Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Zrozumienie transportu receptorów nikotynowych acetylocholinowych do błon plazmatycznych ssaków jest kluczowe dla badania regulacji pośredniczonej przez chaperony oraz oceny terapii selektywnych pod kątem celu. Główną zaletą sond wrażliwych na pH w połączeniu z konfokalną mikroskopią żywych komórek jest wysoka rozdzielczość przestrzenna lokalizacji podjednostek. Na początek podgrzej odczynniki do 37 stopni Celsjusza.

Całkowicie rozmroz DNazę podjednostki nAChR i dostosuj odczynnik transfekcyjny do temperatury pokojowej. Wszystkie odczynniki należy wyczyścić 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafce zabezpieczeń biologicznych. Aby wyrazić alfa-7 nAChR, w mikrowirówce rozcieńcz plazmidową DNazę alfa-7 i NACHO do zredukowanego medium surowicowego.

Delikatnie mieszaj, pipetując po dodaniu DNA. Alternatywnie, aby wyrazić receptory alfa-4 beta-2, rozcieńcz 4 mikrogramy każdego podjednostkowego DNA do łącznie 250 mikrolitrów zredukowanego medium surowicowego i delikatnie wymieszać. Dostosuj stosunki podjednostek, aby zoptymalizować ekspresję konkretnych izoform receptorów.

Dla receptorów alfa-4 beta-2 z dodatkowym plazmidem należy dodać równe ilości każdego plazmidowego DNA. Następnie w nowej mikrowirówce rozcieńcz 8 mikrolitrów odczynnika transfekcyjnego kroplą do 250 mikrolitrów zredukowanego medium surowicowego. Po 5-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej połącz rozcieńczoną DNazę z rozcieńczonym odczynnikiem transfekcyjnym kroplami do probówki.

Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Podczas tworzenia się kompleksów zastąp medium w naczyniach hodowlanych na 1 mililitr EMEM bez surowicy (EMEM). Do każdej misy dodaj 500 mikrolitrów kompleksu odczynnikowego DNA transfekcyjnego kroplami.

Mieszaj delikatnie, kołysząc talerz, aby równomiernie rozłożyć płytę, zwłaszcza na spodku szkła. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny i wymień podłoże po 4-6 godzinach. Usuń stare medium przez ssanie.

Płucz naczynie trzy razy dwoma mililitrami PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj do naczynia 2 mililitry buforu obrazującego pH 7,4. Wkładaj talerz obrazujący do uchwytu szkiełka mikroskopu konfokalnego i umieść uchwyt w komorze podgrzanej środowiska.

Podłącz rurkę pompy perystaltycznej do uchwytu na talerz obrazujący i zamknij komorę środowiskową. Teraz uruchom oprogramowanie obrazujące i wybierz lasery dla interesujących nas fluoroforów. Zeskanuj antenę, aby zlokalizować komórki do obrazowania za pomocą obiektywu 10-60 x.

Zwiększ powiększenie, jeśli chcesz, i dostosuj głębokość ostrości w razie potrzeby. Wybierz preferowaną rozdzielczość i wykonaj pojedynczy obraz z użyciem wybranego obiektywu. Zapisz lokalizację na mapie talerza, aby przenieść te same komórki po zmianie bufora.

Powtarzaj obrazowanie dla kilku obszarów anteny, używając tych samych ustawień przechwytywania wszystkich obrazów. Utrzymując tylko linię wylotową podłączoną do pompy perystaltycznej, powoli wysysaj bufor pH 7,4 z naczynia do pojemnika na odpady. Następnie przenieś linię wlotową do bufora chłodzenia pH 5,5.

Włącz pompę perystaltyczną, aby dodać bufor pH 5,5 z przepływem 1,5 mililitra na minutę, zapewniając przymocowanie komórek. Po 20 minutach wyłącz pompę i inkubuj komórki w buforze przez dodatkowe 20 minut, aby zapewnić równowagę. Po inkubacji powtórz obrazowanie zapisanych lokalizacji.

Aby rozpocząć kwantyfikację obrazu, otwórz ImageJ i załaduj obraz do analizy. Obraz pojawi się jako stos, z każdym przechwyconym kanałem wyświetlanym w tej samej klatce. Przejdź do kanału fazowego.

Jeśli obraz wydaje się zbyt jasny, wybierz Procesować, wybierz Zwiększ kontrast, a następnie kliknij OK. Użyj narzędzia lupy, aby przybliżyć jedną komórkę. Użyj narzędzia do wyboru odręcznie, aby narysować kontur komórki w kanale fazowym. Następnie przełącz się na kanał fluorescencyjny odpowiadający interesującemu się fluoroforowi.

Ustaw pożądane wymiary, wybierając Analizuj i klikając na Ustaw pomiary. Upewnij się, że zaznaczono powierzchnię, średnią wartość szarości oraz gęstość zintegrowaną. Aby zmierzyć wybrany region, wybierz Analizuj, a następnie kliknij Mierz.

Wykonaj trzy pomiary tła, śledząc puste obszary w pobliżu wybranej komórki. Po wykonaniu pomiarów dla wszystkich pożądanych komórek, skopiuj i wklej dane pomiarowe do Excela do analizy. Następnie oblicz średnią średnią tła z trzech pomiarów tła.

Oblicz skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek, czyli wartość CTCF dla każdej komórki, korzystając z podanego wzoru. Korzystając z tego samego workflow, analizuj obrazy uzyskane po zmianie bufora. Eksportuj wszystkie wyniki do oprogramowania do analizy danych do przetwarzania statystycznego.

Słabe barwienie alfa-BTX AF647 zaobserwowano w komórkach N2a nietransfekowanych, natomiast w komórkach transfekowanych DNA alfa-7 wykryto silne znakowanie punktatu. Ilościowe badania potwierdziły, że ekspresja alfa-7 nAChR w błonie plazmatycznej była istotnie wyższa w komórkach alfa-7 transfekowanych niż w grupach kontrolnych bez transfekcji. Przy pH 7,4 widoczna była całkowita fluorescencja alfa-7 pHuji w błonie plazmatycznej.

w transfekowanych komórkach N2a. Przy pH 5,5 fluorescencja alfa-7 pHuji została zmniejszona, co ujawniło lokalizację receptorów wewnętrznych. Zewnętrzna fluorescencja receptora alfa-7 pHuji odpowiadała za większość ekspresji receptorów.

Ilościowa analiza wykazała, że 82,6% receptorów alfa-7 pHuji znajdowało się na błonie plazmatycznej, podczas gdy 17,4% było wewnętrznych. Fluorescencja została przywrócona po powrocie do pH 7,4, co potwierdza odwracalność sygnału pHuji. Przy pH 7,4 komórki N2a wyrażające alfa-4 SEP i beta-2 pHuji wykazały silną fluorescencję błonową dla obu podjednostek.

Przy pH 5,5 fluorescencja została wygaszona, co wskazuje na wewnętrzną lokalizację niektórych podjednostek alfa-4 SEP i beta-2 pHuji. Ilościowa analiza wykazała, że 76,5% alfa-4 SEP znajduje się w błonie plazmatycznej, a 23,4% w błonie wewnętrznej. W komórkach potrójnie transfekowanych alfa-4 SEP wykazywał 82,8% lokalizacji błonowej i 17,2% ekspresji wewnętrznej.

W tych samych komórkach 63,4% podjednostek beta-2 pHuji zlokalizowano na błonie, podczas gdy 36,6% znajdowało się wewnątrzkomórkowo. Korzystając z przedstawionego protokołu, scharakteryzowaliśmy nowe efekty chaperonów na ekspresję i handel receptorami nikotynowymi oraz oceniliśmy nowe terapie selektywne pod kątem celu. Zaletą naszego protokołu jest zdolność adaptacji dla homomerycznych i heteromerycznych receptorów nikotynicznych, co umożliwia ilościowe określenie względnej lokalizacji komórkowej.

Nasze podejście umożliwia szybką, silną ekspresję membrany plazmatycznej receptorów nikotynicznych, wspierając analizę handlu za pomocą chaperonów oraz działania odkrywające leki.