Name: Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę epigenetycznej edycji komórek K562 z wykorzystaniem dwuwektorowego systemu episomalnego CRISPR/dCas9. Technika ta umożliwia stabilną, celowaną metylację DNA z minimalnymi efektami poza docelowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Irene Dereki i Vasiliki Chondrou są wspierane przez trzyletnie stypendium (Grant nr 80706) ze Specjalnego Konta Funduszy Badawczych (ELKE) Hellenic Open University.

<ol><li>Firdaus, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+explorations+of+neurological+disorders%2C+the+identification+methods%2C+and+therapeutic+avenues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues.</a> Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+laboratory+studies+and+clinical+trials+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine.</a> Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).</li>
<li>Wang, S. E., Jiang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+epigenetic+molecular+therapies+for+imprinting+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders.</a> Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Ptak, C., Petronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+complex+disease%3A+from+etiology+to+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).</li>
<li>Stepper, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+DNA+methylation+with+chimeric+dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).</li>
<li>Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functional+role+of+DNA+demethylation+at+specific+promoters+by+targeted+steric+blockage+of+DNA+methyltransferase+with+CRISPR%2FdCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9.</a> Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).</li>
<li>Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+histone+deacetylation+using+a+synthetic+CRISPR-Cas9-based+HDAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC.</a> Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).</li>
<li>Vojta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+the+CRISPR-Cas9+system+for+targeted+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation.</a> Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).</li>
<li>Giehrl-Schwab, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+motor+symptoms+rescue+by+CRISPRa-reprogramming+astrocytes+into+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons.</a> EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).</li>
<li>Moreno, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+gene+therapy+via+AAV-CRISPR-Cas9-mediated+targeted+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation.</a> Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).</li>
<li>Sokka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+enables+high-fidelity+reprogramming+into+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).</li>
<li>Galonska, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+tracking+of+dCas9-methyltransferase+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints.</a> Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+on-target+and+off-target+characteristics+for+RNA-guided+DNA+methylation+by+dCas9+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases.</a> GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).</li>
<li>Kennedy, M. E., Cullen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+CRISPR%2FCas+DNA+endonucleases%3A+a+revolutionary+technology+that+could+dramatically+impact+viral+research+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment.</a> Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).</li>
<li>Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+challenges+for+use+of+lentiviral+vectors+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).</li>
<li>Cappelluti, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+and+efficient+gene+silencing+in+vivo+by+hit-and-run+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing.</a> Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).</li>
<li>Hanzawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+DNA+demethylation+of+the+Fgf21+promoter+by+CRISPR%2FdCas9-mediated+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing.</a> Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+heritable+gene+silencing+for+KRAB-dCas9+%2B+DNMT3+and+Ezh2-dCas9+%2B+DNMT3+hit-and-run+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing.</a> Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).</li>
<li>Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+HBB+transgene+expression+from+S%2FMAR+element-based+replicating+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors.</a> J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).</li>
<li>Lazaris, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+episomal+vector+mediates+efficient+gene+transfer+of+the+%CE%B2-globin+gene+into+K562+and+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells.</a> Genes. 14 (9), 1774(2023).</li>
<li>Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+development+and+the+applications+of+nonviral%2C+episomal+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).</li>
<li>Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector+based+on+the+SV40+origin+of+replication+and+chromosomal+S%2FMARs+replicates+episomally+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells.</a> Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).</li>
<li>Nuñez, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+programmable+transcriptional+memory+by+CRISPR-based+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing.</a> Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead+Cas+systems%3A+types%2C+principles%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dead Cas systems: types, principles, and applications.</a> Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).</li>
<li>Holmes, D. S., Quigley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+boiling+method+for+the+preparation+of+bacterial+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids.</a> Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).</li>
<li>Harwood, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+boiling+method+for+small-scale+preparation+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA.</a> Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Labuhn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li>
<li>Hofacker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+effector+domains+for+targeted+DNA+methylation+with+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects.</a> Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiCas-DL%3A+predicting+sgRNA+activity+for+CRISPR-mediated+epigenome+editing+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).</li>
<li>Mu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+methods+for+predicting+guide+RNA+effects+in+CRISPR+epigenome+editing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Batra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+effect+of+CRISPR-Cas9-based+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+vectors+based+on+S%2FMAR+and+the+%CE%B2-globin+replicator%2C+encoding+a+synthetic+transcriptional+activator%2C+mediate+efficient+%CE%B3-globin+activation+in+haematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).</li>
<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-globin+replicator+greatly+enhances+the+potential+of+S%2FMAR+based+episomal+vectors+for+gene+transfer+into+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).</li>
<li>Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-acting+sequences+improve+expression+and+establishment+of+a+nonviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).</li>
<li>Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+mitotic+stability+of+an+extra-chromosomal+mammalian+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon.</a> BMC Cell Biol. 8, 33(2007).</li>
<li>Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S%2FMAR-based+infectious+episomal+genomic+DNA+expression+vector+provides+long-term+regulated+functional+complementation+of+LDLR+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency.</a> Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Ewaisha, R., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+CRISPR+therapeutics-critical+considerations+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).</li>
<li>Raghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+minimally+immunogenic+nucleases+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy.</a> Nat Commun. 16 (1), 105(2025).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurujących interesów finansowych ani niefinansowych.

