Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen
February 27th, 2026
Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.
Badania te koncentrują się na zrozumieniu, jak patogeny bakterii infekują nabłonek prostaty oraz które interakcje patogenów gospodarzy decydują o wyniku infekcji. Istniejące modele in vitro słabo oddały różnorodność nabłonka prostaty. Model ten zapewnia fizjologicznie istotny system, który odzwierciedla różne typy komórek obecne w tkance.
Na początek poprowadź trójwymiarowe mięśnie prostaty myszy hodowane na kroplachach macierzy zewnątrzkomórkowej w 24-dołkowej płytce. Aspiruj podłoże z pożądanej liczby dołków i dodaj 500 mikrolitrów świeżego medium do każdego dołu. Użycie pipety P 1000 mechanicznie zakłóca kroplę macierzy zewnątrzkomórkowej w każdej dołku.
Zbieraj tę zawiesinę w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów, z maksymalnie dwoma dołkami na probówkę. Dodaj świeże podłoże hodowlane, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów. Delikatnie odwróć probówkę trzy do czterech razy, aby wymieszać i wirować w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aspiruj nadwysoka. Ponownie zawiesz pellet w dwóch mililitrach roztworu enzymatycznego, podgrzej do 37 stopni Celsjusza i inkubuj zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Używając pipety o stężeniu P 1000, mieszaj zawiesinę komórkową co pięć minut podczas inkubacji.
Po inkubacji dodaj świeży podłoże hodowlane, aby uzyskać ostateczną objętość 10 mililitrów. Delikatnie odwróć rurkę trzy do czterech razy, aby wymieszać. Wirówka na 450 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.
Aspiruj supernatant bez zakłócania granulki. Ponownie zawiesz pellet w 300 mikrolitrach pożywki hodowlanej, uzupełnionej inhibitorem skał o stężeniu 10 mikromolów. Za pomocą komory liczącej Neubauera liczą komórki w zawiesie.
Rozcieńcz zawiesinę do stężenia 62 500 komórek na mililitr w pożywce hodowlarskiej z dodatkiem inhibitora skał o stężeniu 10 mikromolowym. Następnie zasiewano 200 mikrolitrów zawiesiny na odwór dla płyty 48-dołkowej oraz 300 mikrolitrów na odwór dla komorowych mikroszkiełek. Inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po jednym dniu sprawdź, czy większość pojedynczych komórek przyczepiła się do powierzchni dwuwymiarowej hodowli. Wymieniaj podłoże co dwa do trzech dni i kontynuuj hodowlę aż do osiągnięcia konfluentu w ciągu siedmiu dni. Aby wywołać różnicowanie i wzbogacać komórki luminalne, należy dodać 10 nanomolów pięcio-dihydrotestosteronu lub DHT do zawiesiny komórkowej podczas zasiewania.
Nasiądź uropatogeniczną odmianę Escherichia coli, czyli UPEC, na płytkę agarową LB z dodatkiem 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Za pomocą sterylnej pętli inokuluj trzy mililitry bulionu LB uzupełnionego o 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny w pojedynczej kolonii bakteryjnej.
Inkubuj hodowlę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Zrób wireks nocnej hodowli bakteryjnej. Zmierz gęstość optyczną hodowli na 600 nanometrów.
Następnie oblicz objętość hodowli potrzebną do uzyskania początkowej gęstości optycznej 0,05 w trzech mililitrach bulionu. Dodaj obliczoną objętość hodowli bakteryjnej do świeżego bulionu LB z dodatkiem ampicyliny. Inkubuj statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Po inkubacji przeprowadź posiewkę bakteryjną w wirze. Zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrów. Oblicz objętość hodowli potrzebną do uzyskania gęstości optycznej jednego.
Wiruj wymaganą objętość w 12 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Aspiruj i odrzucaj supernatant. Ponownie zawiesić granulat bakteryjny w jednym mililitrze primusa i wolnej pożywki do hodowli organoidów bez DHT.
Następnie rozcieńcz zawiesinę pożywką hodowli prostaty myszy, aby uzyskać częstość zakażenia 100. Aspiruj medium hodowlane z przygotowanego modelu organoidalnego. Do każdej dołki płytki z 48 dołkami dodaj 200 mikrolitrów pożywki z bakteriami.
Inkubuj przez godzinę w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Aspiruj bakterie zawierające podłoże z dołków i przemyj je trzy razy świeżym medium hodowlarskim, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Następnie dodaj podłoże o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr gentamycyny i inkubuj przez 30 minut.
Aspiruj medium. Dodaj świeże medium hodowlane, uzupełnione o 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny na pozostały czas infekcji. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby obrazować zakażone komórki po fluorescencyjnym barwieniu i ilościowo określić zakażone komórki za pomocą cytometru przepływowego.
W warunkach kontrolnych, bez dihydrotestosteronu, większość komórek miała cytokeratynę, pięć dodatnich komórek bazalnych, z wyjątkiem kilku wykazujących niską ekspresję luminalną CD 24/8. Suplementacja jednym nanomolarem DHT dała mieszane populacje lumminalne bazalne, choć poziom CD 24A pozostał niski. Zwiększenie DHT do 10 nanomolów sprzyjało różnicowaniu się do komórek luminalnych, jednocześnie utrzymując część komórek podstawnych po siedmiu dniach hodowli.
To koreluje z badaniami ilościowymi, które wykazały spadek cytokeratyny o pięć dodatnich komórek podstawnych oraz wzrost liczby komórek luminalnych z dodatnim wynikiem CD 24A przy wzroście stężenia DHT w czasie. W ciągu zera godzin po infekcji UPEC przylegał do komórek nabłonkowych w dużej liczbie. Po godzinnym leczeniu genamycyną liczba komórek UPEC-dodatnich gwałtownie spadła.
Po 24 godzinach liczba zakażonych komórek była podobna do tej po godzinie. Obrazowanie konfokalne po 24 godzinach wykazało, że bakterie wewnątrzkomórkowe nadal się replikują, tworząc skupiska przypominające wspólnotę. Protokół ten pozwala badaczom badać dynamikę infekcji bakteryjnych oraz interakcje patogenów w modelu zachowującym różnorodność komórek nabłonkowych.
Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do badania różnych chorób prostaty, w tym infekcji, biologii nowotworów oraz testowania potencjalnych związków terapeutycznych.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
