Name: Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę ilościowej lokalizacji receptorów nikotynowych acetylocholiny w komórkach ssaków Neuro2a. Wykorzystuje się pH-czułe znaczniki fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną do badania ekspresji błonowej i wewnątrzkomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Jamesowi Janoso za jego doświadczenie w dziedzinie mikroskopii technicznej oraz Centrum Badań Transformacyjnych w Metabolizmie (National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody numer P20GM130443) za wsparcie Rdzenia Mikroskopii na Uniwersytecie Alaski w Fairbanks. Działania LW były częściowo wspierane przez fundusze z Higher Education Investment Fund, zapewnionego przez stan Alaska za pośrednictwem Uniwersytetu Alaski. Działania SMS były wspierane przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) od National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103395. Badania opisane w tej publikacji zostały wspierane przez National Institute of Mental Health National Institutes of Health (MMW według numeru nagrody R03MH135358) oraz National Institute of General Medical Sciences (MMW według numeru nagrody R16GM150455) National Institutes of Health.

UWAGA: Poniższa procedura opisuje metody, które zostały skutecznie zastosowane do przejściowego transfektu linii komórkowej N2a za pomocą podjednostek nAChR (Rysunek 1). Solidna ekspresja błony plazmatycznej osiąga się w ciągu 24 godzin, co jest uchwycone mikroskopią konfokalną z aktywnymi komórkami.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69371/69371fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie poszczególnych metod przedstawionych w protokole. Komórki są hodowane do momentu, gdy osiągają 70%-80% zbiegu w naczyniach obrazujących. Komórki są następnie traktowane odczynnikiem transfekcyjnym i kompleksem DNA. (Góra) Po 24 godzinach komórki można objąć fluorescencyjnym ligandem do oznaczania podjednostek wyrażonych na błonie plazmatycznej, a następnie obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. (Na dole) Alternatywnie, dla genów podjednostek nAChR, które zostały zmodyfikowane do oznaczania białkiem wrażliwym na pH 24 godziny po transfekcji, komórki można obrazować żywe za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby uchwycić całkowitą fluorescencję komórek. Bufor obrazowania o pH 7,4 jest następnie zamieniany na bufor chłodzący pH 5,5. To zatrzyma fluorescencję białek wrażliwych na pH przypisanych do podjednostek nAChR zlokalizowanych na błonie plazmatycznej komórki, pozwalając jedynie podjednostkom wewnętrznym pozostać fluorescencyjnym. Te same komórki są ponownie obrazowane. Analiza obrazów przeprowadza się za pomocą ImageJ w celu ilościowego określenia wyrazu wewnętrznych i zewnętrznych podjednostek. Procedury te można zmodyfikować, aby uwzględnić chaperon i białka pomocnicze. Stworzone w BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69371/69371fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
1. Transfekcja przejściowa N2a nAChR
UWAGA: Linia komórkowa N2a została wybrana, ponieważ wykazuje fenotyp neuronalny i niską endogenną ekspresję nAChR. Geny podjednostek α7-pHuji, α4-SEP i β2-pHuji są indywidualnie umieszczone w wektorze ekspresyjnym pcDNA3.1(+) ssaków. Białko chaperonu NACHO jest eksprimowane z pREP9 (hojnie podarowanego przez dr. R. Loringa z Northeastern University). We wszystkich etapach stosuj techniki sterylne i pracuj wewnątrz szafki bioasekuracyjnej. Noś czysty fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawiczki. Czyść wszystkie materiały wchodzące lub wychodzące z szafki biosafety za pomocą 70% etanolu. Następujące kroki opisują transfekcję w szklanym dnie o średnicy 35 mm pokrytej poli-D-lizyną, odpowiedniej do obrazowania. Objętości można dostosowywać w zależności od potrzeb dla różnych zbiorników hodowlanych.
<ol>
	<li>Hodować komórki N2a w kolbie T25 (lub podobnej) zawierającej minimalne niezbędne medium Eagle's Minimum Essential (EMEM), uzupełnione o 10% surowicę płodową bydła (FBS) oraz w razie potrzeby 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, aż komórki osiągną ~90% konfluencji. Wizualizuj to za pomocą obiektywu do mikroskopu świetlnego 4x.</li>
	<li>Codziennie monitoruj konfluencję za pomocą mikroskopu świetlnego i wymieniaj podłoże co 1-2 dni, aby utrzymać optymalne warunki. Gdy komórki osiągną ~90% konfluentności, są gotowe do przepuszczenia do talerzy obrazujących.</li>
	<li>Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 °C w kąpieli wodnej. Przed rozpoczęciem zabiegu wyczyść szafkę z zabezpieczeniem biologicznym oraz wszystkie materiały w 70% etanolu. UWAGA: 70% etanolu to wysoce łatwopalna ciecz i para, które mogą powodować poważne podrażnienia oczu. Trzymaj się z dala od ciepła, iskier, otwartych płomieni i innych źródeł zapłonu. Przechowuj je w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, z pojemnikami szczelnie zamkniętymi. Zakładaj rękawiczki ochronne oraz ochronę oczu/twarzy podczas obchodzenia. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami natychmiast przepłucz wodą i skonsultuj się z lekarzem, jeśli podrażnienie się utrzymuje. Zamiast tego można stosować alternatywny środek dezynfekujący, taki jak roztwór wybielacza 5%-10%.</li>
	<li>Aspiruj stare medium z kolby i myj komórki 5 mL PBS. Dodaj 1 ml trypsyny do kolby i delikatnie mieszaj. Inkubuj do podniesienia się komórek (<5 min). Aby zapobiec nadmiernemu trawieniu, natychmiast dodaj 4 mL podłoża wzrostu EMEM i delikatnie pipetuj w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru określ stężenie komórek i oblicz wymaganą objętość ośrodka wzrostu EMEM, aby dostosować zawiesinę tak, aby 1 mL zawierało 0,5-2 komórki o wymiarach 10⁵.</li>
	<li>Na talerz nałóż 1 mL zawiesiny ogniwowej na misku 35 mm i dodaj wystarczającą ilość podłoża wzrostu EMEM, aby całkowita objętość wyniosła 2 mL. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂. Komórki są gotowe do transfekcji przy 70%-80% konfluencji.</li>
	<li>W dniu transfekcji podgrzewanie odczynników do 37 °C, całkowite rozmrażenie DNA podjednostki nAChR i doprowadzenie odczynnika transfekcyjnego do temperatury pokojowej. Wszystkie odczynniki przed umieszczeniem w szafce biosafety wyczyść 70% etanolem.</li>
	<li>Aby wyrazić α7 nAChRs: W rurce mikrowirówki rozcieńcz 4 μg α7 (1 μg/μL) i 1 μg DNA plazmidów NACHO (1 μg/μL) kroplami do zredukowanego medium surowicy (bez antybiotyku) do końcowej objętości 250 μL. Po dodaniu DNA delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.<ol>
		<li>Aby wyrazić α4β2 nAChRs: Rozcieńcz 4 μg każdej podjednostki DNA w łącznie 250 μL zredukowanego surowicowego nośnika. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie. Dostosuj stosunek każdej podjednostki, aby zoptymalizować ekspresję konkretnych izoform receptorów.</li>
		<li>Aby wyrazić α4β2 nAChR dodatkowym plazmidem, należy dodać równe ilości każdego plazmidowego DNA. Niebieskie białko fluorescencyjne mTagBFP2³¹ w pcDNA3.1(+) pełni funkcję plazmidu kontrolnego i może być zastąpione dowolnym chaperonem α4β2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj odczynnik do transfekcji DNA przed użyciem. W osobnej rurce mikrowirówki rozcieńcz 8 μL odczynnika transfekcyjnego kroplą w 250 μL zredukowanego medium surowicowego. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź do kolejnego kroku w ciągu 25 minut.</li>
	<li>Po 5 minutach połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem transfekcyjnym (łącznie = 500 μL) krople. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Kompleksy DNA-lipidowe pozostają stabilne do 6 godzin.</li>
	<li>Podczas tworzenia się kompleksów należy wyjąć posiewki z inkubatora i zastąpić podłoże 1 mL EMEM bez surowicy (bez antybiotyków).</li>
	<li>Do każdej misy dodaj po kroplach 500 μL kompleksu odczynnikowego DNA-transfekcyjnego (końcowa objętość = 1,5 mL). Delikatnie mieszaj, kołysząc talerzem, aby zapewnić równomierne rozłożenie na talerzu, szczególnie na powierzchni szklanej powierzchni. Inkubuj w 37 °C przez 24 godziny, a następnie po 4-6 godzinach wymienia podłoże, aby wspierać zdrowie komórek.</li>
</ol>
2. Znakowanie komórek żywych α7 nAChR z ekspresją plazmatycznej przy użyciu αBTX Alexa Fluor 647
UWAGA: Następujący zabieg jest zazwyczaj wykonywany 24 godziny po transfekcji. Ochrona αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) przed światłem, aby zapobiec fotodestrukcji fluoroforu.
<ol>
	<li>Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 °C i rozmroz roztwór zapasowy αBTX-AF647 (2,3 μM). Czyść 70% etanolem i włóż do szafki zabezpieczeń biologicznych.</li>
	<li>Wyjmij z inkubatora naczynie zawierające komórki przekryte DNA α7 i NACHO, oczyść zewnętrzną część 70% etanolem i umieść ją w szafce zabezpieczeń biologicznych.</li>
	<li>Usuń stare medium przez ssanie próżniowe. Aby przemyć komórki, dodaj 2 mL świeżego medium wzrostu EMEM.</li>
	<li>Usuń medium do mycia przez ssanie próżniowe. Dodaj 2 mL medium wzrostu EMEM do naczyń.</li>
	<li>Zastąpić odpowiednią ilość medium αBTX-AF647, aby osiągnąć końcowe stężenie 80 nM. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rano podgrzej PBS lub preferowane medium obrazowe i oczyść 70% etanolu. Przenieś do szafki do zabezpieczenia biologicznego.</li>
	<li>Wyjmij transfekowane komórki z inkubatora, wyczyść i umieść je w szafce zabezpieczeń biologicznych.</li>
	<li>Usuń stare medium zawierające αBTX-AF647 i umieść je w odpowiednim pojemniku na odpady.</li>
	<li>Przemyj komórki 2 mL PBS przez 3x, po 10 minut w temperaturze pokojowej. Płukania usuwają niezwiązane ligandy i zanieczyszczenia, a czas można dostosować do potrzeb badacza. Usuwaj PBS po każdym praniu.</li>
	<li>Dodaj 2 mL PBS lub preferowanego medium obrazującego i przejdź do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
3. Obrazowanie komórkami żywymi całkowitych i wewnętrznych α7-pHuji nAChR
UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje wewnętrznie wykonany plazmid α7-pHuji pcDNA3.1, współtransfekowany z chaperonem NACHO. Podobny protokół zastosowano do ekspresji α4-SEP i β2-pHuji w pcDNA3.1 za pomocą plazmidu kontrolnego mTagBFP2 pcDNA3.1, jak opisano w sekcji Wyników. Chroń próbki przed światłem przez cały proces, aby zapobiec fotodestrukcji fluoroforu.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor obrazowania pH 7,4 (Tabela 1) oraz bufor chłodzący pH 5,5 (Tabela 2), zgodnie z opisem23.</li>
	<li>Podgrzewanie odczynników do 37 °C, czyszczenie z 70% etanolem i przelanie do szafki do zabezpieczenia biologicznego. Wyjmij transfekowane komórki z inkubatora, wyczyść je 70% etanolem i umieść je w szafce zabezpieczeń biologicznych.</li>
	<li>Usuń stare medium przez ssanie. Przepłucz naczynie 2 mL PBS 3 razy, po 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 2 mL buforu obrazowania pH 7,4.</li>
	<li>Przynieś talerz do mikroskopu konfokalnego. Włóż talerz obrazujący z buforem obrazowania o pH 7,4 do uchwytu szkiełka i umieść uchwyt w komorze podgrzewanej na mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Podłącz rurkę pompy perystaltycznej do uchwytu na talerz obrazujący i zamknij komorę.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie obrazujące i wybierz lasery dla interesujących nas fluoroforów (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm oraz mTagBFP2 359/461 nm).</li>
	<li>Zeskanuj talerz, aby zlokalizować komórki do obrazowania za pomocą obiektywu 10x-60x. Zwiększ powiększenie, jeśli chcesz, i dostosuj głębokość ostrości w razie potrzeby.</li>
	<li>Dostosuj intensywność lasera i czułość detektora, aby zwizualizować fluorescencję bez sygnału tła. W razie potrzeby dostosuj przysłonę, aby zwiększyć sygnał fluorescencji.</li>
	<li>Wybierz preferowaną rozdzielczość i uchwyć pojedynczy obraz przy użyciu wybranego obiektywu (np. 60x).</li>
	<li>Zapisz lokalizację na mapie naczynia, aby przenieść te same komórki po zmianie buforu buforowego do pH 5,5 do kalenia.</li>
	<li>Powtórz proces obrazowania dla kilku obszarów anteny, rejestrując każdą nową lokalizację. Używaj tych samych ustawień przechwytywania dla wszystkich obrazów (eksperymentalnych i grup kontrolnych), aby umożliwić poprawne porównania.</li>
	<li>Utrzymując tylko linię wylotową podłączoną do pompy perystaltycznej, powoli wysysaj bufor pH 7,4 z naczynia do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Gdy większość buforu zostanie usunięta (bez suszenia komórek), przenieś linię wlotową do bufora chłodzenia pH 5,5.</li>
	<li>Włącz pompę perystaltyczną, aby powoli dodawać bufor pH 5,5 (1,5 mL/min) do naczynia, dbając o to, by komórki pozostały przyczepione.</li>
	<li>Uruchom pompę przez 20 minut, obserwując, czy bufor prawidłowo przepływa do i z talerza.</li>
	<li>Wyłącz pompę i inkubuj komórki buforem do hartowania pH 5,5 przez dodatkowe 20 minut, aby zapewnić równowagę.</li>
	<li>Aby powtórzyć obrazowanie, załaduj zapisane lokalizacje z poprzedniej sesji, aby wrócić do tych samych regionów.</li>
	<li>Potwierdź, że głębokość ogniskowa i pozycja są prawidłowe, ponieważ mogą się przesunąć po wymianie bufora.</li>
	<li>Powtórz obrazowanie we wszystkich zapisanych miejscach z użyciem warunku schłodzenia pH.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Koncentracja (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-glukoza</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dostosuj roztwór do pH 7,4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przepis na bufor obrazowania. Dodano następujące odczynniki, a roztwór dostosowano do pH 7,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Koncentracja (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-glukoza</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dostosuj roztwór do pH 5,5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przepis na bufor hartowania. Następujące odczynniki zostały wymieszane, a powstały roztwór został dostosowany do pH 5,5.
