Badanie urządzenia LED z niebieskim światłem w celu tłumienia patogenów ran z wykorzystaniem syntetycznego modelu skóry na bazie kolagenu

Nasze badania analizują, jak światło niebieskie o średnicy 405 nanometrów może bezpiecznie tłumić patogeny ran, wykorzystując syntetyczny model skóry na bazie kolagenu. Większość badań wykorzystuje kultury bulionu, płytki agarowe lub modele zwierzęce. Wprowadzamy realistyczną, powtarzalną platformę naśladowniczą skórę do testów fototerapeutycznych.

Na początek należy zdobyć pożądane szczepy bakterii i grzybów. Zbierz pojedynczą izolowaną kolonię i aseptycznie zaszczep ją w pięciu mililitrach tryptycznego bulionu sojowego. Gdy wszystkie szczepy zostaną zaszczepione, inkubuj kultury.

Po upływie pożądanego czasu inkubacji dostosuj mętność za pomocą sterylnego PBS do standardu 0,5 McFarlanda dla testów antybakteryjnych. Następnie weź wcześniej przygotowane, nawilżone syntetyczne fragmenty skóry na bazie kolagenu i zaszczep każdą sekcję 100 mikrolitrami zawiesiny mikroorganizmów. Używając sterylnego rozprowadzacza, rozłóż zawieszenie równomiernie na powierzchni.

Następnie susz zaszczepione próbki na powietrzu w sterylnej komorze w warunkach otoczenia. Przydziel próbki do trzech grup obsługiwań dla różnej ekspozycji na światło. W przypadku napromieniowania zamontuj niebieskie światło LED na aluminiowym radiatorze.

Użyj skalibrowanego optycznego miernika mocy do pomiaru naświetlenia dokładnie na płaszczyźnie obróbki. Dostosuj wysokość sondy, aby uwzględnić grubość czujnika. Teraz dostosuj zasięg promieniowania diody LED, aby ustandaryzować naświetlenie robocze do 30 miliwatów na centymetr kwadratowy.

Umieść zaszczepione próbki skóry z grupy B aseptycznie w sterylnych szalkach Petriego bez pokrywek. Umieść naczynia bezpośrednio pod diodą LED niebieskiego światła i naświetlaj przez 15 minut, aby uzyskać docelową płynność 27 dżali na centymetr kwadratowy. Podobnie napromieniuj grupę C pod światłem UVC przez dwie minuty, aby osiągnąć docelową płynność 3,6 dżuli na centymetr kwadratowy.

Po napromieniowaniu przenieś obrobioną syntetyczną próbkę skóry do sterylnej rurki o pojemności 15 mililitrów PBS o pH 7,4 i delikatnie ją zawiruj, aby usunąć mikroby przylegające do powierzchni. Teraz przygotuj dziesięciokrotnie seryjne rozcieńczenia zawieszenia. Na płytki agarowe nałóż 100 mikrolitrów wybranych rozcieńczeń i inkubuj płytki.

Po zakończeniu okresu inkubacji policz liczbę kolonii i zapisz liczbę jednostek tworzących kolonie. Oblicz redukcję mikroorganizmów na podstawie przedstawionych równań. Aby zasymulować ekspozycję na powietrze nosokomia, użyj spersonalizowanej komory aerozoli akrylowej w kontrolowanych warunkach środowiskowych.

Umieść sterylne płytki agarowe wewnątrz komory, aby monitorować aktywność opadań drobnoustrojów. Następnie umieść sterylne próbki skóry wewnątrz komory. Za pomocą nebulizatora rozpyl dwa mililitry zawiesiny mikroorganizmów do komory i wystaw próbki na ciągłe niebieskie światło o mocy 10 mikrowatów na centymetr kwadratowy z odległości 20 centymetrów przez 30 minut.

Dla sterowania powtarzać identyczne warunki komory z wyłączonym urządzeniem z niebieskim światłem. Ilościowo określ opłacalne liczby z próbek za pomocą standardowej analizy liczby płyt. Do analizy FTIR kup syntetyczne próbki skóry i nawilżaj je zgodnie z zaleceniami producenta.

Podziel nawodnione próbki na cztery zestawy na sterylnej powierzchni. Naświetl dwa zestawy próbek na niebieskie światło o średnicy 405 nanometrów o natężeniu 30 miliwatów na centymetr kwadratowy. Naświetlaj jeden zestaw na 15 minut, a drugi na 60 minut.

Podobnie, naświetl dwa zestawy próbek na światło UVC o średnicy 265 nanometrów o natężeniu trzech miliwatów na centymetr kwadratowy, z jednym zestawem naświetlonym przez 15 minut, a drugim przez 60 minut. Po napromieniowaniu delikatnie osusz próbki, aby usunąć wilgoć z powierzchni. Analizuj próbki za pomocą spektroskopii FTIR w celu oceny zmian chemicznych i strukturalnych.

Konfiguruj instrument FTIR w trybie ATR i przygotuj powierzchnię kryształu do umieszczenia próbki. Umieść próbkę na krysztale ATR dla uzyskania spektralnego. Wykonaj bezpośrednie porównania spektralne między nieobrobionymi próbkami kontrolnymi a napromieniowanymi.

Następnie użyj nieprzetworzonej próbki kontrolnej jako punktu odniesienia i zeskanuj napromieniowane próbki, aby uzyskać podstawowe odjęte widma. Urządzenie LED z niebieskim światłem wykazało znaczącą skuteczność antybakteryjną przeciwko wszystkim testowanym patogenom ran na modelach syntetycznych skóry. Średnie redukcje liczby logów ujawniają różnice podatności zależne od gatunku, przy czym Klebsiella pneumoniae wykazuje największą wrażliwość na niebieskie światło, a Staphylococcus aureus stosunkowo niższy, choć nadal istotny spadek.

Napromieniowanie UVC pozwoliło na wyższe redukcje mikrobiologicznych we wszystkich badanych gatunkach. Promieniowanie niebieskim światłem i promieniowaniem UVC wykazało szerokospektralną aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko klinicznie istotnym patogenom bakteryjnym, w tym Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus oraz Candida albicans. Ekspozycja na niebieskie światło spowodowała zależne od czasu zmniejszenie liczby wszystkich trzech patogenów ran, przy czym Escherichia coli i Candida albicans szybko uległy inaktywacji, a Staphylococcus aureus wykazywał wolniejszy postępujący spadek.

Skuteczność niebieskiego światła oceniano dalej w symulowanych warunkach zanieczyszczenia powietrznego. Ciągła ekspozycja znacząco zmniejszyła osadzanie się mikroorganizmów na syntetycznych powierzchniach skóry w porównaniu do nieleczonej kontroli dla każdego badanego gatunku. Widma ATR-FTIR skorygowane na poziomie bazowym wskazały, że obróbka UVC zmniejszała intensywność pików amidowych i zwiększała drgania rozciągające węgiel-tlen, odzwierciedlając rozkład kolagenu.

Dla porównania, ekspozycja na niebieskie światło nie wywołała istotnych zmian spektralnych ani chemicznych. Metoda ta ocenia źródła światła fototerapeutycznego poprzez testowanie skuteczności antybakteryjnej, jednocześnie zachowując integralność kolagenu i bezpieczeństwo na powierzchniach przypominających skórę. Kluczowym wyzwaniem w tym protokole jest utrzymanie jednolitego naświetlenia oraz precyzyjna kontrola płynności źródeł światła, aby zapewnić powtarzalne efekty antybakteryjne.

Protokół ten można rozszerzyć na testy biofilmu, analizę stresu oksydacyjnego, optymalizację urządzeń świetlnych nowej generacji oraz badania podobnych nowych interwencji terapeutycznych.