Jednym z najważniejszych etapów tego protokołu jest projektowanie wysoce specyficznych sgRNA. Efekty poza celem są znanym ograniczeniem systemów edycji epigenetycznych opartych na CRISPR, które często wynikają z niewierności wiązania dCas9 oraz niespecyficznej aktywności domen efektorowych. Aby to zminimalizować, sgRNA muszą być projektowane z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych, które optymalizują wysoką aktywność na celu i minimalne wiązanie poza celem30. Zaleca się stosowanie narzędzi pr...

Regulacja epigenetyczna, w tym metylacja DNA i modyfikacje histonów, odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu ekspresji genów, różnicowania komórek oraz stabilności genomu. Dysregulacja tych mechanizmów często jest zaangażowana – zarówno jako przyczyna, jak i konsekwencja – w różnych stanach patologicznych, szczególnie w nowotworach, zaburzeniach neurologicznych oraz zespołach imprintingu 1,2,3. Co istotne, poprzez precyzyjną interwencję w krajobraz epigenetyczny na określonych loci genomowych za pomocą technologii edycji epigenomu Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), można osiągnąć poziomy represji genów porównywalne z tymi obserwowanymi w modelach knock-out genów, bez zmiany podstawowej sekwencji DNA4. W rezultacie ukierunkowana edycja epigenetyczna stała się obiecującą strategią rozcinania mechanizmów regulacji genów i rozwoju precyzyjnych terapii.
Inhibitory metylotransferazy DNA (DNMT) oraz inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC) to terapie epigenetyczne obecnie zatwierdzone do zastosowań klinicznych. Jednak te środki nieselektywnie celują w markery epigenetyczne w genomie, zmieniając globalne stany chromatyny, powodując efekty pozacelowe i toksyczność u pacjentów5. Aby złagodzić ograniczenia tradycyjnych środków zmiany epigenetycznej, opracowano programowalne edytory epigenetyczne oparte na katalistycznie martwym Cas9 (dCas9) fuzjonowanym z domenami efektorowymi, takimi jak metylotransferazy DNA (np. DNMT3A), demetylazy (np. TET1), acetylotransferazy histonowe (np. p300) czy deacetylazy (np. HDAC3) 6,7,8,9 . System efektorów dCas9 pozwala na modyfikację epigenomu specyficzną dla locus prowadzoną przez małą cząsteczkę RNA, znaną jako jedno-przewodnikowe RNA (sgRNA), bez wprowadzania podwójnych pęknięć w sekwencji docelowej. Najnowsze badania wykazały ich zastosowanie w modyfikowaniu ekspresji genów, przebudowywaniu dostępności chromatyny, a nawet przeprogramowaniu: fenotypów komórkowych 10,11,12.
Pomimo szybkich postępów, systemy inżynierii epigenomu oparte na dCas9 nadal napotykają pewne ograniczenia. Najczęstszym wyzwaniem są efekty pozacelowe ze względu na niespecyficzność epigenetycznych domen efektorowych, zwłaszcza przy silnej lub długotrwałej ekspresji narzędzi fuzji dCas913,14. Dodatkowo, duże rozmiary fuzji dCas9 stwarzają poważne wyzwania w dostarczaniu danych. Rozmiar sekwencji Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) wynosi około 4,2 kb15, co jest porównywalne z maksymalną pojemnością wektorów wirusów adenogenozowych (AAV). Chociaż wektory lentiwirusowe mają stosunkowo dużą pojemność (~12-1 kb), umożliwiając dostarczanie pełnowymiarowego SpCas9 połączonego z epigenetycznymi efektorami, nadal zachowują możliwość losowej integracji genomowej, co ryzykuje mutagenezę insercyjną i ogranicza ich zastosowania kliniczne16. Z drugiej strony, podejścia niewirusowe, takie jak transfekcja plazmidów, cierpią na słabą retencję w komórkach dzielących się. Metody dostarczania przejściowe lub "hit-and-run" wykluczają możliwość integracji genomowej, ale często nie utrzymują zmian metylacji między podziałami komórkowymi, chyba że są połączone z remodelerami chromatyny lub efektorami kooperacyjnymi 17,18,19.
Aby sprostać tym wyzwaniom, zastosowaliśmy niecałkowity, samoreplikujący się system wektorów episomalnych (pEPI-S/MAR) do dostarczania efektorów epigenetycznych fuzowanych z dCas9. Wektor ten utrzymuje się poza chromosomem w komórkach dzielących się przy niskiej liczbie kopii (~1-2 na komórkę), umożliwiając utrzymującą, ale umiarkowaną ekspresję, aby zminimalizować niepożądane funkcje związane z nadekspresją20,21. Element Obszaru Przyłączenia Szatby/Matrixu (S/MAR) episomu oddziałuje z matrycą jądrową, przyczyniając się do stabilnego utrzymania episomu w jądrze komórek podczas podziału komórki 22,23. Ponadto system wektorów pEPI eliminuje ryzyko związane z integracją wirusów i umożliwia dostarczanie konstrukcji bez przekraczania limitów opakowań.
Najnowsze badania wykazały, że obszary promotorowe oznaczone aktywnymi modyfikacjami histonowymi, szczególnie acetylacją H3K27 (H3K27ac), często są odporne na metylację DNA z inżynierią. Metody kombinatoryczne, które usuwają lub dodają znaki histonowe za pomocą pisarzy lub gumek modyfikacji histonowych, a jednocześnie wprowadzają metylację DNA za pomocą DNMT3A, wykazują zwiększenie stabilności i trwałości represji genów, nawet w podejściach przejściowych19,24. Na podstawie tych wniosków wysunęliśmy hipotezę, że współdostarczanie dCas9-HDAC1 i dCas9-DNMT3A oraz celowanie w sąsiednie obszary genetyczne sprzyja przebudowie chromatyny oraz umożliwia bardziej efektywną i trwałą metylację w docelowych elementach regulacyjnych.
W tym badaniu naszym celem było zaprojektowanie i zbudowanie systemu zdolnego do dostarczania ukierunkowanej i stabilnej metylacji DNA na wyspie CpG 326 ZBTB7A, regionie charakteryzującym się niską endogenną metylacją i nieprawidłowymi znakami H3K27ac w komórkach K562. Celem tego badania było dostarczenie dwóch episomalnych konstrukcji kodujących dCas9, połączonych z każdym z różnych epigenetycznych efektorów, wraz z sgRNA, celujących w region regulacyjny bogaty w CpG położony powyżej genu ZBTB7A , wykorzystując niskoekspresyjny, stabilny, niecałkowany system pEPI. Jak pokazano na Rysunku 1, współtransfekcja komórek K562 z tymi episomami umożliwia podwójną rekrutację kompleksów edycyjnych na interesującą wyspę CpG, gdzie HDAC1 usuwa lokalną acetylację histonów, aby umożliwić późniejszą metylację DNA przez DNMT3A, co skutkuje skoordynowaną i specyficzną dla miejsca modyfikacją epigenetyczną.
System opisany tutaj jest odpowiedni do zastosowań, gdzie dostarczanie wirusa nie jest możliwe ze względu na rozmiar konstrukcji, obawy o bezpieczeństwo lub ograniczenia kosztowe. Obsługuje modułowe klonowanie różnych sgRNA i fuzji efektorów, co pozwala dostosować go do różnych miejsc docelowych. Obecnie najlepiej nadaje się do badań in vitro lub przedklinicznych linii komórkowych tolerujących transfekcję plazmidów i selekcję antybiotyków. W naszej implementacji dostarczanie episomów w komórkach K562 było osiągane przy użyciu odczynników opartych na lipofektaminie i utrzymywane w selekcji G-418.

<table><tbody><tr><td>Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>A52490</td><td></td></tr><tr><td>Wiek I-HF&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>NEB</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>ASEI</td><td>NEB</td><td>R0526</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek melodyjnych BD FACS</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bglll</td><td>NEB</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>BspEI</td><td>NEB</td><td>R0540</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka roztworu deoksynukleotydu (dNTP) (po 10 mM każda)</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka glukoza ze stabilną glutaminą, z medium pirorosrowęglanu sodu</td><td>Biowest</td><td>L0103</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, duży fragment (Klenowa)</td><td>NEB</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>DNMT3A (CD), sekwencje HDAC1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq polimeraza DNA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0712</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td>Zestaw do konwersji bisulfitowej &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw Bisulfite Epitect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Selektywny antybiotyk genetycyny (siarczan G418)</td><td>Gibco</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw transfekcyjny lipofektaminy 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alfa Competent&nbsp;E. coli&nbsp; (Wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alfa F'Iq&nbsp; Kompetentne&nbsp;E. coli&nbsp; (Wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C2992H</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka nukleospinowa&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x roztwór, pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>wektor pGuide</td><td>OriGene Technologies</td><td>GE100042</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1 Nasycony 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primery, sgRNA&nbsp;</td><td>Eurofiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Assay Design&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>Wersja 2.0</td><td>Narzędzie do projektowania podkładów bisulfitowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynniki PyroMark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw PCR PyroMark&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 MDx</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Stanowisko robocze do pyrosequencingu&nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Software&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>v2.0.8</td><td>Oprogramowanie do pirosesekwencjonowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Q5&reg; Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw płyt QuantStudio Absolute Q MAP16</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>A52865</td><td>System cyfrowy PCR &nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, 10 000x koncentrat w DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Polinukleotydowa kinaza T4</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria epigenetyczna komórek k562: dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji dna z wykorzystaniem białek fuzji dcas9-dnmt3a i -hdac1

Epigenetic Engineering of K562 Cells: Dual-Vector Episomal Strategy for Stable Targeted DNA Methylation using dCas9-DNMT3A and -HDAC1 Fusion Proteins

Badanie dokładnej roli metylacji DNA w regulacji transkrypcji genów oraz opracowywanie terapii ukierunkowanych na konkretne wzorce metylacji genów stwarzają poważne wyzwania ze względu na niedobór wszechstronnych narzędzi zdolnych do indukowania specyficznych miejscowo i długoterminowych modyfikacji epigenetycznych w celu modulacji ekspresji genów. Celem badania było opracowanie i zweryfikowanie innowacyjnego systemu episomalnego ułatwiającego stabilną metylację DNA w docelowym locus genu, potencjalnie przydatnego zarówno do podstawowych badań epigenetycznych, jak i zastosowań terapeutycznych. Aby to osiągnąć, linia komórkowa K562 została współtransfekowana dwoma odrębnymi wektorami episomalnymi. Oba typy wektorów zostały zaprojektowane tak, aby wyrażać RNA prowadzące (gRNA) celujące w obszar niemetylowany o długości 367 bp w obrębie wyspy CpG 326, położonej powyżej genu ZBTB7A . Każdy wektor kodował dezaktywowaną formę endonukleazy Cas9 (martwą lub dCas9), związaną z domeną katalityczną metylotransferazy DNA DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) lub pełną długością histonową deacetylazą HDAC1 (dCas-HDAC1). Sekwencja dCas zawierała dwa sygnały lokalizacyjne jądra (NLS), aby zapewnić import jądra białka. Ta kaseta ekspresyjna z podwójnym układem promuje stan chromatyny potencjalnie sprzyjający długotrwałemu wyciszaniu epigenetycznemu, obiecując solidne i trwałe efekty epigenetyczne. To pośrednie podejście do epigenomu gospodarza, poprzez wykorzystanie samoreplikujących się wektorów episomalnych, oferuje kilka zalet: utrzymanie i ekspresję wektorów przy niskiej liczbie kopii podczas wielu podziałów komórkowych bez integracji z genomem gospodarza, co minimalizuje efekty poza celem i zachowuje integralność genomu. Raportujemy precyzyjny i istotny wzrost metylacji DNA na docelowej wyspie ZBTB7A CpG 326. Wyniki potwierdzają, że inżynierowane systemy episomalne CRISPR/dCas mogą wywoływać trwałą, specyficzną dla miejsca metylację DNA. Dlatego ten system jest cennym narzędziem badawczym do oceny funkcjonalnych efektów ukierunkowanych zmian metylacji oraz obiecującą platformą do opracowywania przyszłych terapii epigenetycznych.

Aby zbadać, czy nasze ukierunkowane narzędzia do edycji epigenetycznej mogą indukować zmiany metylacji DNA specyficzne dla konkretnego miejsca na wyspie ZBTB7A CpG 326, najpierw wygenerowaliśmy wektory episomalne kodujące dCas9 zfuzowane z DNMT3A(CD) lub HDAC1, wraz z różnymi sgRNA zaprojektowanymi z miejscami docelowymi na wyspie CpG 326. Początkowo współtransfekowaliśmy komórki K562 za pomocą kombinacji tych plazmidów, aby ocenić, czy jednoczesne dostarczanie modułów sgRNA i efektorów może prowadzić do powtarz...

Protokół ten opisuje nieintegracyjny, episomalny system oparty na CRISPR/dCas9 do celowanej edycji epigenetycznej w komórkach K562, łączący efektory dCas9-DNMT3A i dCas9-HDAC1 ze specyficznymi sgRNA, aby precyzyjnie indukować metylację DNA specyficzną dla locus, z ograniczoną efektem pozacelową.

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

Investigating the precise role of DNA methylation in gene transcriptional regulation and developing therapies targeting specific gene methylation patterns ...

Nasze badania mają na celu opracowanie stabilnego, niezintegrowanego systemu celowanej metylacji DNA, badając trwałą edycję epigenetyczną w komórkach K562. Najnowsze osiągnięcia w tej dziedzinie obejmują systemy CRISPR-dCas9 z podwójnym efektorem, łączące enzymy epigenetyczne do synergicznej, stabilnej i lokalnie specyficznej modyfikacji epigenetycznej. Na początek utrzymuj komórki K562 w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy stężeniu 5% dwutlenku węgla i nawilżeniu.Ilościowo określić episomalne DNA przeznaczone do transfekcji za pomocą spektrofotometru na 260 nanometrów. Użyj ośmiu mikrogramów całkowitego DNA plazmidowego na transfekcję, przygotowując cztery mikrogramy każdego plazmidu do współtransfekcji, a wymaganą ilość mieszaj z 90 mikrolitrami ultraczystej wody. Teraz dodaj 10 mikrolitrów roztworu 3 molowego octana sodu oraz 2,5 objętości 100% etanolu do rozcieńczonego roztworu DNA.Dokładnie wymieszaj roztwór DNA i inkubuj go przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić wytrącenie DNA. Następnego dnia wiruj rurkę do wydzielania DNA o mocy 11 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W warunkach sterylnych w szafce biosafety ostrożnie usuń supernatant z rurki.Dodaj do rurki 500 mikrolitrów etanolu 70%, aby przemyć granulat, i ponownie wiruj w 11 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie całkowicie usuń supernatant etanolu z rurki i pozwól granulatowi DNA wyschnąć na powietrzu, aż etanol nie pozostanie widoczny. Następnie dokładnie ponownie zawiesić wysuszony pellet DNA w 50 mikrolitrach DMEM.Przechowuj 400 nanogramów ponownie zawieszonego DNA w nowej probówce w ilości około 2,5 mikrolitra i przechowuj roztwór plazmidowego DMEM w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Przeprowadz pozostałą próbkę DNA na żelu o stężeniu 1% agarozy, aby zweryfikować oczyszczenie i integralność DNA. Pobieraj komórki K562 z kolby T75, gdy hodowle osiągają 50 do 60% konfluencji, aby zapewnić optymalną efektywność transfekcji.Policz pobrane komórki za pomocą hemocytometru i przenieś objętość zawierającą dwa razy 10 do mocy pięciu komórek do 35-milimetrowej misy hodowlowej zawierającej 900 mikrolitrów DMEM bez FBS lub antybiotyków. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla, aby komórki były gotowe do transfekcji. Użyj zestawu transfekcyjnego na bazie lipofektaminy, aby dostarczać plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta i w razie potrzeby dostosowywać objętości.Dodaj trzy mikrolitry odczynnika P3000 do wcześniej przygotowanego roztworu plazmidowego DMEM. Delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Teraz dodaj pięć mikrolitrów odczynnika Lipofectamina 3000 wraz z wystarczającą ilością DMEM, aby osiągnąć końcową objętość 100 mikrolitrów.Inkubuj tę mieszankę transfekcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj pełne 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej do 35-milimetrowej misy hodowlającej z komórkami. Delikatnie potrząśnij miską, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę, a następnie włóż ją z powrotem do inkubatora.Po 24 godzinach po transfekcji do każdej miski należy dodać trzy mililitry pełnowymiarowego DMEM z 10% FBS i 1 razy streptomycynę penicyliny, aby wspierać proliferację transfekowanych komórek. Po 72 godzinach po transfekcji rozpocznij selekcję, dodając antybiotyk G418, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego miligrama na mililitr. Gdy proces selekcji zostanie ustalony i całkowita liczba komórek przekroczy jeden razy 10 do potęgi sześciu, należy pobrać komórki przez wirowanie w 300 G przez sześć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Przemyj granulek raz sterylnym PBS, pH około 7,4, i ponownie wiruj w tych samych warunkach. Po ponownym zawieszeniu ostatniego pelletu komórkowego w jednorazowym PBS określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńcz zawiesina do jednego razu 10 do mocy sześciu ogniw na mililitr, zapewniając pełną zawieszkę ogniw, i przenieś komórki do rurki przepływowej.Następnie przygotuj sorter komórek aktywowany fluorescencją w trybie pojedynczym, używając płyty z 96-dołkami do hodowli tkankowej jako urządzenia do zbierania. Dostosuj ustawienia oprogramowania w zależności od używanego instrumentu. Bramuj populację pierwotną, wybierając komórki na podstawie rozpraszania w przód i bocznych, aby wyizolować oczekiwany rozmiar i ziarnistość.Wyklucz odłamki oraz bardzo ziarniste lub martwe komórki, a do blokowania singletów użyj powierzchni rozpraszania w porównaniu do wysokości lub powierzchni rozpraszania bocznego względem wysokości. Następnie wstępnie napełnij każdy dołek na 96-dołkowej płycie 100 mikrolitrami pełnego medium zawierającego jeden miligram na mililitr G418 i podgrzej płytę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wykonuj sortowanie komórek w trybie pojedynczej komórki, utrzymując szybkość sortowania poniżej 300 zdarzeń na sekundę, aby zwiększyć dokładność.Po sortowaniu obejrzyj każdą studnię pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność pojedynczej komórki na dołek, a następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Pozwól klonom pojedynczych komórek rozszerzać się indywidualnie w płycie 96-dołkowej. Gdy wzrost klonalny stanie się widoczny, należy dodać podłoże zawierające zredukowany G418 do odwiertów do końcowego stężenia 400 mikrogramów na mililitr, aby utrzymać presję selekcyjną.Kolejno przenosić dobrze rosnące klony na płytki 12-dołkowe, następnie do kolb T25, a na końcu do kolb T75 w razie potrzeby, aż każdy klon osiągnie około jeden razy 10 do mocy sześciu ogniw. Następnie zbieraj granulki dwukomórkowe w regularnych odstępach. Przechowuj jeden granulat w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ekstrakcji genomowego DNA.Ujednolic drugi pellet w 500 mikrolitrach odczynnika TRIzol i przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ekstrakcji RNA i komplementarnej syntezy DNA. Ekstrakt genomowego DNA z wybranych klonów za pomocą ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącenia etanolem. Całkowicie ponownie zawiesić wyekstrahowane DNA w wodzie wolnej od nukleazy lub buforze TE.Zmierz stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru, zanim przejdziesz do dalszych etapów. Na koniec należy wyodrębnić całkowite RNA z przechowywanych granulek komórkowych za pomocą odczynnika TRIzol, a następnie wytrącać izopropanol. Pojedyncze komórki zostały posortowane na płytki z 96 dołkami za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją, aby wyizolować osoby niosące oba konstrukty.Analiza PCR 10 rozszerzonych klonów potwierdziła, że tylko niektóre zachowały oba konstrukty, co wskazują pasma 230 par zasad i 205 par zasad. Pyrosekwencjonowanie wykazało, że pozytywny klon dwa wykazał zwiększoną metylację w wielu miejscach CPG w pobliżu docelowego obszaru gRNA1 w porównaniu do grupy kontrolnej bez transfekcji. Zajmujemy się brakiem niezintegrowanych systemów długoterminowego dostarczania, umożliwiając precyzyjną, stabilną edycję epigenetyczną bez zmiany genomu gospodarza.Nasze wyniki stanowią wiarygodne narzędzie do badania regulacji genów poprzez metylację docelową oraz wspierają rozwój możliwych precyzyjnych terapii epigenetycznych. Przyszłe badania będą dotyczyć poprawy dostarczania episomalnego, minimalizacji efektów docelowych, zwiększenia efektywności Cas9 oraz adaptacji systemu do modeli pierwotnych lub in vivo.

epigenetic-engineering-k562-cells-dual-vector-episomal-strategy-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj metodę epigenetycznej edycji komórek K562 z wykorzystaniem dwuwektorowego systemu episomalnego CRISPR/dCas9. Technika ta umożliwia stabilną, celowaną metylację DNA z minimalnymi efektami poza docelowymi.

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1 (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

Przeglądaj więcej filmów