4. Kwantyfikacja obrazów
UWAGA: Ta procedura wyjaśnia, jak analizować obrazy komórek za pomocą ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) oraz metody skorygowanej całkowitej fluorescencji komórkowej (CTCF)32.
<ol>
	<li>Otwórz ImageJ i otwórz obraz do analizy. Obraz pojawi się jako stos, z każdym przechwyconym kanałem oddzielonym w tej samej klatce.</li>
	<li>Przejdź do kanału Phase. Jeśli obraz jest zbyt jasny (co jest typowe dla pustych lub tłowych obszarów), wybierz Przetwarzaj > Wzmacniaj kontrast, a następnie kliknij OK.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia lupy przybliż (+) jedną komórkę. Za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego odrysuj kontur komórki w kanale fazowym.</li>
	<li>Przełącz się na kanał fluorescencjonalny odpowiadający interesującemu mnie fluoroforowi. Ustaw pożądane pomiary, wybierając Analizuj > Ustaw Pomiary. Upewnij się, że zaznaczono powierzchnię, średnią wartość szarości oraz zintegrowaną gęstość .</li>
	<li>Aby zmierzyć wybrany obszar, wybierz Analizuj > Mierzyć lub naciśnij Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).</li>
	<li>Wykonaj trzy pomiary tła, śledząc puste obszary w pobliżu komórki. Powtarzaj kroki dla pożądanej liczby komórek.</li>
	<li>Dane pomiarowe pojawią się w osobnym oknie Wyniki w ImageJ. Skopiuj i wklej te dane do Excela do analizy.</li>
	<li>Oblicz średnią średnią tła na podstawie trzech pomiarów tła.</li>
	<li>Oblicz wartość CTCF dla każdej komórki według następującego wzoru: CTCF =Gęstość zintegrowana−(Powierzchnia komórki x Średnia fluorescencja tła)</li>
	<li>Powtórz ten proces dla wielu komórek i obrazów dla każdej grupy eksperymentalnej (oraz warunków pH, jeśli dotyczy). Wyeksportuj wszystkie wyniki do oprogramowania do analizy danych do przetwarzania statystycznego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione metodologie ekspresji i ilościowej identyfikacji podjednostek nAChR w komórkach N2a ssaków odpowiadają na długoletnie wyzwania w osiąganiu szybkiej (~24 godziny) i obfitej ekspresji nAChR (> 60%) w błonie plazmatycznej w badaniach odkrywania, lokalizacji i handlu lekami. Kluczową siłą tego zestawu protokołów jest jego zdolność adaptacji zarówno dla homomerycznych (α7), jak i heteromerycznych (α4β2) nAChR, a prawdopodobnie jest stosowany także do innych podtypów nAChR, wraz z współekspresją białek chaperonow...

Neuronalne receptory nikotynowe acetylocholinowe (nAChR) to ligandowe kanały transbłonowe wyrażane na błonie plazmatycznej wielu typów komórek, w tym neuronów, komórek glejowych i komórek odpornościowych. Receptory te składają się z α (α2-α10) lub β (β2-β4) podjednostek, które łączą się, tworząc podtypy homomeryczne lub heteromeryczne, przy czym α7 i α4β2 nAChR są najbardziej liczne w mózgu 1,2. Dysregulacja tych podtypów była powiązana z chorobą Alzheimera, zaburzeniami użycia nikotyny, nadnadpobudliwą padaczką hipermotoryczną związaną ze snem, chorobą Parkinsona oraz ciężką depresją, a także innymi schorzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Szybkie i wiarygodne metody ekspresji i ilościowej oceny nAChR są niezbędne do zrozumienia mechanizmów chorób oraz opracowania terapii selektywnych do celowania. Jednak osiągnięcie silnej ekspresji tych receptorów przez błonę plazmatyczną jest często trudne i czasochłonne. Opisana tutaj metoda umożliwia silną ekspresję powierzchniową nAChR w ciągu około 24 godzin po transfekcji DNA i może być łączona z ligandami lub białkami chaperonowymi modulującymi transport receptorów.
Istnieje kilka metod ekspresji nAChR, w tym transientna transfekcja DNA lub generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających pożądany podtyp. Chociaż tworzenie stabilnych linii komórkowych jest przydatne w długoterminowych badaniach dotyczących tego samego podtypu receptora, proces ten jest pracochłonny i może zająć kilka miesięcy. Po ustaleniu takie linie komórkowe mogą wykazywać zmienną ekspresję receptorów w przejściach, utratę ekspresji w czasie lub błędy selekcyjne dla klonów o suboptymalnej funkcji receptora lub gęstości13. Obniżenie temperatury inkubacji z 37 °C do 30 °C, dodanie molekularnych chaperonów takich jak nikotyna lub wydłużenie czasu inkubacji mogą sprzyjać ekspresji powierzchniowej 13,14,15. Ograniczenia te są szczególnie widoczne w przypadku heteromerycznych nAChR, które wymagają prawidłowego składania i transportu podjednostek, oraz badań skupiających się na regulacji receptorów wspomaganych przez chaperony. Dlatego rutynowa walidacja ekspresji podtypów receptorów w przejściach jest konieczna przy pracy ze stabilnymi liniami komórkowymi ekspresyjnymi nAChR.
Często naukowcy interesują się wariantami podjednostek nAChR oraz podjednostkami chaperonów lub pomocniczych białek, dlatego muszą ekspresjonować różnorodne DNA w szybkim tempie, aby umożliwić szybką elastyczność w testach. Ekspresja przejściowa nAChR jest w tym względzie korzystna, ponieważ proces może być szybko zakończony, pozwalając badaczowi badać wiele podtypów receptorów lub warunków eksperymentalnych bez konieczności czekania miesięcy na wygenerowanie stabilnych linii komórkowych. Częstym zjawiskiem, nawet przy ekspresji przejściowej, jest to, że wiele nAChR pozostaje w komórce 24 godziny po indukcji w temperaturze 37 °C, co wymaga dodatkowych okresów inkubacji > 48 godzin16,17. Na przykład, bez białka chaperonu odpornego na inhibitory cholinesterazy (RIC)-3, tylko ~1% α7 nAChR jest wyrażanych na błonie plazmatycznej komórek SHE-P ssaków18. Przy współekspresji RIC-3 wykrywa się na powierzchni około 20% α7 nAChR. Chociaż jest to poprawa, całkowita liczebność receptorów pozostaje niska. Współekspresja α7 nAChR z NACHO może dodatkowo zwiększyć ekspresję powierzchniową, choć nadal mniej niż 40% całej populacji receptorów trafia do błony plazmatycznej19. Innym podejściem jest inkubacja komórek transfekowanych w temperaturze 30 °C, aby poprawić ekspresję błony plazmatycznej20,21. Dla α4β2 nAChR ta redukcja temperatury powoduje pięciokrotne zwiększenie gęstości receptorów powierzchniowych bez odpowiadającego wzrostu całkowitej podjednostkibiałka 21. Jednak ta poprawa wymaga co najmniej jednego dodatkowego dnia oraz większego użycia materiałów zużywalnych, odczynników i instrumentów.
Przedstawione prace oferują zestaw zoptymalizowanych metod ekspresji i ilościowej ekspresji i ilościowej ekspresji konkretnych podtypów nAChR w ciągu 24 godzin po transfekcji w komórkach N2a ssaków, osiągając około 83% dla α7, 77% dla α4 oraz 56% dla podjednostek β2 zlokalizowanych w błonie plazmatycznej. W przypadku α7 nAChR ekspresję błony plazmatycznej można ilościowo określić za pomocą α7-selektywnej, fluorescencyjnie oznakowanej α-bungarotoksyny (αBTX) lub poprzez rekombinowane znakowanie fluorescencyjne. Aby oznaczyć każdą podjednostkę, na końcu C poszczególnych podjednostek nAChR 25,26 są projektowane fluorescencyjne białka pHuji i superekliptyczne pHluorin (SEP)22,23,24. pHuji i SEP to warianty czerwonych i zielonych białek fluorescencyjne wrażliwe na pH, które fluorescencją przy pH 7,4, ale są chłodzone w bardziej kwaśnych warunkach27,28. Ponieważ fluorescencja SEP i pHuji jest tłumiona przy pH < 6, każdy obserwowany sygnał wewnątrzkomórkowy odzwierciedla fluorofory znajdujące się w przedziałach obojętnych, a nie na błonie plazmatycznej. Należy zauważyć, że niektóre organelle, takie jak aparat Golgiego, mają kwaśne światło światła; w związku z tym fluorofory przyłączone do obszaru C-końcowego podjednostek nAChR nie są wykrywane, gdy podjednostki przechodzą przez szlak sekretorowy29. Różnica między całkowitą fluorescencją przy pH 7,5 a pH < 6 stanowi sygnał generowany przez nAChR zlokalizowane na błonie plazmatycznej. Rejestrowanie obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej z żywymi komórkami zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną, umożliwiającą precyzyjną ilościową lokalizację podjednostek. Dodatkowo, przeprowadzanie wszystkich eksperymentów na żywych komórkach pozwala każdej komórce pełnić rolę własnej kontroli, uwzględniając zmienność ekspresji białek między komórkami w każdej grupie leczenia30. Metoda ta może być dodatkowo dostosowana do dodatkowych białek chaperonowych, takich jak NACHO lub inne, do badania transportu nAChR. Dodatkowe zastosowania obejmują modulację farmakologiczną, włączenie podjednostek pomocniczych oraz analizę zmian związanych z chorobą w ekspresji nAChR.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA (1x) &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Odczynnik odłączający komórkę</td></tr><tr><td>Alfa-bungarotoksyna Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Sprzężony alfa-bungarotoksyna</td></tr><tr><td>Szafa BSL poziomu 1 Biosafety &nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Obszar roboczy hodowli komórek sterylnych</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>EMEM z L-glutaminą</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Ośrodek komórkowy</td></tr><tr><td>DNA wolne od endotoksyn</td><td>Stworzone wewnętrznie z wykorzystaniem zestawów Zymo</td><td>Nie ma zastosowania</td><td>DNA nAChR ma być wykorzystywane do transfekcji przejściowych komórek</td></tr><tr><td>Mikrowirówki wolne od endotoksyn, 0,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>DNA i przygotowanie do transfekcji</td></tr><tr><td>Mikrowirówki wolne od endotoksyn, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>DNA i przygotowanie do transfekcji</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Suplement serum</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Naczynia MatTek z szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Naczynia obrazujące</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prism</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Odczynnik transfekcyjny</td></tr><tr><td>Heksahydrat chlorku magnezu</td><td>Termonaukowe</td><td>413410025</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>M5287</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>54572</td><td>DNA kontrolne do wykorzystania do transfekcji przejściowej komórki&nbsp;</td></tr><tr><td>Komórki Neuro 2a (N2a)</td><td>Kolekcja Amerykańskiej Kultury Typowej</td><td>CCL-131</td><td>Komórki wykorzystywane do transfekcji DNA i ekspresji nAChR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Zmniejszona ilość surowicy</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>Bufor zmienia się podczas obrazowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym</td><td>Jakość biologiczna</td><td>119-069-131</td><td>Bufor soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>140084</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Końcówki na pipet (sterylne i wolne od endotoksyn, 1000 uL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Końcówki pipet (sterylne i wolne od endotoksyn, 20 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Końcówki pipetyczne (sterylne i wolne od endotoksyn, 250 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Pipety, P10</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Pipety, P100</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Pipety, P1000</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>Serologiczne pipety (bezpłodne i beztlenowe, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Serologiczne pipety (bezpłodne i wolne od endotoksyn, 25 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Serologiczne pipety (bezpłodne i wolne od endotoksyn, 5 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Serologiczne pipety (sterylne i wolne od endotoksyn, 50 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Precyzyjny transfer cieczy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Komponent bufora</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkanek</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>Naczynia do uprawy</td></tr><tr><td>Zestaw Maxiprep ZymoPure II Plasmid</td><td>BADANIA ZYMO</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Produkcja DNA wolnego od endotoksyny</td></tr><tr><td>&alpha; 4-WRZEŚNIA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt Usługi Syntezy Genów & nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Usługi syntezy genów na zamówienie</td></tr><tr><td>&alpha; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Usługi syntezy genów na zamówienie</td></tr><tr><td>&beta; 2-pHuji</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt Usługi Syntezy Genów & nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Usługi syntezy genów na zamówienie</td></tr></tbody></table>

lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Ilościowa identyfikacja neuronalnych receptorów nikotynowych acetylocholinowych (nAChR) wyrażanych na błonie plazmatycznej komórek ssaków jest istotna dla rozwoju nowych terapii selektywnych na cele oraz do badania białek chaperonów modulujących transport receptorów. Badanie to przedstawia solidny zestaw metodologii ekspresji zarówno homomerycznych, jak i heteromerycznych nAChR w komórkach neuro2a (N2a) ssaków oraz ilościowego określenia ich lokalizacji powierzchniowej i wewnątrzkomórkowej za pomocą fluorescencyjnych znaczników na pH wrażliwych. pHuji i superekliptyczna pHluorin (SEP) to białka wrażliwe na pH, które można zmodyfikować do oznaczania białek rekombinowanych, umożliwiając wizualizację przestrzennego rozkładu podjednostek nAChR. Te znaczniki fluorescencyjne emitują przy neutralnym pH, ale są hartowane w środowisku kwaśnym. Aby śledzić względną lokalizację wewnętrznych i plazmowych podjednostek α7, α4 i β2 nAChR, do końca C każdej konstrukcji DNA przyłącza się albo pHuji, albo SEP. Aby wyrazić α7-pHuji wraz z chaperonem NACHO, czyli (α4-SEP; β2-pHuji) w komórkach N2a, stosuje się lipidowy reagent transfekcyjny DNA. Odczynnik transfekcyjny i DNA plazmidu są inkubowane oddzielnie w medium o obniżonej surowicy w temperaturze pokojowej, a następnie łączą się, tworząc kompleksy lipidowo-DNA ułatwiające dostarczanie plazmidów do komórek. Po inkubacji komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek zarówno w warunkach wysokiego, jak i niskiego pH lub w obecności podtypowego selektywnego ligandu fluorescencyjnego. Obrazy są analizowane za pomocą skorygowanej całkowitej fluorescencji komórkowej w odpowiednich kanałach fluoroforowych, dostarczając ilościowych informacji o rozmieszczeniu fluorescencyjnie oznakowanych podjednostek nAChR między błoną plazmatyczną a przedziałami wewnątrzkomórkowymi. Konfokalne obrazowanie komórek żywych umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym lokalizacji podjednostek nAChR, aby rozróżnić różnice między populacjami receptorów wewnętrznych i powierzchniowych. Odporna ekspresja błony plazmatycznej α7-pHuji lub (α4-SEP; β2-pHuji) osiąga się w ciągu 24 godzin w temperaturze 37 °C. Metoda ta może być dostosowana do dodatkowych chaperonów, podjednostek pomocniczych lub ligandów fluorescencyjnej do badania transportu nAChR, modulacji farmakologicznej oraz zmian związanych z chorobą w ekspresji nAChR.

