Name: Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 34 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę ilościowej oceny stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Protokół wykorzystuje Actinomycin D, RT-qPCR i analizę regresji nieliniowej do modelowania dynamiki degradacji eRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez fundusz badawczy Chungnam National University [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; Program Badań Podstawowych Nauk [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] oraz Program Rozwoju Technologii Bioi i Medycznych [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT).

<ol><li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Gorbovytska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+stimulate+Pol+II+pause+release+by+harnessing+multivalent+interactions+to+NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF.</a> Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).</li>
<li>Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers+in+animal+development+anfd+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution.</a> Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).</li>
<li>Nord, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+pervasive+changes+in+genome-wide+enhancer+usage+during+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development.</a> Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).</li>
<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li>
<li>De Santa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+fraction+of+extragenic+RNA+pol+II+transcription+sites+overlap+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).</li>
<li>Kim, T. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).</li>
<li>Songyue, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+enhancer%2C+especially+super-enhancer-driven+genes+in+tumor+metabolism+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity.</a> Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+IFITM1+expression+in+lipopolysaccharide-stimulated+human+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).</li>
<li>Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+as+non-coding+RNA+transcription+units%3A+Recent+insights+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives.</a> Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).</li>
<li>Sartorelli, V., Lauberth, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+are+an+important+regulatory+layer+of+the+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome.</a> Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).</li>
<li>Lam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-Erbs+repress+macrophage+gene+expression+by+inhibiting+enhancer-directed+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription.</a> Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+enhancer+RNAs+for+oestrogen-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation.</a> Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).</li>
<li>Melo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eRNAs+are+required+for+p53-dependent+enhancer+activity+and+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription.</a> Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).</li>
<li>Mousavi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eRNAs+promote+transcription+by+establishing+chromatin+accessibility+at+defined+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci.</a> Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).</li>
<li>Schaukowitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNA+facilitates+NELF+release+from+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes.</a> Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).</li>
<li>Göttgens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+transcriptional+programme+for+blood%3A+The+SCL+stem+cell+enhancer+is+regulated+by+a+multiprotein+complex+containing+Ets+and+GATA+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors.</a> The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).</li>
<li>Wang, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+essential+enhancers+for+pluripotent+stem+cells+using+a+features-oriented+CRISPR-Cas9+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen.</a> Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).</li>
<li>Cinghu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragenic+enhancers+attenuate+host+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intragenic enhancers attenuate host gene expression.</a> Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).</li>
<li>Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+collision+interrupts+convergent+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription.</a> Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).</li>
<li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-specific+intragenic+enhancer+RNA+essential+for+NSUN2-mediated+stem+cell+fate+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation.</a> Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).</li>
<li>Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+epigenetic+regulatory+region+within+the+pluripotency+associated+microRNA+cluster%2C+EEmiRC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC.</a> Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).</li>
<li>Sohni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+switching+of+active+promoter+and+enhancer+domains+regulates+Tet1+and+Tet2+expression+during+cell+state+transitions+between+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Bressin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+nascent+transcript+sequencing+reveals+BRD4-specific+control+of+widespread+enhancer+and+target+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription.</a> Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Pérez-Molina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intronic+Alu+element+attenuates+the+transcription+of+a+long+non-coding+RNA+in+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines.</a> Front Genet. 11, 928(2020).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+of+epigenetic+marks+during+stem+cell+differentiation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development.</a> Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144 (6), 940-954 (2011).</li>
<li>Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+assay+using+transcription+inhibition+by+actinomycin+D+in+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells.</a> Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).</li>
<li>Kim, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+BET+family+proteins+underlies+altered+transcription+associated+with+memory+impairment+in+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome.</a> Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).</li>
<li>Peterson, S. M., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Isolation+from+Embryonic+Zebrafish+and+cDNA+Synthesis+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (30), e1470(2009).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).</li>
<li>Kim, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SET7%2F9+methylation+of+the+pluripotency+factor+LIN28A+is+a+nucleolar+localization+mechanism+that+blocks+let-7+biogenesis+in+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).</li>
<li>Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRUID%3A+A+pipeline+for+transcriptome-wide+measurements+of+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability.</a> RNA. 24 (5), 623-632 (2018).</li>
<li>Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+mRNA+half-lives+on+a+transcriptome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale.</a> Methods. 137, 90-98 (2018).</li>
<li>Tsai, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+muscle-specific+enhancer+rna+mediates+cohesin+recruitment+and+regulates+transcription+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans.</a> Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).</li>
<li>Woolley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA+sequencing+resolves+novel+variation+in+5%27+UTR+length+for+genes+expressed+during+human+CD4+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation.</a> Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithm+for+optimized+mRNA+design+improves+stability+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity.</a> Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).</li>
<li>Kim, T. -K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+functional+commonalities+between+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Protokół ten określa wiarygodną i powtarzalną metodę pomiaru stabilności eRNA w mESC. Kluczowe kroki eksperymentalne, w tym hodowla komórek, leczenie aktinomycyną D, ekstrakcja RNA oraz ilościowa identyfikacja RT-qPCR, są wyraźnie przedstawione na rysunkach i plikach uzupełniających, aby prowadzić użytkowników przez proces pracy. Ponadto szczegółowe procedury analityczne, takie jak modelowanie regresji nieliniowej oraz interpretacja przedziałów ufności, zostały przedstawione w Pliku Uzupełniającym 4 , ws...

Wzmacniacze to elementy cis-regulacyjne (CRE), które regulują ekspresję genów specyficzną dla tkanek i bodźców, pełniąc rolę platform wiążących dla czynników transkrypcyjnych oraz współregulatorów 1,2,3,4,5,6. Chociaż wzmacniacze mogą być zlokalizowane daleko od swoich docelowych genów na poziomie genomu liniowego, mechanizmy pętli chromatyny umożliwiają przestrzenną bliskość do promotorów, ułatwiając regulację transkrypcyjną. Aktywne wzmacniacze są dwukierunkowo transkrybowane przez polimerazę RNA II (Pol II), tworząc długie, niekodujące RNA zwane RNA wzmacniającymi (eRNA), które zazwyczaj mają medianę długości około 1 kb 1,2,7,8,9. Ekspresja eRNA jest silnie skorelowana z aktywacją pobliskich genów docelowych 10,11,12, a badania funkcjonalne konsekwentnie wykazują, że wyczerpanie eRNA zmniejsza transkrypcję ich genów docelowych, co sugeruje, że eRNA działają jako regulatory funkcjonalne, a nie produkty uboczne transkrypcji 13,14,15,16,17 . Pomimo ich funkcjonalnego znaczenia, protokoły eksperymentalne umożliwiające niezawodne wykrywanie i ilościowe określenie eRNA pozostają ograniczone.
W komórkach macierzystych aktywność wzmacniacza odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu pluripotencji i napędzaniu przejść rozwojowych18,19. Wzmacniacze mogą znajdować się w regionach międzygenowych (wzmacniacze intergenowe lub ekstragenowe) lub być osadzone w ciałach genów jako wzmacniacze wewnątrzgenowe8. Chociaż wzmacniacze intergenowe były szeroko badane w różnych typach komórek, intrageniczne wzmacniacze pozostają stosunkowo słabo zbadane ze względu na wyzwania techniczne, takie jak nakładanie się transkrypcji z pre-mRNA genu gospodarza oraz obecność modyfikacji histonów związanych z wydłużeniem transkrypcji20,21. Niemniej jednak najnowsze badania wykazały, że zarówno wzmacniacze międzygenowe, jak i intragenowe przyczyniają się do sieci regulacyjnych genów zaangażowanych w pluripotencję22,23 oraz wczesną różnicację24 w ESC. Co istotne, prawie połowa wszystkich anotowanych wzmacniaczy jest intragenowych20,25, a ich aktywność różni się w zależności od etapów rozwojowych, często wzrastając w zróżnicowanych tkankach 8,26,27,28. Jednak częstość występowania i funkcjonalne role wzmacniaczy wewnątrzgenowych w ESC pozostają niedo do końca poznane. W szczególności, podczas gdy intergenowe eRNA są transkrybowane między genami, intragenowe eRNA są transkrybowane w obrębie ciał genów i mogą nakładać się na transkrypcje pre-mRNA. Ta różnica pozycyjna wymaga odrębnych podejść analitycznych przy interpretacji i ilościowości intergenowych i intragenowych eRNA.
W przeciwieństwie do mRNA, eRNA zazwyczaj nie mają 3′ poli(A) ogona, co skutkuje niską stabilnością i szybką degradacją 1,2,7,8,9. Ta niestabilność wewnętrzna utrudnia analizę ekspresji eRNA, zwłaszcza w eksperymentach z przebiegiem czasu. W neuronach wykazywano okres półtrwania eRNA zaledwie 7,5 min17. Jednak nadal nie jest jasne, czy ta niestabilność jest spójna w różnych typach komórek, szczególnie w ESC, gdzie zarówno aktywność wzmacniacza, jak i transkrypcja eRNA są wysoce specyficzne dla typu komórki 7,17,29,30. ESC opierają się na dynamicznych programach regulacji genów, aby utrzymać pluripotencję lub inicjować różnicowanie, co czyni je unikalnym systemem do badania rotacji eRNA31,32. Biorąc pod uwagę szybkie zmiany transkrypcyjne w ESC, zrozumienie rozpadu eRNA w tym kontekście może ujawnić, jak aktywność wzmacniacza jest regulowanaczasowo17. Ponadto różnice między intergenowymi a intragenicznymi eRNA, takie jak nakładanie się z transkrypcjami genów gospodarza, wymagają odrębnych podejśćanalitycznych 20. Pomimo znaczenia tych pytań, istnieje niewiele ustandaryzowanych metod pomiaru okresu półtrwania eRNA w ESC lub porównywania dynamiki rozpadu różnych typów eRNA.
Badanie przedstawia protokół ilościowy oceniający stabilność i okres półtrwania eRNA transkrybowanych z wzmacniaczy intergenowych i wewnątrzgenowych w mESC. Hamowanie transkrypcyjne osiąga się przy użyciu aktinomycyny D (ActD) w określonych odstępach czasowych, po czym następuje ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) oraz analiza regresji nieliniowej w celu ilościowego określenia rozpadu eRNA. Aby zniwelować różnice pozycyjne między wzmacniaczami intergenowymi a intragenowymi, metoda wykorzystuje odrębne strategie normalizacji, umożliwiając systematyczne i dokładne porównanie dynamiki degradacji eRNA. To uporządkowane ramy analityczne dostarczają cennych informacji na temat wymiany eRNA w komórkach macierzystych pluripotentnych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Aktinomycyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Chemikalia Daejung</td><td>2548-4105</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>GenDEPOT</td><td>D2680</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow' s Minimalne Niezbędne Medium (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (wersja 9)</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Chemikalia Daejung</td><td>5035-4105</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum KnockOut (KOSR)</td><td>Gibco,&nbsp;</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td><td>Merck</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów nieistotnych MEM (MnEA)</td><td>Welgene</td><td>LS005</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV zestaw do syntezy cDNA &nbsp;</td><td>Enzynomika</td><td>EZ006S</td><td></td></tr><tr><td>OPTIZEN NanoQ Plus&nbsp;</td><td>KLAB</td><td>01-QI685-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR-Green PCR master mix&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>QuanStudio1 System PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time)</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>A40425</td><td></td></tr><tr><td>Pirorotroczan sodu</td><td>Welgene</td><td>LS013</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności rna wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Optimized Quantitative Assessment of Enhancer RNA Stability in Mouse Embryonic Stem Cells

RNA wzmacniające (eRNA) to niekodujące transkrypty produkowane z obszarów wzmacniających aktywność transkrypcyjną i coraz częściej uznawane są za kluczowe regulatory ekspresji genów. Pomimo ich funkcjonalnego znaczenia, dynamika stabilności i degradacji eRNA pozostaje słabo scharakteryzowana, szczególnie w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC), gdzie programy transkrypcyjne są wysoce dynamiczne i zależne od kontekstu. Protokół ten przedstawia ilościową metodę oceny kinetyki rozpadu oraz okresu półtrwania intergenowych i wewnątrzgenowych eRNA w mysich ESC. Transkrypcja jest hamowana za pomocą aktinomycyny D, a całkowite RNA jest zbierane w wielu określonych punktach czasowych. cDNA jest syntetyzowane zarówno przy użyciu przypadkowych heksamerów, jak i oligo(dT) primerów, co umożliwia wykrywanie zarówno polyadenylowanych, jak i niepoliadenylowanych transkryptów. W przypadku intergenowych eRNA normalizacja przeprowadza się za pomocą genu housekeeping lub wartości Ct w czasie 0 min. W przypadku intragenowych eRNA stosuje się podwójne podejście normalizacyjne, aby zminimalizować interferencje wynikające z nakładających się pre-mRNA. Krzywe rozpadu analizuje się za pomocą jednofazowego modelu wykładniczego rozpadu, co umożliwia dokładne oszacowanie okresu półtrwania. Protokół ujawnia, że eRNA w mESC wykazują szybką rotację, z okresem półtrwania około 2-3 minut. Ta metodologia zapewnia solidne i powtarzalne ramy do badania stabilności eRNA, oferując wgląd w aktywność wzmacniacza i dynamikę RNA w kontekstach pluripotentnych komórek macierzystych.

