Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen
27 lutego 2026
Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.
Badania te koncentrują się na zrozumieniu, jak patogeny bakterii infekują nabłonek prostaty oraz które interakcje patogenów gospodarzy decydują o wyniku infekcji. Istniejące modele in vitro słabo oddały różnorodność nabłonka prostaty. Model ten zapewnia fizjologicznie istotny system, który odzwierciedla różne typy komórek obecne w tkance.
Na początek poprowadź trójwymiarowe mięśnie prostaty myszy hodowane na kroplachach macierzy zewnątrzkomórkowej w 24-dołkowej płytce. Aspiruj podłoże z pożądanej liczby dołków i dodaj 500 mikrolitrów świeżego medium do każdego dołu. Użycie pipety P 1000 mechanicznie zakłóca kroplę macierzy zewnątrzkomórkowej w każdej dołku.
Zbieraj tę zawiesinę w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów, z maksymalnie dwoma dołkami na probówkę. Dodaj świeże podłoże hodowlane, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów. Delikatnie odwróć probówkę trzy do czterech razy, aby wymieszać i wirować w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aspiruj nadwysoka. Ponownie zawiesz pellet w dwóch mililitrach roztworu enzymatycznego, podgrzej do 37 stopni Celsjusza i inkubuj zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Używając pipety o stężeniu P 1000, mieszaj zawiesinę komórkową co pięć minut podczas inkubacji.
Po inkubacji dodaj świeży podłoże hodowlane, aby uzyskać ostateczną objętość 10 mililitrów. Delikatnie odwróć rurkę trzy do czterech razy, aby wymieszać. Wirówka na 450 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.
Aspiruj supernatant bez zakłócania granulki. Ponownie zawiesz pellet w 300 mikrolitrach pożywki hodowlanej, uzupełnionej inhibitorem skał o stężeniu 10 mikromolów. Za pomocą komory liczącej Neubauera liczą komórki w zawiesie.
Rozcieńcz zawiesinę do stężenia 62 500 komórek na mililitr w pożywce hodowlarskiej z dodatkiem inhibitora skał o stężeniu 10 mikromolowym. Następnie zasiewano 200 mikrolitrów zawiesiny na odwór dla płyty 48-dołkowej oraz 300 mikrolitrów na odwór dla komorowych mikroszkiełek. Inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po jednym dniu sprawdź, czy większość pojedynczych komórek przyczepiła się do powierzchni dwuwymiarowej hodowli. Wymieniaj podłoże co dwa do trzech dni i kontynuuj hodowlę aż do osiągnięcia konfluentu w ciągu siedmiu dni. Aby wywołać różnicowanie i wzbogacać komórki luminalne, należy dodać 10 nanomolów pięcio-dihydrotestosteronu lub DHT do zawiesiny komórkowej podczas zasiewania.
Nasiądź uropatogeniczną odmianę Escherichia coli, czyli UPEC, na płytkę agarową LB z dodatkiem 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Za pomocą sterylnej pętli inokuluj trzy mililitry bulionu LB uzupełnionego o 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny w pojedynczej kolonii bakteryjnej.
Inkubuj hodowlę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Zrób wireks nocnej hodowli bakteryjnej. Zmierz gęstość optyczną hodowli na 600 nanometrów.
Następnie oblicz objętość hodowli potrzebną do uzyskania początkowej gęstości optycznej 0,05 w trzech mililitrach bulionu. Dodaj obliczoną objętość hodowli bakteryjnej do świeżego bulionu LB z dodatkiem ampicyliny. Inkubuj statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Po inkubacji przeprowadź posiewkę bakteryjną w wirze. Zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrów. Oblicz objętość hodowli potrzebną do uzyskania gęstości optycznej jednego.
Wiruj wymaganą objętość w 12 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Aspiruj i odrzucaj supernatant. Ponownie zawiesić granulat bakteryjny w jednym mililitrze primusa i wolnej pożywki do hodowli organoidów bez DHT.
Następnie rozcieńcz zawiesinę pożywką hodowli prostaty myszy, aby uzyskać częstość zakażenia 100. Aspiruj medium hodowlane z przygotowanego modelu organoidalnego. Do każdej dołki płytki z 48 dołkami dodaj 200 mikrolitrów pożywki z bakteriami.
Inkubuj przez godzinę w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Aspiruj bakterie zawierające podłoże z dołków i przemyj je trzy razy świeżym medium hodowlarskim, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Następnie dodaj podłoże o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr gentamycyny i inkubuj przez 30 minut.
Aspiruj medium. Dodaj świeże medium hodowlane, uzupełnione o 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny na pozostały czas infekcji. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby obrazować zakażone komórki po fluorescencyjnym barwieniu i ilościowo określić zakażone komórki za pomocą cytometru przepływowego.
W warunkach kontrolnych, bez dihydrotestosteronu, większość komórek miała cytokeratynę, pięć dodatnich komórek bazalnych, z wyjątkiem kilku wykazujących niską ekspresję luminalną CD 24/8. Suplementacja jednym nanomolarem DHT dała mieszane populacje lumminalne bazalne, choć poziom CD 24A pozostał niski. Zwiększenie DHT do 10 nanomolów sprzyjało różnicowaniu się do komórek luminalnych, jednocześnie utrzymując część komórek podstawnych po siedmiu dniach hodowli.
To koreluje z badaniami ilościowymi, które wykazały spadek cytokeratyny o pięć dodatnich komórek podstawnych oraz wzrost liczby komórek luminalnych z dodatnim wynikiem CD 24A przy wzroście stężenia DHT w czasie. W ciągu zera godzin po infekcji UPEC przylegał do komórek nabłonkowych w dużej liczbie. Po godzinnym leczeniu genamycyną liczba komórek UPEC-dodatnich gwałtownie spadła.
Po 24 godzinach liczba zakażonych komórek była podobna do tej po godzinie. Obrazowanie konfokalne po 24 godzinach wykazało, że bakterie wewnątrzkomórkowe nadal się replikują, tworząc skupiska przypominające wspólnotę. Protokół ten pozwala badaczom badać dynamikę infekcji bakteryjnych oraz interakcje patogenów w modelu zachowującym różnorodność komórek nabłonkowych.
Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do badania różnych chorób prostaty, w tym infekcji, biologii nowotworów oraz testowania potencjalnych związków terapeutycznych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół tworzenia dwuwymiarowego (2D) modelu hodowli pochodzącej z organoidów prostaty myszy. Model ten zachowuje kluczowe cechy nabłonkowe i zapewnia bezpośredni dostęp do powierzchni apikalnej, co umożliwia szczegółowe badania oddziaływań gospodarz-patogen, w szczególności z uropatogennym Escherichia coli (UPEC). Protokół obejmuje procedury dysocjacji organoidów, wysiewania komórek, różnicowania oraz infekcji, które zostały zwalidowane za pomocą immunofluorescencji i testów funkcjonalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia nabłonka prostaty
- Interakcje gospodarz-patogen
- Modele organoidów i kultur komórkowych
Wprowadzenie
- Choroby prostaty, takie jak łagodny przerost prostaty, zapalenie prostaty oraz rak prostaty, są powszechne u starzejących się mężczyzn.
- Modele organoidalne odwzorowują strukturę i funkcję nabłonka, ale ograniczają dostęp do powierzchni apikalnej.
- Istniejące modele in vitro nie oddają w pełni różnorodności komórek nabłonka prostaty.
- Konieczne jest opracowanie ulepszonych modeli w celu badania dynamiki infekcji oraz mechanizmów chorobowych.
Cel badania
- Opracowanie fizjologicznie istotnego systemu hodowli 2D z organoidów prostaty myszy.
- Umożliwienie bezpośredniego dostępu eksperymentalnego do powierzchni apikalnej w badaniach nad infekcjami.
- Walidacja różnorodności nabłonkowej modelu oraz jego przydatności do badań nad interakcjami gospodarz-patogen.
Zastosowane metody
- Dysocjacja dojrzałych organoidów prostaty mysiej hodowanych w macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Wysiew dysocjowanych komórek na powierzchnie hodowli 2D w zoptymalizowanych warunkach dla adhezji i proliferacji.
- Indukcja różnicowania przy użyciu suplementacji dihydrotestosteronem (DHT).
- Zakażenie modelu 2D szczepem UPEC i analiza z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej, pomiarów TEER oraz cytometrii przepłyewowej.
Główne wyniki
- Model 2D zachował kluczowe cechy nabłonka oraz różnorodność komórkową.
- Suplementacja DHT modulowała równowagę między populacjami komórek podstawnych a luminalnymi.
- UPEC przylegały do komórek nabłonkowych i naciekały je, tworząc wewnątrzkomórkowe skupiska zaobserwowane w mikroskopii konfokalnej.
- Leczenie gentamycyną skutecznie zredukowało bakterie zewnątrzkomórkowe, umożliwiając badanie dynamiki infekcji wewnątrzkomórkowej.
Wnioski
- Dwuwymiarowy model pochodny z organoidów stanowi solidną platformę do badania biologii nabłonka prostaty oraz interakcji między gospodarzem a patogenem.
- Umożliwia on szczegółową analizę dynamiki infekcji i odpowiedzi komórkowych.
- Model ten nadaje się do przyszłych badań nad chorobami prostaty i testowania terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele 2D pochodzące z organoidów prostaty wypełniają krytyczną lukę w badaniach przedklinicznych, umożliwiając bezpośrednią analizę oddziaływań gospodarz-patogen na barierze nabłonkowej. System ten zachowuje różnorodność komórkową oraz funkcję barierową, co zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnym etapie walidacji celów terapeutycznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w badaniach nad infekcjami i chorobami prostaty. Potencjał translacyjny tej platformy sprawia, że stanowi ona zasób wielokrotnego użytku do oceny mechanizmów chorobowych i strategii terapeutycznych w ramach całego portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów odpowiedzi nabłonka na zakażenie uropatogenną Escherichia coli.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów interakcji gospodarz-patogen w kontekście fizjologicznym.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie populacji komórek podstawnych i luminalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w dalszych badaniach nad biologią zakażeń.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny 2D system nabłonkowy do ilościowych analiz infekcji.
- Umożliwia bezpośredni dostęp do powierzchni apikalnej w celu aplikacji związków lub patogenów.
- Wspiera pomiary TEER oraz odczyty immunofluorescencyjne w celu oceny integralności bariery i różnicowania komórek.
- Umożliwia skalowalny przygotowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (high-content screening) czynników modulujących infekcję.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biologią nabłonka istotną dla chorób, co pozwala na tworzenie translacyjnych modeli infekcji oraz chorób prostaty.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów interakcji gospodarz-patogen.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój hipotez terapeutycznych celujących w szlaki infekcji nabłonka.
- Wspiera ocenę kandydackich interwencji w systemie odzwierciedlającym różnorodność komórkową in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten oparty na organoidach model 2D stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a przedklinicznymi badaniami nad infekcjami, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz uzyskiwanie ilościowych wyników w ramach jednolitego schematu pracy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych w odniesieniu do mechanizmów infekcji i odpowiedzi nabłonkowych.
- Przesiew: Umożliwia przeprowadzanie powtarzalnych, ilościowych testów infekcji i funkcji barierowych do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki immunofluorescencji, TEER i cytometrii przepływowej w celu rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Utrzymuje organizację komórkową istotną dla przebiegu choroby, zapewniając ciągłość w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma dla różnorodnych badań nad infekcjami i chorobami prostaty.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii infekcji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy infekcji nabłonka dzięki skalowalnym i powtarzalnym przepływom pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz efektywne pod kątem kapitałowym sortowanie portfela projektów.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację programów dotyczących infekcji i chorób prostaty z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu hodowli organoidów, różnicowania nabłonkowego oraz testów infekcyjnych.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii immunofluorescencyjnej, aparatury do pomiaru TEER oraz cytometrii przepłyewej.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów wysiewania komórek, różnicowania i infekcji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do innych modeli nabłonkowych po optymalizacji protokołu pod kątem specyfiki tkanki.
- Funkcja barierowa oraz różnorodność komórkowa muszą zostać zwalidowane dla każdej partii eksperymentalnej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