Po powyższych procedurach transfekcji, α7 nAChR oraz białko chaperonu NACHO były współekspresowane w komórkach N2a. Zarówno komórki nietransfekowane, jak i transfekowane zostały oznaczone αBTX-AF647 24 godziny po transfekcji DNA. Ponieważ αBTX nie jest przepuszczalny przez błonę, cała wykryta fluorescencja pochodzi z receptorów obecnych na błonie plazmatycznej. Na Rysunku 2A,A′ zaobserwowano słabe barwienie αBTX-AF647 w komórkach N2a bez transfekcji, zgodnie z oczekiwaniami....

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

Zrozumienie transportu receptorów nikotynowych acetylocholinowych do błon plazmatycznych ssaków jest kluczowe dla badania regulacji pośredniczonej przez chaperony oraz oceny terapii selektywnych pod kątem celu. Główną zaletą sond wrażliwych na pH w połączeniu z konfokalną mikroskopią żywych komórek jest wysoka rozdzielczość przestrzenna lokalizacji podjednostek. Na początek podgrzej odczynniki do 37 stopni Celsjusza.Całkowicie rozmroz DNazę podjednostki nAChR i dostosuj odczynnik transfekcyjny do temperatury pokojowej. Wszystkie odczynniki należy wyczyścić 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafce zabezpieczeń biologicznych. Aby wyrazić alfa-7 nAChR, w mikrowirówce rozcieńcz plazmidową DNazę alfa-7 i NACHO do zredukowanego medium surowicowego.Delikatnie mieszaj, pipetując po dodaniu DNA. Alternatywnie, aby wyrazić receptory alfa-4 beta-2, rozcieńcz 4 mikrogramy każdego podjednostkowego DNA do łącznie 250 mikrolitrów zredukowanego medium surowicowego i delikatnie wymieszać. Dostosuj stosunki podjednostek, aby zoptymalizować ekspresję konkretnych izoform receptorów.Dla receptorów alfa-4 beta-2 z dodatkowym plazmidem należy dodać równe ilości każdego plazmidowego DNA. Następnie w nowej mikrowirówce rozcieńcz 8 mikrolitrów odczynnika transfekcyjnego kroplą do 250 mikrolitrów zredukowanego medium surowicowego. Po 5-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej połącz rozcieńczoną DNazę z rozcieńczonym odczynnikiem transfekcyjnym kroplami do probówki.Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Podczas tworzenia się kompleksów zastąp medium w naczyniach hodowlanych na 1 mililitr EMEM bez surowicy (EMEM). Do każdej misy dodaj 500 mikrolitrów kompleksu odczynnikowego DNA transfekcyjnego kroplami.Mieszaj delikatnie, kołysząc talerz, aby równomiernie rozłożyć płytę, zwłaszcza na spodku szkła. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny i wymień podłoże po 4-6 godzinach. Usuń stare medium przez ssanie.Płucz naczynie trzy razy dwoma mililitrami PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj do naczynia 2 mililitry buforu obrazującego pH 7,4. Wkładaj talerz obrazujący do uchwytu szkiełka mikroskopu konfokalnego i umieść uchwyt w komorze podgrzanej środowiska.Podłącz rurkę pompy perystaltycznej do uchwytu na talerz obrazujący i zamknij komorę środowiskową. Teraz uruchom oprogramowanie obrazujące i wybierz lasery dla interesujących nas fluoroforów. Zeskanuj antenę, aby zlokalizować komórki do obrazowania za pomocą obiektywu 10-60 x.Zwiększ powiększenie, jeśli chcesz, i dostosuj głębokość ostrości w razie potrzeby. Wybierz preferowaną rozdzielczość i wykonaj pojedynczy obraz z użyciem wybranego obiektywu. Zapisz lokalizację na mapie talerza, aby przenieść te same komórki po zmianie bufora.Powtarzaj obrazowanie dla kilku obszarów anteny, używając tych samych ustawień przechwytywania wszystkich obrazów. Utrzymując tylko linię wylotową podłączoną do pompy perystaltycznej, powoli wysysaj bufor pH 7,4 z naczynia do pojemnika na odpady. Następnie przenieś linię wlotową do bufora chłodzenia pH 5,5.Włącz pompę perystaltyczną, aby dodać bufor pH 5,5 z przepływem 1,5 mililitra na minutę, zapewniając przymocowanie komórek. Po 20 minutach wyłącz pompę i inkubuj komórki w buforze przez dodatkowe 20 minut, aby zapewnić równowagę. Po inkubacji powtórz obrazowanie zapisanych lokalizacji.Aby rozpocząć kwantyfikację obrazu, otwórz ImageJ i załaduj obraz do analizy. Obraz pojawi się jako stos, z każdym przechwyconym kanałem wyświetlanym w tej samej klatce. Przejdź do kanału fazowego.Jeśli obraz wydaje się zbyt jasny, wybierz Procesować, wybierz Zwiększ kontrast, a następnie kliknij OK. Użyj narzędzia lupy, aby przybliżyć jedną komórkę. Użyj narzędzia do wyboru odręcznie, aby narysować kontur komórki w kanale fazowym. Następnie przełącz się na kanał fluorescencyjny odpowiadający interesującemu się fluoroforowi.Ustaw pożądane wymiary, wybierając Analizuj i klikając na Ustaw pomiary. Upewnij się, że zaznaczono powierzchnię, średnią wartość szarości oraz gęstość zintegrowaną. Aby zmierzyć wybrany region, wybierz Analizuj, a następnie kliknij Mierz.Wykonaj trzy pomiary tła, śledząc puste obszary w pobliżu wybranej komórki. Po wykonaniu pomiarów dla wszystkich pożądanych komórek, skopiuj i wklej dane pomiarowe do Excela do analizy. Następnie oblicz średnią średnią tła z trzech pomiarów tła.Oblicz skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek, czyli wartość CTCF dla każdej komórki, korzystając z podanego wzoru. Korzystając z tego samego workflow, analizuj obrazy uzyskane po zmianie bufora. Eksportuj wszystkie wyniki do oprogramowania do analizy danych do przetwarzania statystycznego.Słabe barwienie alfa-BTX AF647 zaobserwowano w komórkach N2a nietransfekowanych, natomiast w komórkach transfekowanych DNA alfa-7 wykryto silne znakowanie punktatu. Ilościowe badania potwierdziły, że ekspresja alfa-7 nAChR w błonie plazmatycznej była istotnie wyższa w komórkach alfa-7 transfekowanych niż w grupach kontrolnych bez transfekcji. Przy pH 7,4 widoczna była całkowita fluorescencja alfa-7 pHuji w błonie plazmatycznej.w transfekowanych komórkach N2a. Przy pH 5,5 fluorescencja alfa-7 pHuji została zmniejszona, co ujawniło lokalizację receptorów wewnętrznych. Zewnętrzna fluorescencja receptora alfa-7 pHuji odpowiadała za większość ekspresji receptorów.Ilościowa analiza wykazała, że 82,6% receptorów alfa-7 pHuji znajdowało się na błonie plazmatycznej, podczas gdy 17,4% było wewnętrznych. Fluorescencja została przywrócona po powrocie do pH 7,4, co potwierdza odwracalność sygnału pHuji. Przy pH 7,4 komórki N2a wyrażające alfa-4 SEP i beta-2 pHuji wykazały silną fluorescencję błonową dla obu podjednostek.Przy pH 5,5 fluorescencja została wygaszona, co wskazuje na wewnętrzną lokalizację niektórych podjednostek alfa-4 SEP i beta-2 pHuji. Ilościowa analiza wykazała, że 76,5% alfa-4 SEP znajduje się w błonie plazmatycznej, a 23,4% w błonie wewnętrznej. W komórkach potrójnie transfekowanych alfa-4 SEP wykazywał 82,8% lokalizacji błonowej i 17,2% ekspresji wewnętrznej.W tych samych komórkach 63,4% podjednostek beta-2 pHuji zlokalizowano na błonie, podczas gdy 36,6% znajdowało się wewnątrzkomórkowo. Korzystając z przedstawionego protokołu, scharakteryzowaliśmy nowe efekty chaperonów na ekspresję i handel receptorami nikotynowymi oraz oceniliśmy nowe terapie selektywne pod kątem celu. Zaletą naszego protokołu jest zdolność adaptacji dla homomerycznych i heteromerycznych receptorów nikotynicznych, co umożliwia ilościowe określenie względnej lokalizacji komórkowej.Nasze podejście umożliwia szybką, silną ekspresję membrany plazmatycznej receptorów nikotynicznych, wspierając analizę handlu za pomocą chaperonów oraz działania odkrywające leki.

localization-plasma-membrane-intracellular-neuronal-nicotinic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

Źródło: Zhang, J., et al. Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę mikroskopii elektronowej do wizualizacji lokalizacji receptora neuroprzekaźnika w synapsach siatkówki. Skrawki siatkówki zawierają komórki zwojowe siatkówki, które wykazują receptory neuroprzekaźników związane z błoną i są znakowane podjednostką B toksyny cholery (CTB). Po znakowaniu markerów przeciwciałami...

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości receptorów neuroprzekaźników w synapsach siatkówki

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę ilościowej lokalizacji receptorów nikotynowych acetylocholiny w komórkach ssaków Neuro2a. Wykorzystuje się pH-czułe znaczniki fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną do badania ekspresji błonowej i wewnątrzkomórkowej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów