Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

Nasze badania mają na celu opracowanie stabilnego, niezintegrowanego systemu celowanej metylacji DNA, badając trwałą edycję epigenetyczną w komórkach K562. Najnowsze osiągnięcia w tej dziedzinie obejmują systemy CRISPR-dCas9 z podwójnym efektorem, łączące enzymy epigenetyczne do synergicznej, stabilnej i lokalnie specyficznej modyfikacji epigenetycznej. Na początek utrzymuj komórki K562 w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy stężeniu 5% dwutlenku węgla i nawilżeniu.

Ilościowo określić episomalne DNA przeznaczone do transfekcji za pomocą spektrofotometru na 260 nanometrów. Użyj ośmiu mikrogramów całkowitego DNA plazmidowego na transfekcję, przygotowując cztery mikrogramy każdego plazmidu do współtransfekcji, a wymaganą ilość mieszaj z 90 mikrolitrami ultraczystej wody. Teraz dodaj 10 mikrolitrów roztworu 3 molowego octana sodu oraz 2,5 objętości 100% etanolu do rozcieńczonego roztworu DNA.

Dokładnie wymieszaj roztwór DNA i inkubuj go przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić wytrącenie DNA. Następnego dnia wiruj rurkę do wydzielania DNA o mocy 11 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W warunkach sterylnych w szafce biosafety ostrożnie usuń supernatant z rurki.

Dodaj do rurki 500 mikrolitrów etanolu 70%, aby przemyć granulat, i ponownie wiruj w 11 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie całkowicie usuń supernatant etanolu z rurki i pozwól granulatowi DNA wyschnąć na powietrzu, aż etanol nie pozostanie widoczny. Następnie dokładnie ponownie zawiesić wysuszony pellet DNA w 50 mikrolitrach DMEM.

Przechowuj 400 nanogramów ponownie zawieszonego DNA w nowej probówce w ilości około 2,5 mikrolitra i przechowuj roztwór plazmidowego DMEM w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Przeprowadz pozostałą próbkę DNA na żelu o stężeniu 1% agarozy, aby zweryfikować oczyszczenie i integralność DNA. Pobieraj komórki K562 z kolby T75, gdy hodowle osiągają 50 do 60% konfluencji, aby zapewnić optymalną efektywność transfekcji.

Policz pobrane komórki za pomocą hemocytometru i przenieś objętość zawierającą dwa razy 10 do mocy pięciu komórek do 35-milimetrowej misy hodowlowej zawierającej 900 mikrolitrów DMEM bez FBS lub antybiotyków. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla, aby komórki były gotowe do transfekcji. Użyj zestawu transfekcyjnego na bazie lipofektaminy, aby dostarczać plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta i w razie potrzeby dostosowywać objętości.

Dodaj trzy mikrolitry odczynnika P3000 do wcześniej przygotowanego roztworu plazmidowego DMEM. Delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Teraz dodaj pięć mikrolitrów odczynnika Lipofectamina 3000 wraz z wystarczającą ilością DMEM, aby osiągnąć końcową objętość 100 mikrolitrów.

Inkubuj tę mieszankę transfekcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj pełne 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej do 35-milimetrowej misy hodowlającej z komórkami. Delikatnie potrząśnij miską, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę, a następnie włóż ją z powrotem do inkubatora.

Po 24 godzinach po transfekcji do każdej miski należy dodać trzy mililitry pełnowymiarowego DMEM z 10% FBS i 1 razy streptomycynę penicyliny, aby wspierać proliferację transfekowanych komórek. Po 72 godzinach po transfekcji rozpocznij selekcję, dodając antybiotyk G418, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego miligrama na mililitr. Gdy proces selekcji zostanie ustalony i całkowita liczba komórek przekroczy jeden razy 10 do potęgi sześciu, należy pobrać komórki przez wirowanie w 300 G przez sześć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Przemyj granulek raz sterylnym PBS, pH około 7,4, i ponownie wiruj w tych samych warunkach. Po ponownym zawieszeniu ostatniego pelletu komórkowego w jednorazowym PBS określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńcz zawiesina do jednego razu 10 do mocy sześciu ogniw na mililitr, zapewniając pełną zawieszkę ogniw, i przenieś komórki do rurki przepływowej.

Następnie przygotuj sorter komórek aktywowany fluorescencją w trybie pojedynczym, używając płyty z 96-dołkami do hodowli tkankowej jako urządzenia do zbierania. Dostosuj ustawienia oprogramowania w zależności od używanego instrumentu. Bramuj populację pierwotną, wybierając komórki na podstawie rozpraszania w przód i bocznych, aby wyizolować oczekiwany rozmiar i ziarnistość.

Wyklucz odłamki oraz bardzo ziarniste lub martwe komórki, a do blokowania singletów użyj powierzchni rozpraszania w porównaniu do wysokości lub powierzchni rozpraszania bocznego względem wysokości. Następnie wstępnie napełnij każdy dołek na 96-dołkowej płycie 100 mikrolitrami pełnego medium zawierającego jeden miligram na mililitr G418 i podgrzej płytę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wykonuj sortowanie komórek w trybie pojedynczej komórki, utrzymując szybkość sortowania poniżej 300 zdarzeń na sekundę, aby zwiększyć dokładność.

Po sortowaniu obejrzyj każdą studnię pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność pojedynczej komórki na dołek, a następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Pozwól klonom pojedynczych komórek rozszerzać się indywidualnie w płycie 96-dołkowej. Gdy wzrost klonalny stanie się widoczny, należy dodać podłoże zawierające zredukowany G418 do odwiertów do końcowego stężenia 400 mikrogramów na mililitr, aby utrzymać presję selekcyjną.

Kolejno przenosić dobrze rosnące klony na płytki 12-dołkowe, następnie do kolb T25, a na końcu do kolb T75 w razie potrzeby, aż każdy klon osiągnie około jeden razy 10 do mocy sześciu ogniw. Następnie zbieraj granulki dwukomórkowe w regularnych odstępach. Przechowuj jeden granulat w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ekstrakcji genomowego DNA.

Ujednolic drugi pellet w 500 mikrolitrach odczynnika TRIzol i przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ekstrakcji RNA i komplementarnej syntezy DNA. Ekstrakt genomowego DNA z wybranych klonów za pomocą ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącenia etanolem. Całkowicie ponownie zawiesić wyekstrahowane DNA w wodzie wolnej od nukleazy lub buforze TE.

Zmierz stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru, zanim przejdziesz do dalszych etapów. Na koniec należy wyodrębnić całkowite RNA z przechowywanych granulek komórkowych za pomocą odczynnika TRIzol, a następnie wytrącać izopropanol. Pojedyncze komórki zostały posortowane na płytki z 96 dołkami za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją, aby wyizolować osoby niosące oba konstrukty.

Analiza PCR 10 rozszerzonych klonów potwierdziła, że tylko niektóre zachowały oba konstrukty, co wskazują pasma 230 par zasad i 205 par zasad. Pyrosekwencjonowanie wykazało, że pozytywny klon dwa wykazał zwiększoną metylację w wielu miejscach CPG w pobliżu docelowego obszaru gRNA1 w porównaniu do grupy kontrolnej bez transfekcji. Zajmujemy się brakiem niezintegrowanych systemów długoterminowego dostarczania, umożliwiając precyzyjną, stabilną edycję epigenetyczną bez zmiany genomu gospodarza.

Nasze wyniki stanowią wiarygodne narzędzie do badania regulacji genów poprzez metylację docelową oraz wspierają rozwój możliwych precyzyjnych terapii epigenetycznych. Przyszłe badania będą dotyczyć poprawy dostarczania episomalnego, minimalizacji efektów docelowych, zwiększenia efektywności Cas9 oraz adaptacji systemu do modeli pierwotnych lub in vivo.