldown agarozy streptawidyny w mieszaninach nano-BSA. Białka fuzyjne oznaczone tagiem EGFP wyrażane w komórkach HeLa wykazywały wzorce lokalizacji podkomórkowej zgodne z ich endogennymi odpowiednikami, w tym lokalizację perijądrową EGFP-CDMPR i EGFP-CIMPR. Wyłączna lokalizacja perijądrowa EGFP-TGN46 oraz obwodowa lokalizacja TfR-EGFP.

VHH-mCherry umożliwił wizualizację transmisji endocytów komórek endocytalnych EGFP-CDMPR, wykazując rosnącą kolokalizację w ciągu 60 minut. Pochłanianie VHH-mCherry do komórek ekspresujących EGFP-CDMPR osiągnęło plateau po około 43 minutach, z okresem półtrwania dziewięciu minut. W komórkach ekspresujących TfR-EGFP VHH-mCherry szybko narastała międzykomórkowo z okresem półtrwania wynoszącym cztery minuty i nasyceniem po 20 minutach.

Opracowaliśmy wszechstronny zestaw narzędzi oparty na nanociałkach do analizy transportu dowolnego białka transbłonowego z powierzchni komórki. Używamy fluorescencyjnego nanociał do oznaczania białek ładunku na powierzchni, a następnie badamy ich transport endocytarny za pomocą mikroskopii żywej komórki. Dzięki naszemu podejściu opartemu na nanociałach opartym na żywych komórkach chcemy odkryć ścieżki napędzające transport ładunków z powierzchni do sieci trans-Golgi.