Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania
19 grudnia 2025
Protokół ten przedstawia prostą technikę mikroaspiracji izolującą żywotne komórki somatyczne (SC) z krioprezerwacji nasienia koń. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, ta technika unika długotrwałych hodowli in vitro i pozwala na natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu komórek somatycznych.
Naszym celem jest wykazanie, że komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia mogą być przydatne do odzyskiwania osobników o wysokiej wartości genetycznej. Naszym obecnym wyzwaniem jest możliwość wyboru komórek somatycznych z nienaruszonym diploidalnym DNA, które zostaną użyte jako dawca jądra. Na początek usuń słomki z nasieniem końskich z zbiornika z ciekłym azotem.
Wystawiaj je na działanie powietrza na 10 sekund i rozmrażaj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Weź próbkę 250-mikrolitrowego rozmrożonego nasienia. Rozcieńcz go jednym mililitrem suplementowanego medium DMEM-F12.
Inkubuj mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pipetą wydziel 25 mikrolitrów z inkubowanego rozcieńczenia do rurki i rozcieńcz je w 975 mikrolitrach DPBS uzupełnionym o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr poliwinylowym alkoholem lub poliwinylowym pirolidonem. Delikatnie wymieszaj zawieszenie.
Utrzymuj rozcieńczoną mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały proces pobierania komórek. Umieść pokrywkę z rozcieńczonym nasieniem końskiego na podłodze mikroskopu, aby przygotować się do pobierania komórek somatycznych. Wybierz mikropipetę o odpowiedniej średnicy do zbierania komórek somatycznych i podłącz ją do mechanicznego systemu aspiracji.
Ostrożnie włóż mikropipetę do mikrokropli i wyrównaj ją z podstawą pokrywki naczynia. Gdy pipeta zasysa pożywkę hodowlową, rozpocznij indywidualne wychwytywanie komórek somatycznych. Skup się na dole mikrokroplu, gdzie widoczne są różne morfologie komórek.
Umieść końcówkę mikropipety obok każdej komórki somatycznej i aspiruj pod ciśnieniem ujemnym. Zbieraj komórki okrążone i wydłużone, niezależnie od rozmiaru. Po zebraniu 10 komórek umieść je w mikrokropli o pojemności 10 mikrolitrów umieszczonej na górnej powierzchni pokrywki naczynia.
Zachowaj wszystkie zebrane komórki somatyczne w tej mikrokropli przez cały proces pobierania. Po zebraniu pożądanej liczby komórek somatycznych wykonaj prosty zabieg mycia z użyciem mikrokropli do usunięcia plemników, zanieczyszczeń i zanieczyszczeń drobnoustrojów. Używając drugiej pokrywki naczynia, wykonaj sekwencyjne, trzystopniowe mycie komórek somatycznych.
Użyj mikropipety, aby przenieść komórki somatyczne do pierwszej kropli i pozwól im się osiedlić przez trzy do pięciu minut. Przenieś komórki z pierwszej kropli do drugiej według tej samej procedury. Powtórz transfer jeszcze raz i umieść komórki somatyczne w trzeciej kropli.
Na koniec złóż izolowane komórki somatyczne w przygotowanej mikrokropli przeznaczonej do transferu jądra komórek somatycznych. Technika mikroaspiracji skutecznie odzyskała komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia koń, z tempem wychwytywania od 317,7 do 424,7 komórek na godzinę u trzech ogierów. Ogier numer 3 wykazuje najwyższy plon.
Zidentyfikowano pięć odrębnych typów komórek somatycznych na podstawie rozmiaru i morfologii. Zidentyfikowaliśmy populację komórek somatycznych, które różnią się morfologią i żywotnością w kriokonserwowanym nasieniu końców, które może być przydatne jako dawca jądrowe. Komórki można dobierać na podstawie ich morfologii, a procedura nie wymaga ustanowienia pierwotnej hodowli.
Skupimy się na poprawie żywotności tych komórek po nasieniu końskiego nasienia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia technikę mikroaspiracji służącą do izolacji żywych komórek somatycznych z kriokonserwowanego nasienia konia. Metoda ta pozwala uniknąć długotrwałych hodowli in vitro oraz kontaminacji plemnikami, co umożliwia natychmiastowe wykorzystanie komórek w klonowaniu z komórek somatycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Komórki somatyczne mogą być pozyskiwane z kriokonserwowanego nasienia koni.
- Izolacja żywych komórek somatycznych jest kluczowa dla celów klonowania.
- Tradycyjne metody często wymagają długiego czasu hodowli.
- Zanieczyszczenie plemnikami może utrudniać proces klonowania.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki izolacji komórek somatycznych z nasienia konia.
- Umożliwienie wykorzystania tych komórek do klonowania osobników o wysokiej wartości genetycznej.
- Zapewnienie, że wyselekcjonowane komórki somatyczne posiadają nienaruszone diploidalne DNA.
Zastosowane metody
- Rozmrażanie słomek z nasieniem konia z ciekłego azotu.
- Wykorzystanie łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrażania.
- Pobieranie próbek i rozcieńczanie rozmrożonego nasienia w suplementowanym medium DMEM-F12.
- Zastosowanie techniki mikroaspiracji w celu izolacji komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja żywotnych komórek somatycznych.
- Ograniczenie zanieczyszczenia plemnikami w procesie.
- Natychmiastowa możliwość wykorzystania wyizolowanych komórek do klonowania.
- Zachowanie integralności diploidalnego DNA w wybranych komórkach.
Wnioski
- Technika mikroaspiracji jest skuteczna w izolacji komórek somatycznych.
- Metoda ta zwiększa potencjał klonowania komórek somatycznych u koniowatych.
- Przyszłe zastosowania mogą doprowadzić do poprawy odzysku genetycznego w hodowli koni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne odzyskiwanie żywotnych komórek somatycznych z krio konserwowanego nasienia koni rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w wykorzystaniu zasobów genetycznych w zaawansowanych technologiach rozrodu. Ta technika mikroaspiracji umożliwia natychmiastowy dostęp do diploidalnych komórek dawcy w celu przeprowadzenia transferu jąder komórek somatycznych (SCNT), co eliminuje potrzebę długotrwałej hodowli i ogranicza zanieczyszczenie plemnikami. Podejście to zwiększa potencjał ratowania zasobów genetycznych i dywersyfikacji portfolio w procesach biotechnologii zwierząt.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę żywotności i diploidalności komórek somatycznych z próbek kriokonserwowanych.
- Wspiera walidację funkcjonalną przydatności dawców jąder komórkowych w procesach SCNT.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie morfologicznej selekcji komórek dawców.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia szybką, powtarzalną metodę izolacji komórek somatycznych bez zakłóceń spowodowanych obecnością plemników.
- Dostarcza zestandaryzowane populacje komórek do późniejszych testów klonowania bez konieczności zakładania kultur pierwotnych.
- Umożliwia ilościową ocenę wydajności i morfologii komórek w celu optymalizacji procesu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Poprawia ciągłość procesu od bankowania zasobów genetycznych po przedkliniczne zastosowania klonowania.
- Wspiera cele translacyjne, umożliwiając odzyskanie cennych genotypów z materiałów archiwalnych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez zapewnienie integralności komórek dawcy przed generowaniem embrionów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda mikroaspiracji integruje interfejs odzyskiwania zasobów genetycznych i klonowania opartego na SCNT, łącząc bankowanie kriokonserwacyjne z bezpośrednim przygotowaniem dawcy jąder komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących żywotności i integralności genetycznej komórek dawców pochodzących ze źródeł kriokonserwowanych.
- Screening: Standaryzuje izolację komórek somatycznych w celu uzyskania powtarzalnego materiału wejściowego do SCNT.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wydajności komórek oraz różnorodności morfologicznej.
- Badania translacyjne: Łączy nasienie przechowywane w biobankach z praktycznymi procesami klonowania w celu ratowania genetycznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia protokół możliwy do ponownego zastosowania dla różnych tło genetycznych oraz próbek archiwalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie przydatności komórek dawcy i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie SCNT.
- Wartość operacyjna: Usprawnia izolację komórek, zwiększa powtarzalność i eliminuje czasochłonne etapy hodowli.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybkie podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektów odzyskiwania genetycznego i optymalizuje alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Rozszerza zakres materiału genetycznego nadającego się do klonowania i strategii hodowlanych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikromanipulacji i oceny morfologii komórek.
- Wymaga dostępu do systemów aspiracji mechanicznej oraz infrastruktury mikroskopowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie procedur selekcji i płukania komórek.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych próbek nasienia, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych gatunków lub warunków przechowywania.
- Żywotność komórek po izolacji może być zróżnicowana i powinna być monitorowana pod kątem gotowości do SCNT.