Aby ocenić stabilność RNA po zatrzymaniu transkrypcji, mESC poddano actD, a całkowite RNA zebrano w określonych momentach (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min). Po syntezie cDNA wykonano RT-qPCR w celu ilościowego określenia intragenowego eRNA Nsun2 i Sox2, intergenowego eRNA Pou5f1 oraz odpowiadających im mRNA. Dane te zostały wykorzystane do generowania krzywych degradacji zależnych od czasu (Rysunek 2). W udanych ekspery...

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Enhancer RNAs (eRNAs) are non-coding transcripts produced from transcriptionally active enhancer regions and are increasingly recognized as key regulators ...

Nasze laboratorium bada epigenetykę, koncentrując się na modyfikacji RNA i wzmacniaczach na poziomie molekularnym. Niedawno odkryliśmy, że enzym m5C RNA Nsun2 jest regulowany przez wzmacniacz wewnątrzgenowy w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Na początek pokryj dołki płytki do hodowli komórek z sześcioma dołkami dwoma mililitrami żelatyny na dołek.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Aspiruj żelatynę z każdego dołka, a następnie przemyj każdy raz jednym mililitrem PBS. Sterylizuj płytki, poddając je światłu ultrafioletowemu przez co najmniej 15 minut.Nasiaj embrionalne komórki macierzyste myszy na płytkach pokrytych żelatyną, używając dwóch mililitrów kompletnego medium do hodowli komórek na dołek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z stężeniem 5% dwutlenku węgla. Następnie rozpuszcz aktinomycynę D w dimetylosulfoksydu, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu jednego miligrama na mililitr.Dwa dni po wysiewaniu komórek lub w dniu zbioru dodaj roztwór Actinomycyn D do podłoża hodowlanego. Pobieranie próbek w godzinach 0, 5, 10, 15, 20 i 30 minut po leczeniu Po zatrzymaniu transkrypcji ekspresja RNA wzmacniających gwałtownie spadała w ciągu pięciu minut, podczas gdy RNA przekaźnikowe spadała stopniowo i pozostawała stosunkowo stabilna przez 30 minut. Analiza okresu półtrwania wykazała, że RNA wzmacniające miały okres półtrwania około dwóch do trzech minut, podczas gdy RNA posłańca miały znacznie dłuższy okres półtrwania, przekraczający 60 minut.Dla RNA wzmacniającego intergeny Pou5f1 normalizacja do TBP przekaźnika lub do wartości progowej cyklu w ciągu zero minut dała podobne szacunki okresu półtrwania. Dane z sekwencjonowania RNA wykazały podwyższone wartości RPKM w regionie wzmacniającym Nsun2 w porównaniu z kontrolą ujemną. Analiza RT-qPCR potwierdziła wyższą znormalizowaną ekspresję Nsun2, dwóch intergenowych RNA wzmacniających Nsun2, w regionie wzmacniającym Nsun2 w porównaniu z kontrolą negatywną.Metoda normalizacji stosowana dla wzmacniaczy intergenowych jest odpowiednia, ponieważ wzorzec ekspresji względem kontroli ujemnej jest zgodny z wzorcem obserwowanym przy użyciu RPKM. Nasze badanie dostarcza metody pomiaru i normalizacji krótkiej półlinii szybko degradujących się wzmacniaczy. Zajmujemy się brakiem jasnej metody porównywania aktywności wzmacniacza międzygenowego i wewnątrzgenowego.Upraszcza przetwarzanie danych i umożliwia szybkie obliczanie rozpadu mESC przy użyciu jasnych, precyzyjnych kroków.

optimized-quantitative-assessment-enhancer-rna-stability-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj zoptymalizowaną metodę ilościowej oceny stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Protokół wykorzystuje Actinomycin D, RT-qPCR i analizę regresji nieliniowej do modelowania dynamiki degradacji eRNA.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów