Name: Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj obliczeniowy potok do ilościowej identyfikacji RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Metoda integruje dane o dostępności chromatyny i transkrypcji dla dokładnej analizy aktywności wzmacniaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez fundusz badawczy Chungnam National University [2022-0582-01 (S.-K.K.) oraz 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Korea Południowa. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender (https://biorender.com/).

<ol><li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+as+non-coding+RNA+transcription+units%3A+recent+insights+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives.</a> Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Plank, J. L., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+function%3A+mechanistic+and+genome-wide+insights+come+together%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together.</a> Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).</li>
<li>Alexander, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brg1+modulates+enhancer+activation+in+mesoderm+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment.</a> Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+enhancer+repertoires+drives+lineage+and+stage-specific+transcription+during+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis.</a> Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+characterization+of+enhancers+across+10+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues.</a> Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why.</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Barakat, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+the+enhancer+repertoire+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).</li>
<li>Kim, T. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).</li>
<li>Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+active+enhancers+through+bidirectional+expression+of+short+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts.</a> Genome Biol. 12 (11), R113(2011).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gorbovytska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+stimulate+Pol+II+pause+release+by+harnessing+multivalent+interactions+to+NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF.</a> Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).</li>
<li>Mousavi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eRNAs+promote+transcription+by+establishing+chromatin+accessibility+at+defined+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci.</a> Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).</li>
<li>Hsieh, C. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+participate+in+androgen+receptor-driven+looping+that+selectively+enhances+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).</li>
<li>Schaukowitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNA+facilitates+NELF+release+from+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes.</a> Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).</li>
<li>Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transcribed+from+a+distal+enhancer+is+required+for+activating+the+chromatin+at+the+promoter+of+the+gonadotropin+%CE%B1-subunit+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), eaar3958(2018).</li>
<li>Nair, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+ligand-activated+enhancers+licenses+cooperative+chromosomal+enhancer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly.</a> Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).</li>
<li>Lee, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNA+m6A+methylation+facilitates+transcriptional+condensate+formation+and+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation.</a> Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+in+transcriptional+regulation%3A+recent+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).</li>
<li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-specific+intragenic+enhancer+RNA+essential+for+NSUN2-mediated+stem+cell+fate+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation.</a> Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).</li>
<li>Tuvikene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+enhancer+region+governs+transcript-specific+Bdnf+expression+in+rodent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons.</a> Elife. 10, e65161(2021).</li>
<li>Cheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+enhancers+of+the+human+SNCA+gene+predominantly+regulate+its+expression+in+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo.</a> Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).</li>
<li>Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+collision+interrupts+convergent+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription.</a> Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).</li>
<li>Cinghu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragenic+enhancers+attenuate+host+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intragenic enhancers attenuate host gene expression.</a> Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).</li>
<li>Bressin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+nascent+transcript+sequencing+reveals+BRD4-specific+control+of+widespread+enhancer+and+target+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription.</a> Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introductory+analysis+and+validation+of+CUT%26RUN+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data.</a> J Vis Exp. (214), e67359(2024).</li>
<li>How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. 
 <a target="_blank" href="https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install">https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install</a> (2025).</li>
<li>Terminal user guide. , Apple. 
 <a target="_blank" href="https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac">https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac</a> (2025).</li>
<li>How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. 
 <a target="_blank" href="https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/">https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/</a> (2025).</li>
<li>Simon, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimon%2C+A+%22FastQC%3A+a+quality+control+tool+for+high+throughput+sequence+data%22">FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data</a>. Version 0.10.1, (2010).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrueger%2C+F+%22Babraham+Inst%22">Babraham Inst</a>. , (2015).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 3(2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+alignment%2Fmap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The sequence alignment/map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sambamba%3A+fast+processing+of+NGS+alignment+formats%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sambamba: fast processing of NGS alignment formats.</a> Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+blacklist%3A+identification+of+problematic+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome.</a> Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: elegant graphics for data analysis</a>. , Springer. 189-201 (2016).</li>
<li>Wilke, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cowplot%3A+streamlined+plot+theme+and+plot+annotations+for+ggplot2%5BTitle%5D)+AND+%22CRAN+Contrib.+Packages%22%5BJournal%5D)">cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2.</a> CRAN Contrib. Packages. , (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+signatures+distinguish+multiple+classes+of+enhancers+with+distinct+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions.</a> Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).</li>
<li>Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+at+the+Nanog+locus+differentially+regulate+neighboring+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes.</a> Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misuse+of+RPKM+or+TPM+normalization+when+comparing+across+samples+and+sequencing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols.</a> RNA. 26 (8), 903-909 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Po odkryciu transkryptów pochodzących z wzmacniaczy13, 14, 15, dokładne ilościowe określenie eRNA pozostaje poważnym wyzwaniem, szczególnie w kontekstach intragenowych, gdzie eRNA często nakładają się na transkrypcje genów gospodarza. To nakładanie się komplikuje przypisanie nici i atrybucję sygnału, utrudniając odróżnienie prawdziwej transkrypcji wzmacniającej od ekspresji genów tła 13,25,26,30.</su...

Wzmacniacze to elementy DNA cis-regulacyjne, które kontrolują transkrypcję docelowych genów poprzez organizowanie pętli chromatyny i rekrutację mechanizmów transkrypcyjnych 1,2,3. Ich specyficzna aktywność tkankowa umożliwia precyzyjną regulację podczas rozwoju i zaangażowanie linii genezji 4,5,6,7,8. Aktywne wzmacniacze wykazują charakterystyczne cechy chromatyny, takie jak H3K4me1 (histon H3 lizyno-4 mono-metylacja) i H3K27ac (acetylacja histonu H3 Lizyny 27) i zwykle występują w obszarach nadwrażliwych na DNazę I, które oznaczają otwartą chromatynę 9,10,11,12. Te cechy umożliwiają czynnikom transkrypcyjnym i polimerazie RNA II dostęp do DNA, inicjując początkową transkrypcję w locusach wzmacniających 13,14,15,16.
Ten sekwencyjny proces biologiczny wytwarza transkrypcje pochodzące z wzmacniaczy, zwane eRNA, które są dwukierunkowe, niekodujące i zazwyczaj niepoliadenylowane RNA 13,14,15,16. eRNA pełnią rolę markerów aktywności wzmacniającej i funkcjonują jako efektorysame w sobie 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Sprzyja one produktywnej elongacji poprzez uwalnianie Ujemnego Czynnika Elongacyjnego (NELF) z wstrzymanej polimerazy RNA II16,19 oraz pomagają stabilizować pętle wzmacniająco-promotorowe 17,18,20. Wspierają również powstawanie kondensatów transkrypcyjnych, potencjalnie poprzez modyfikację m6A(N 6-metyladenozyny) 21,22,23.
Niemniej jednak funkcja transkrypcji wzmacniacza wewnątrzgenowego, inicjowanej z elementów regulacyjnych w ciałach genów, pozostaje kontrowersyjna. Niektóre badania informują, że eRNA pochodzące z downętrznych wzmacniaczy zwiększają ekspresję genu gospodarza25, potencjalnie poprzez promowanie uwalniania NELF i wydłużenia produktywności zależnej od bodźca 26,27. Dla porównania, inne badania sugerują, że ta transkrypcja może hamować geny gospodarza poprzez kolizje polimerazy RNA II lub interferencję transkrypcyjną, prowadząc do osłabienia lub przedwczesnego zakończenia28,29. Te sprzeczne obserwacje, wraz z podwójną rolą eRNA jako markerów i regulatorów, podkreślają potrzebę starannej ilościowej analizy i funkcjonalnej sekcji. Jednak pomiar intragenowych eRNA jest trudny, ponieważ często nakładają się one na transkrypcje gospodarza zmysłowego 13,25,26,30. Wyzwanie nasila się, gdy wzmacniacze znajdują się w regionach z zagnieżdżonymi genami lub nakładającą się transkrypcją na obu niciach, co zaciemnia specyficzne sygnały wzmacniacze.
Aby pokonać te wyzwania, opracowaliśmy pipeline bioinformatyczny do wykrywania, ilościowego określenia i wizualizacji transkrypcji związanych z wzmacniaczami, ze szczególnym uwzględnieniem regionów wewnątrzgenowych. Pipeline integruje test chromatyny dostępnej do transpozazy z wykorzystaniem sekwencjonowania (ATAC-seq), sekwencjonowania immunoprecipitacji chromatyny (ChIP-seq), sekwencjonowania globalnego run-on (GRO-seq) oraz adnotacji genomowych, aby osiągnąć rozdzielczość na poziomie wzmacniacza nawet w złożonych kontekstach genomowych.
Potok składa się z czterech głównych etapów: (i) wstępnego przetwarzania, wyrównania, wywoływania szczytów oraz generowania sygnału31; (ii) identyfikację wzmacniaczy za pomocą cech chromatyny; (iii) przypisywanie orientacji nici, szczególnie wewnątrz ciał genów; oraz (iv) ilościowość i wizualizację początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Te ramy są szczególnie przydatne dla systemów z danymi sekwencjonowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak analizowane w tym badaniu embrionalne komórki macierzyste myszy, a także mogą być rozszerzane na inne organizmy, gdy dostępne są odpowiednie zbiory danych. Umożliwiając specyficzną ilościową ilościowość w sytuacjach, gdy istniejące procesy zawodzą, ten workflow oferuje praktyczne narzędzie do benchmarkingu i badania transkrypcji eRNA wewnątrzgenowej w różnych kontekstach genomowych.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia łóżkowe</td><td>Laboratorium Quinlan, Uniwersytet Utah&nbsp;</td><td>v2.31.1</td><td>Narzędzia do edycji plików BED</td></tr><tr><td>mucha2</td><td>Laboratorium Langmead, Uniwersytet Johns Hopkins</td><td>v2.5.4</td><td>Wielowątkowy aligner do mapowania odczytów na genom referencyjny</td></tr><tr><td>Krowia</td><td>Laboratorium Wilke, Uniwersytet Teksasu</td><td>v1.2.0</td><td>Narzędzia do łączenia i wyrównywania figurek opartych na ggplot2</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td>Laboratorium Nauki dla Życia, Uniwersytet Sztokholmski</td><td>v5.1</td><td>Adapter i trymer do ogona z poliestrowanego A/G</td></tr><tr><td>deeptools</td><td>Zakład Bioinformatyczny, Instytut Maxa Plancka</td><td>v3.5.6</td><td>Narzędzie do liczenia odczytów do ilościowego określania odczytów w określonych regionach genomowych</td></tr><tr><td>fastqc</td><td>Bioinformatyka Babrahama, Instytut Babrahama</td><td>v0.12.1</td><td>Kontrola jakości odczytów sekwencjonowania</td></tr><tr><td>featureCounts (subread)</td><td>Shi Lab, Uniwersytet Monash</td><td>v2.1.1</td><td>Surowe narzędzia do liczenia odczytów dla określonych regionów genomowych</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Laboratorium Bennera, Uniwersytet Kalifornijski San Diego (UCSD)</td><td>v5.1</td><td>Zestaw narzędzi do analizy ChIP-seq, ATAC-seq oraz RNA w formie początku; obejmuje tworzenie katalogów tagów i profilowanie sygnałów</td></tr><tr><td>macs3</td><td>Inicjatywa Chana Zuckerberga</td><td>v3.0.3</td><td>Szczytowe wywoływanie dla zbiorów danych ChIP-seq i ATAC-seq</td></tr><tr><td>pigz</td><td>.</td><td>v2.8</td><td>Narzędzie do kompresji wielowątkowej do generowania plików skompresowanych gzip</td></tr><tr><td>sambamba</td><td>Uniwersytet Petersburski</td><td>v1.0.1</td><td>Wielowątkowy zestaw narzędzi do przetwarzania plików SAM/BAM</td></tr><tr><td>samtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>v1.22.1</td><td>Narzędzia do przetwarzania i manipulacji plikami SAM/BAM</td></tr><tr><td>-Tools</td><td>Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI)</td><td>v3.2.0</td><td>Do pobierania plików SRR z bazy danych NCBI</td></tr><tr><td>Tidyverse</td><td>Posit PBC</td><td>v2.0.0</td><td>Kolekcja pakietów R do manipulacji i wizualizacji danych</td></tr><tr><td>Trim-Galore</td><td>Altos Labs, Cambridge Institute of Science</td><td>v0.6.10</td><td>Przycinanie podstaw z adapterem i niskiej jakości z użyciem wielogwintowania</td></tr><tr><td>Ubuntu 20.04</td><td></td><td></td><td>Opracowywanie i testowanie pipeline'u</td></tr><tr><td>UCSC-Bedgraphtobigwig&nbsp;</td><td>Kent Lab, Uniwersytet Kalifornijski Santa Cruze</td><td>v482</td><td>Narzędzia do generowania ścieżek sygnałowych bigWig</td></tr></tbody></table>

tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji rna intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

A Computational Pipeline for Intergenic/Intragenic Enhancer RNA Quantification in Mouse Embryonic Stem Cells

Podstawowe elementy cis-regulacyjne, zwane wzmacniaczami, odgrywają kluczową rolę w umożliwianiu precyzyjnej regulacji transkrypcji genów docelowych kontrolujących różnorodne funkcje komórkowe i procesy rozwojowe. Wzmacniacze te są często transkrybowane w obu kierunkach, tworząc długie, niekodujące transkrypcje zwane enhancer RNA (eRNA). Ekspresja eRNA jest ściśle powiązana z aktywnymi cechami chromatyny, takimi jak rekrutacja H3K27ac i współaktywatorów, i funkcjonalnie przyczynia się do transkrypcyjnej aktywacji genów docelowych. Niemniej jednak wykrywanie i ilościowe określenie eRNA pozostają trudne, zwłaszcza gdy pokrywają się one z transkrypcją genu gospodarza. Aby temu zaradzić, przedstawiamy ustandaryzowany, przyjazny dla użytkownika workflow obliczeniowy do analizy transkrypcji wzmacniającej na podstawie początkujących danych sekwencjonowania RNA. Protokół prowadzi użytkowników przez wstępne przetwarzanie danych, mapowanie odczytu i kontrolę jakości, a następnie kwantyfikację transkrypcji związanej z wzmacniaczami specyficzną dla pasma, z dedykowanymi procedurami dla wzmacniaczy wewnątrzgenowych, gdy przypisanie sygnału jest złożone. Moduły wizualizacyjne umożliwiają jasną inspekcję aktywności wzmacniaczy w kontekstach genomowych, a wbudowane opcje wspierają analizy zarówno wzmacniaczy intergenowych, jak i wewnątrzgenowych. Zaprojektowany dla badaczy z ograniczoną wiedzą w bioinformatyce, ten workflow zapewnia praktyczne ramy do spójnych, powtarzalnych i skalowalnych badań transkrypcji wzmacniaczej, ułatwiając szersze zastosowanie biologii wzmacniającej w różnych systemach.

Schematyczny workflow dla pipeline'u kwantyfikacji transkrypcji wzmacniacza Publicznie dostępne zbiory danych ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq oraz GRO-seq (Tabela 1) zostały przetworzone za pomocą standaryzowanego potoku zaprojektowanego głównie do walidacji. Przycinanie adapterów i filtrowanie jakości wykonano za pomocą Trim Galore i Cutadapt, a następnie wyrównano do genomu referencyjnego mm10 za pomocą Bowtie2 (szczegółowo opisane w kroku prot...

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Core cis-regulatory elements known as enhancers play a central role in enabling precise transcriptional regulation of target genes that control diverse ...

Nasza grupa bada epigenetykę wzmacniaczy oraz epitranskryptomikę, koncentrując się na opracowaniu dokładnej metody ilościowej identyfikacji RNA wzmacniających jako wskaźników aktywacji wzmacniacza. Ponieważ wzmacniacze wewnątrzgenowe były z transkrypcjami gospodarza, rozróżnienie sygnałów wzmacniaczy DER i ich precyzyjne określenie ilościowe jest trudne. Aby zacząć, otwórz terminal i wpisz polecenie przygotowania niezbędnych plików i referencji do identyfikacji wzmacniacza.Wpisz polecenie w terminalu, aby wejść do katalogu roboczego. Następnie wykonaj polecenie, które kopiuje skrypty identyfikacji wzmacniacza do bieżącego katalogu. Następnie wykonaj odpowiednie polecenie, aby wygenerować pliki BED dla regionów promotorów, ciał genów i genów kodujących białka, używając adnotacji kodu gen.Przygotowanie plików ATAC-seq i histon ChIP-seq do identyfikacji wzmacniacza. Wprowadź odpowiednie polecenie wstępnego przetwarzania w terminalu. Następnie wykonaj polecenie definiujące i klasyfikujące wzmacniacze na podstawie danych o szczytach chromatyny.Wpisz polecenie przypisania tymczasowej informacji o nici do pliku BED wzmacniacza intergenowego. Następnie wprowadź polecenie, aby określić właściwy kierunek nici dla wzmacniaczy międzygenowych, które nakładają się na geny znajdujące się na obu niciach. Następnie oblicz specyficzny RPKM dla genów nakładających się na siebie wzmacniacza na tej samej nici.Następnie wprowadź polecenie finalizacji przypisania nici dla wzmacniaczy intergenowych. Przypisz informacje o końcowych nici wszystkim wzmacniaczom międzygenowym oraz odpowiadającym im regionom szczytowym. Wpisz polecenie w terminalu, aby przejść do katalogu głównego potoku.Następnie użyj odpowiedniego polecenia, aby skopiować skrypt do przygotowania analizy dalszej w kolejnym etapie (downstream). Za pomocą odpowiedniego polecenia przygotuj wszystkie niezbędne pliki do agregacji wzmacniaczy, przetwarzania sygnałów GRO-seq oraz kwantyfikacji RNA wzmacniającej. Następnie wpisz skrypt, aby wejść do katalogu roboczego, a następnie skopiuj niezbędne skrypty do dalszej analizy. Tworzenie wykresów agregacji, pokazujących wzorce sygnałów chromatyny wokół każdego typu szczytu wzmacniacza.Wpisz odpowiednie polecenie w terminalu. Po powrocie promptu wprowadź polecenie do ilościowego określenia poziomu ekspresji RNA wzmacniającego z GRO-seq za pomocą liczby cech. Na koniec uruchom skrypt, aby zwizualizować i porównać poziomy ekspresji RNA wzmacniającego między grupami wzmacniaczy, korzystając R.In zbioru danych GRO-seq.Ogony polinukleotydów były obecne przed przycięciem i pomyślnie usunięte po zastosowaniu parametrów przycięcia upośledzonych na końcu zestawów danych ATAC-seq. Sekwencje adapterów NextEra zostały wykryte w obu czerwonych parach przed przycięciem i usunięte po wstępnym opracowaniu zestawów danych ChIP-seq dla acetylacji H3K27, wykazując minimalne zanieczyszczenie adaptera, wymagając jedynie domyślnego przycięcia. Filtrowanie danych ATAC-seq dało 71 165 niemotorycznych regionów otwartej chromatyny, w tym 47 317 regionów wzmacniaczy, z czego 23 147 sklasyfikowano jako aktywne wzmacniacze, a 24 170 jako nieaktywne wzmacniacze ze względu na nakładanie się z znakami histonowymi, spośród wszystkich regionów wzmacniających 45,2% było intergenowych, a 54,8% śródgenowych. Ten rozkład był podobny między kategoriami nieaktywnych i aktywnych wzmacniaczy.Wzmacniacz intergenowy umieszczony przed genem NENO wykazał silne wzbogacenie sygnałów ATAC-seq, monometylacji H3K4, acetylacji H3K27 oraz sygnałów GRO-seq. Wzmacniacz wewnątrzgenowy w pobliżu genu CHD2 wykazywał podobne cechy chromatyny i transkrypcji jak wzmacniacz NENOG, z wyraźnymi sygnałami we wszystkich czterech zbiorach danych. Wykresy agregacyjne wykazały, że aktywne wzmacniacze miały skoordynowane wzbogacenie sygnałów acetylacji ATAC-seq, H3K4 monometylu i H3K27.Podczas gdy wzmacniacze nieaktywne nie wzbogacały wzbogacenia acetylacji H3K27, zachowywały silne sygnały monometylowe ATAC-seq i H3K4. Aktywne wzmacniacze wykazały istotnie wyższą transkrypcję pochodzącą z GRO-seq niż nieaktywne wzmacniacze zarówno w regionach międzygenowych, jak i wewnątrzgenowych. Składamy te trendowe potoki obliczeniowe eRNA, zweryfikowane przez transkrypcję zależną od aktywności w kontekście intergenowym lub wewnątrzgenowym.Zajmujemy się DER w ustandaryzowanej dostępnej ilościowej ilościowości eRNA, szczególnie dla wzmacniaczy intragenowych zakłóconych przez genom gospodarza. Zrewidujemy samodzielną identyfikację, oddzielimy transkrypcje operacyjne zarówno od trendów, jak i od analizy benchmarków w zestawieniach genomu, protokołach eksperymentalnych i typach komórek.

a-computational-pipeline-for-intergenicintragenic-enhancer-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj obliczeniowy potok do ilościowej identyfikacji RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Metoda integruje dane o dostępności chromatyny i transkrypcji dla dokładnej analizy aktywności wzmacniaczy.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów