Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Nasza grupa bada epigenetykę wzmacniaczy oraz epitranskryptomikę, koncentrując się na opracowaniu dokładnej metody ilościowej identyfikacji RNA wzmacniających jako wskaźników aktywacji wzmacniacza. Ponieważ wzmacniacze wewnątrzgenowe były z transkrypcjami gospodarza, rozróżnienie sygnałów wzmacniaczy DER i ich precyzyjne określenie ilościowe jest trudne. Aby zacząć, otwórz terminal i wpisz polecenie przygotowania niezbędnych plików i referencji do identyfikacji wzmacniacza.

Wpisz polecenie w terminalu, aby wejść do katalogu roboczego. Następnie wykonaj polecenie, które kopiuje skrypty identyfikacji wzmacniacza do bieżącego katalogu. Następnie wykonaj odpowiednie polecenie, aby wygenerować pliki BED dla regionów promotorów, ciał genów i genów kodujących białka, używając adnotacji kodu gen.

Przygotowanie plików ATAC-seq i histon ChIP-seq do identyfikacji wzmacniacza. Wprowadź odpowiednie polecenie wstępnego przetwarzania w terminalu. Następnie wykonaj polecenie definiujące i klasyfikujące wzmacniacze na podstawie danych o szczytach chromatyny.

Wpisz polecenie przypisania tymczasowej informacji o nici do pliku BED wzmacniacza intergenowego. Następnie wprowadź polecenie, aby określić właściwy kierunek nici dla wzmacniaczy międzygenowych, które nakładają się na geny znajdujące się na obu niciach. Następnie oblicz specyficzny RPKM dla genów nakładających się na siebie wzmacniacza na tej samej nici.

Następnie wprowadź polecenie finalizacji przypisania nici dla wzmacniaczy intergenowych. Przypisz informacje o końcowych nici wszystkim wzmacniaczom międzygenowym oraz odpowiadającym im regionom szczytowym. Wpisz polecenie w terminalu, aby przejść do katalogu głównego potoku.

Następnie użyj odpowiedniego polecenia, aby skopiować skrypt do przygotowania analizy dalszej w kolejnym etapie (downstream). Za pomocą odpowiedniego polecenia przygotuj wszystkie niezbędne pliki do agregacji wzmacniaczy, przetwarzania sygnałów GRO-seq oraz kwantyfikacji RNA wzmacniającej. Następnie wpisz skrypt, aby wejść do katalogu roboczego, a następnie skopiuj niezbędne skrypty do dalszej analizy. Tworzenie wykresów agregacji, pokazujących wzorce sygnałów chromatyny wokół każdego typu szczytu wzmacniacza.

Wpisz odpowiednie polecenie w terminalu. Po powrocie promptu wprowadź polecenie do ilościowego określenia poziomu ekspresji RNA wzmacniającego z GRO-seq za pomocą liczby cech. Na koniec uruchom skrypt, aby zwizualizować i porównać poziomy ekspresji RNA wzmacniającego między grupami wzmacniaczy, korzystając R.In zbioru danych GRO-seq.

Ogony polinukleotydów były obecne przed przycięciem i pomyślnie usunięte po zastosowaniu parametrów przycięcia upośledzonych na końcu zestawów danych ATAC-seq. Sekwencje adapterów NextEra zostały wykryte w obu czerwonych parach przed przycięciem i usunięte po wstępnym opracowaniu zestawów danych ChIP-seq dla acetylacji H3K27, wykazując minimalne zanieczyszczenie adaptera, wymagając jedynie domyślnego przycięcia. Filtrowanie danych ATAC-seq dało 71 165 niemotorycznych regionów otwartej chromatyny, w tym 47 317 regionów wzmacniaczy, z czego 23 147 sklasyfikowano jako aktywne wzmacniacze, a 24 170 jako nieaktywne wzmacniacze ze względu na nakładanie się z znakami histonowymi, spośród wszystkich regionów wzmacniających 45,2% było intergenowych, a 54,8% śródgenowych. Ten rozkład był podobny między kategoriami nieaktywnych i aktywnych wzmacniaczy.

Wzmacniacz intergenowy umieszczony przed genem NENO wykazał silne wzbogacenie sygnałów ATAC-seq, monometylacji H3K4, acetylacji H3K27 oraz sygnałów GRO-seq. Wzmacniacz wewnątrzgenowy w pobliżu genu CHD2 wykazywał podobne cechy chromatyny i transkrypcji jak wzmacniacz NENOG, z wyraźnymi sygnałami we wszystkich czterech zbiorach danych. Wykresy agregacyjne wykazały, że aktywne wzmacniacze miały skoordynowane wzbogacenie sygnałów acetylacji ATAC-seq, H3K4 monometylu i H3K27.

Podczas gdy wzmacniacze nieaktywne nie wzbogacały wzbogacenia acetylacji H3K27, zachowywały silne sygnały monometylowe ATAC-seq i H3K4. Aktywne wzmacniacze wykazały istotnie wyższą transkrypcję pochodzącą z GRO-seq niż nieaktywne wzmacniacze zarówno w regionach międzygenowych, jak i wewnątrzgenowych. Składamy te trendowe potoki obliczeniowe eRNA, zweryfikowane przez transkrypcję zależną od aktywności w kontekście intergenowym lub wewnątrzgenowym.

Zajmujemy się DER w ustandaryzowanej dostępnej ilościowej ilościowości eRNA, szczególnie dla wzmacniaczy intragenowych zakłóconych przez genom gospodarza. Zrewidujemy samodzielną identyfikację, oddzielimy transkrypcje operacyjne zarówno od trendów, jak i od analizy benchmarków w zestawieniach genomu, protokołach eksperymentalnych i typach komórek.