Name: Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj technikę mikroaspiracji do izolacji żywych komórek somatycznych z kriokonserwowanego nasienia konia. Ta metoda eliminuje długie hodowle in vitro i zanieczyszczenie plemnikami, umożliwiając natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Laboratorium Zarządzania Reprodukcji, Katedrze Produkcji Rolnej i Zwierzęcej Uniwersytetu Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X) za wsparcie techniczne i logistyczne.

Próbki nasienia z kriokonserwacji, przechowywane przez ponad 19 lat w ciekłym azocie, zostały pozyskane od komercyjnych dystrybutorów zatwierdzonych przez odpowiednie organy weterynaryjne w Meksyku, zgodnie z meksykańskim oficjalnym standardem NOM-027-ZOO-1995, który reguluje proces zoosanitarny pozyskiwania nasienia zwierząt domowych. Wszystkie próbki nasienia, niezależnie od tego, czy były użyte, czy nieodpowiednie do analizy, zostały inaktywowane i zdezinfikowane zgodnie z protokołami instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego oraz obowiązującymi przepisami, w tym NOM-087-ECOL-SSA1-2002 do zarządzania odpadami biologiczno-zakaźnymi w Meksyku. Resztki kwasu fluorowodorowego (HF) były bezpiecznie neutralizowane pod osłoną oparową poprzez powolne przelanie go do plastikowego pojemnika i stopniowe dodawanie małych porcji CaCO3 lub Ca(OH)2, aż emerwacja ustała, tworząc nierozpuszczalny CaF2. pH zneutralizowanej zawiesiny potwierdzono na poziomie od 6 do 8, zanim została ona objęta traktowaniem jako odpadów chemicznych nieorganicznych zgodnie z lokalnymi przepisami. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wytwarzanie igieł mikropipet do izolacji komórek somatycznych
<ol>
	<li>Wybrane kapilary szkła borokrzemowego (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).</li>
	<li>Użyj mikropipety, aby uzyskać drobno końcówki naczyń włosowatych. Dostosuj punkt cięcia, aby zmienić średnicę grotu.</li>
	<li>Włóż kapilarę do wyciągacza i mocno ją zablokuj.</li>
	<li>Po wyciągnięciu ostrożnie zdejmij mikropipetę i umieść ją poziomo na mikrokuźni.</li>
	<li>Ustaw podgrzewacz i mikropipetę w polu widzenia mikroskopu.</li>
	<li>Zlokalizuj punkt cięcia za pomocą siatki celownika okularu (Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Przyłóż końcówkę mikropipety do szklanej kulki (na żarniku grzewczym).</li>
	<li>Stopniowo zwiększ temperaturę, aż końcówka wtopi się w koralik.<ol>
		<li>Wyłącz grzejnik.</li>
		<li>Pozwól, by końcówka przylegała do kulki i się rozdzieliła. UWAGA: Nie jest konieczne zginanie mikropipety; można go używać w formie prostej. Jednak jeśli operator preferuje taką preferencję, można utworzyć kąt (rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nie wygładzaj końcówki, ponieważ ten krok nie jest potrzebny w zabiegu.</li>
	<li>Czyść końcówki pipety, zanurzając każdą końcówkę przez ~10 sekund kolejno w:<ol>
		<li>20% kwasu fluorowodorowego (HF). UWAGA: Kwas fluorowodorowy jest wysoce toksyczny i. Używaj środków ochrony osobistej wskazanych przez dostawcę. Podkreślaj stosowanie ochrony oczu/twarzy, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, a zawsze pracuj w kapturze przeciwspalinowej.</li>
		<li>Sterylna, podwójnie destylowana woda.</li>
		<li>Absolutny etanol. UWAGA: Aby ułatwić mycie końcówki pipety, przygotuj powyższe roztwory w sterylnych tubkach Corning o pojemności 15 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Susz mikropipety w piekarniku w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Przechowuj mikropipety w sterylnym pojemniku.</li>
</ol>
2. Układ mikroaspiracji
<ol>
	<li>Sprawdź, czy system mikroaspiracji działa prawidłowo, a joystick jest umieszczony na środku panelu sterowania.</li>
	<li>W przypadku systemów używających oleju upewnij się, że nie ma w nim pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na precyzję ruchu.</li>
	<li>Włóż mikropipetę aspiracji komórek somatycznych do manipulatora trzymającego po stronie dominującej ręki operatora. UWAGA: Wymień mikropipetę na nową, jeśli czubek zatkał się podczas pobierania komórek somatycznych.</li>
</ol>
3. Rozmrażanie i rozcieńczanie kriopkonserwowanego nasienia końskiego
<ol>
	<li>Wyjmij słomki z ciekłego azotu, wystaw na działanie powietrza przez 10 sekund i rozmraź w 37 °C przez 30 sekund.</li>
	<li>Pierwsze rozcieńczenie nasienia: Pobierz próbkę z rozmrożonego nasienia (250 μL) i rozcieńcz 1,0 mL DMEM/F12 w podłożu, uzupełnionym 10% surowicą płodową, 0,1 mg/mL surowicą bydłą, 12,5 μM β-merkaptoetanolu oraz 1% antymikotycznym.<ol>
		<li>Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugie rozcieńczenie nasienia: Pobierz 25 μL z pierwszego rozcieńczenia, rozcieńcz je w 975 μL 1x DPBS z dodatkiem 0,1 mg/mL poli(alkohol winylowy) (PVA) lub poliwinylpirolidonu (PVP), umieść w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i delikatnie wymieszaj.<ol>
		<li>Utrzymuj tę mieszankę w temperaturze 37 °C przez cały proces pobierania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowywanie dań do kolekcji SC
<ol>
	<li>Zbieraj SC za pomocą dwóch pokrywek z naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Przygotuj pierwszą pokrywkę w następujący sposób (pokrywka #1, rysunek 2A).<ol>
		<li>Pobierz 100 μL drugiego rozcieńczenia nasienia i umieść je w środku pokrywki (patrz Rysunek 2A).</li>
		<li>Wykonaj drugą mikrokroplę (10 μL) 1x DPBS uzupełnioną 0,1 mg/mL PVA lub PVP na wierzch pierwszej kropli (patrz Rysunek 2A).</li>
		<li>Obie mikrokrople całkowicie pokryj olejem parafinowym, aby zapobiec parowaniu i utrzymać stabilność temperatury podczas aspiracji SC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj drugą pokrywkę, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe i towarzyszące plemniki (pokrywka #2, rysunek 2B).<ol>
		<li>Umieść trzy krople po 30-50 μL 1x DPBS z 0,1 mg/mL PVA lub PVP na środek pokrywki; Nie pokrywaj ich olejem mineralnym. UWAGA: Przygotuj tę miskę hodowlę dopiero po wybraniu wszystkich komórek somatycznych, aby zapobiec zmianom właściwości fizykochemicznych roztworu DPBS spowodowanym ekspozycją na powietrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszystkie etapy mikroaspiracji wykonuj pod mikroskopem odwróconym w temperaturze pokojowej. Unikaj nagłych zmian temperatury.</li>
</ol>
5. Procedura mikroaspiracji izolującej SC z kriokonserwowanego nasienia koni
<ol>
	<li>Umieść pierwszą pokrywkę (wieko #1, rysunek 2A) na scenie mikroskopu, gotową do zbierania SC.</li>
	<li>Wybierz mikropipetę o odpowiedniej średnicy, aby zebrać SC i podłączyć ją do mechanicznego systemu aspiracji.</li>
	<li>Ostrożnie włóż mikropipetę do mikrokropli i wyrównuj ją z dnem pokrywki naczynia. Gdy pipeta osiągnie aspirujące medium hodowlane, rozpocznij indywidualne wychwytywanie SC.</li>
	<li>Na dole talerza powinny być widoczne różne morfologie komórek (Rysunek 3).</li>
	<li>Umieść końcówkę mikropipety obok każdego SC i zasysaj je pod podciśnieniem. Aspiruj komórki okrągłe i wydłużone, niezależnie od ich rozmiaru. Objętość aspiracji różni się w zależności od przechwytu SC.</li>
	<li>Po przechwyceniu 10 komórek umieść je w mikrokropli umieszczonej na górze (10μL) (Rysunek 2A). Powtarzaj ten krok, aż uzyskasz wymaganą liczbę SC do eksperymentu klonowania.</li>
	<li>Trzymaj wszystkie przechwycone komórki somatyczne w tym mikrokroplu przez cały proces pobierania.</li>
	<li>Po uzyskaniu wymaganej liczby SC do klonowania wykonaj prostą procedurę mycia za pomocą mikrokropli do usunięcia towarzyszących plemników, zanieczyszczenia komórkowych i zanieczyszczeń mikroorganizmów.</li>
	<li>Weź drugą pokrywkę naczynia i wykonaj kolejne, trzystopniowe mycie SC (pokrywka #2, rysunek 2B):<ol>
		<li>Uchwyć komórki somatyczne mikropipetą i ostrożnie nałożyć je na powierzchnię pierwszej kropli. Pozwól im zadowolić się 3-5 minutami (Rysunek 2B; Drop #1).</li>
		<li>Powtórz krok 5.9.1 i włóż je do drugiej kropli (Rysunek 2B; Drop #2).</li>
		<li>Powtórz krok 5.9.1 i umieść komórki somatyczne w trzeciej kropli (Rysunek 2B; Drop #3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jako ostatni krok, złóż izolowane komórki somatyczne do ostatniej mikrokropli przygotowanej do dalszego wykorzystania w procedurach transferu jądra komórek somatycznych (Rysunek 4D). UWAGA: Aspiruj SC w możliwie najmniejszej średniej objętości podczas każdego ponownego wychwytu, aby zminimalizować plemniki, zanieczyszczenia i zanieczyszczenia mikrobiologiczne.</li>
</ol>

<ol><li>Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+potential+of+cultured+skin+fibroblast%2C+cumulus%2C+and+granulosa+cell+to+produce+somatic+cell+nuclear+transfer+%28SCNT%29+preimplantation+embryos+in+buffaloes+%28Bubalus+bubalis%29+in+relation+to+gene+expressions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).</li>
<li>Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+leukocytes+contain+all+the+genetic+information+necessary+for+the+development+of+a+new+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning%22%5BJournal%5D)">Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual.</a> Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).</li>
<li>Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+births+from+urine+derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live births from urine derived cells.</a> PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).</li>
<li>Vignon, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+of+bovine+embryos+reconstructed+from+enucleated+matured+oocytes+fused+with+cultured+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+III%22%5BJournal%5D)">Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells.</a> C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).</li>
<li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterisation+of+somatic+cells+derived+from+semen+and+milk+of+endangered+sheep+and+eland+antelope%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope.</a> Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).</li>
<li>Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+culture+of+somatic+cells+from+avian+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen.</a> Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).</li>
<li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+embryos+from+semen.+Part+1%3A+in+vitro+proliferation+of+epithelial+cells+on+embryonic+fibroblasts+after+isolation+from+semen+by+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation.</a> Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture+systems+for+attachment+and+proliferation+of+epithelial+cells+cultured+from+ovine+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen.</a> Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+production+and+possible+species+preservation+by+nuclear+transfer+of+somatic+cells+isolated+from+bovine+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen.</a> Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+epithelial+cells+from+stored+buffalo+semen+and+their+use+for+the+production+of+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos.</a> Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).</li>
<li>Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+somatic+cells+isolated+from+frozen-thawed+equine+semen+using+fluorescence-assisted+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting.</a> Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).</li>
<li>Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+somatic+cell+populations+in+cryopreserved+equine+semen+as+a+source+of+donor+nuclei+for+somatic+cloning%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results.</a> Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).</li>
<li>Moulavi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+in+Asiatic+cheetah+using+nuclei+derived+from+post-mortem+frozen+tissue+in+absence+of+cryo-protectant+and+in+vitro+matured+domestic+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes.</a> Theriogenology. 90, 197-203 (2017).</li>
<li>Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+mouse+offspring+from+zygotes+fertilized+with+freeze-dried+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids.</a> Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).</li>
<li>Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+cloned+offspring+derived+from+freeze-dried+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).</li>
<li>Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+non-living+cells%3A+Trash+or+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genome of non-living cells: Trash or recycle.</a> Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).</li>
<li>Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWakayama%2C+S+%22Encyclopedia+of+Life+Sciences%22">Encyclopedia of Life Sciences</a>. , 1-10 (2023).</li>
<li>Lanza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+cell+life-span+and+telomere+length+in+animals+cloned+from+senescent+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells.</a> Science. 288, 665-669 (2000).</li>
<li>González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micropipette+aspiration%3A+applications+in+cell+biomechanics%2C+models%2C+and+extended+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies.</a> Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Vajta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+healthy+calf+by+somatic+cell+nuclear+transfer+without+micromanipulators+and+carbon+dioxide+incubators+using+the+handmade+cloning+%28HMC%29+and+the+submarine+incubation+system+%28SIS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS).</a> Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).</li>
<li>Alteri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+embryo+assisted+hatching+approaches%3A+A+systematic+review+of+the+current+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols.</a> J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).</li>
<li>Briski, O., Salamone, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present+and+future+of+ICSI+in+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Past, present and future of ICSI in livestock species.</a> Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).</li>
<li>Wall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pronuclear microinjection.</a> Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).</li>
<li>Selokar, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hope+for+restoration+of+dead+valuable+bulls+through+cloning+using+donor+somatic+cells+isolated+from+cryopreserved+semen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen.</a> PLoS One. 9 (3), e90755(2014).</li>
<li>Selokar, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffalo+%28Bubalus+bubalis%29+SCNT+embryos+produced+from+somatic+cells+isolated+from+frozen-thawed+semen%3A+Effect+of+trichostatin+A+on+the+in+vitro+and+in+vivo+developmental+potential%2C+quality+and+epigenetic+status%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status.</a> Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).</li>
<li>Guevorkian, K., Maître, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+exploring+cell+and+tissue+mechanics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo.</a> Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).</li>
<li>Duah, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hand-made+cloned+buffalo+%28Bubalus+bubalis%29+embryos+from+nonviable+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).</li>
<li>Loi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+nonviable+ovine+somatic+cells+develop+into+lambs+after+nuclear+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation.</a> Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).</li>
<li>Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+bovine+embryos+reconstructed+by+the+transfer+of+somatic+cells+derived+from+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues.</a> J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).</li>
<li>Podico, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-layer+colloid+centrifugation+as+a+method+to+process+urine-contaminated+stallion+semen+after+freezing-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Equine+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing.</a> J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).</li>
<li>Zhang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+porcine+urine-derived+cells+as+nuclei+donor+for+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer.</a> J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).</li>
<li>Mizutani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cloned+mice+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cell+lines+from+urine-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells.</a> Sci Rep. 6, 23808(2016).</li>
<li>Long, S., Kenworthy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+cells+in+diagnostic+semen+analysis%3A+a+guide+for+laboratories+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians.</a> Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).</li>
<li>Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%27round+cells%27+in+semen+analysis%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study.</a> Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).</li>
<li>Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubble+cells%3A+Renal+tubular+cells+in+the+urinary+sediment+with+characteristics+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability.</a> J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).</li>
<li>Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Potentials and pitfalls.</a> Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).</li>
<li>Håård, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frozen+stallion+semen+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Use of frozen stallion semen in Europe.</a> Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).</li>
<li>Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+insemination+of+mares+with+fresh+and+frozen+stallion+semen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil+Suppl%22%5BJournal%5D)">Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen.</a> J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).</li>
<li>Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+emerging+technologies+to+the+study+and+conservation+of+threatened+and+endangered+species%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).</li>
<li>Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+cryopreservation+in+endangered+felids%3A+developing+linkage+of+in+situ-ex+situ+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Reprod+Fertil+Suppl%22%5BJournal%5D)">Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations.</a> Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).</li>
<li>Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%3A+Advancements+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Mikromanipulacja komórkami i gametami umożliwiła uproszczenie złożonych technik wspomaganego rozrodu. Przykładami takich przykładów są klonowanie somatyczne metodą Ręcznego Klonowania21, wspomagane wyklucie22, intracytoplazmatyczne wstrzykiwanie plemników (ICSI)23 oraz mikroiniekcje pronuklearne u zygot24, między innymi.
Opracowanie skutecznych metod izolowania komórek somatycznych od nasienia jest ...

Klonowanie komórkowe z transferem jądra komórkowego jest nieocenionym narzędziem do ratowania i rozmnażania osobników o zootechnice i naukowym znaczeniu. Wiele linii komórkowych zostało wykorzystanych jako dawcy jądrowe, w tym komórki pochodzące ze skóry, mięśni, ziarnisków, limfocytów oraz komórek moczu 1,2,3,4. Co ciekawe, nasienie pojawiło się jako nowatorska alternatywa do zbierania komórek somatycznych (SC), które mogą być wykorzystywane jako dawcy jądrowe do klonowania 5,6. To odkrycie jest szczególnie ważne dla ratowania osób, dla których zachowano wyłącznie nasienie. Jednak ustanowienie pierwotnych hodowli z SC wyizolowanych ze zamrożonego nasienia okazało się nieskuteczne i do dziś pozostaje główną przeszkodą w pozyskiwaniu sklonowanych zwierząt z tego źródła 7,8,9. Komórki te prawdopodobnie pochodzą z nabłonka gruczołowego i wyściełki kanalików, z wydzielin nasiennych oraz – co ważne – z zanieczyszczenia nasienia moczem, które jest dobrze znanym źródłem komórek somatycznych o wysokim potencjale proliferacyjnym i niezróżnicowanym3.
Zastosowano różne metody izolowania SC od nasienia, w tym wirowanie5, gradienty osmotyczne 7,8,10 oraz cytometria przepływowa11. Jednak komórki somatyczne, po wyizolowaniu tymi metodami, nadal wymagają optymalnych warunków do przyczepienia, wzrostu i proliferacji8. Specyficzne wymagania tych komórek czynią hodowlę in vitro bardziej skomplikowaną, ponieważ do ustanowienia pierwotnych hodowli komórek potrzebne są długie okresy inkubacji9. Ponadto wysokie stężenie plemników obecnych w próbkach zakłóca zarówno inicjację, jak i utrzymanie tych hodowli5.
W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, ta technika mikroaspiracji oferuje kilka wyraźnych zalet. Pozwala na selekcję SC na podstawie rozmiaru i morfologii12 oraz umożliwia odzyskiwanie jąder zarówno z komórek żywotnych, jak i nieżywotnych, co jest skutecznie zademonstrowane na zamrożonej tkance bez krioprotektantów13 oraz liofilizowanych komórkach rozrodczych 14,15,16. Co ważne, SC mogą być stosowane bezpośrednio po rozmrażaniu nasienia, co zmniejsza ryzyko błędów ploidialnych typowych związanych z długotrwałą hodowlą in vitro pierwotnych komórek somatycznych stosowanych do klonowania zwierząt17,18. Technika koncentruje się konkretnie na krioprezerwacji nasienia końskiego, co pozwala natychmiast pobrać odpowiednią liczbę SC dla SCNT12.
Wytwarzanie mikropipet oraz rozwój technik mikroaspiracji znacznie się rozwinęły w ostatnich dekadach. Wykorzystanie tych narzędzi umożliwia precyzyjną manipulację gametami, embrionami i ich cytostrukturami, tworząc nowe możliwości w dziedzinie biotechnologii rozrodczej (https://www.jove.com). Techniki mikromanipulacji umożliwiają ocenę właściwości mechanicznych komórek i dostarczają cennych informacjio ich stanie fizjologicznym, jednak ta dziedzina pozostaje stosunkowo niezbadana.
Do tej pory żadne badania nie wykazały skutecznej metody izolowania SC od nasienia przy użyciu jakiejkolwiek odmiany procedur mikromanipulacji. Biorąc pod uwagę ograniczenia konwencjonalnych metod izolacji, niniejsze badanie proponuje praktyczny protokół oparty na mikroaspiracji, który izoluje SC z krioprezerwacji nasienia końskiego, umożliwiając ich natychmiastowe zastosowanie w somatycznych procedurach klonowania po pobraniu.

<table><tbody><tr><td>2 beta Merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M7522</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>GIBCO</td><td>REF-21600010</td><td>Manipulacja komórkami somatycznymi</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>HYCEL</td><td>EL CRISOL 50181-1L73</td><td>Do produkcji pipetek</td></tr><tr><td>Antybiotykowo-antymikotyczny 100x</td><td>INVITRO SA. M&eacute; xico</td><td></td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>Naczynia włosowate borokrzemkowe (1,0 mm O.D. & razy; 0,78 mm I.D. & razy; 100 mm długości)</td><td>APARAT HARVARDU, USA</td><td>EC1-30-0035</td><td>Do produkcji pipetek</td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A3311</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>REF-12500-062</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>Próbka kriokonserwowanego nasienia konia</td><td></td><td></td><td>Próbki nasienia z kriokonserwacji zostały pozyskane od komercyjnego dystrybutora i były przechowywane przez ponad 19 lat w ciekłym azocie. Wszystkie mrożone próbki nasienia koni zostały pobrane od komercyjnych dystrybutorów zatwierdzonych przez odpowiednie organy weterynaryjne w Meksyku, zgodnie z Meksykańskim Oficjalnym Standardem NOM-027-ZOO-1995, Zoosanitarny proces nasienia zwierząt domowych.</td></tr><tr><td>Celownik okularu</td><td></td><td>Narzędzie do wytwarzania pipetek</td><td>Wymagany sprzęt</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>GIBCO</td><td>REF-26140-079</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>Kwas fluoryczny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339261</td><td>Do produkcji pipetek</td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny odwrócony</td><td>Zaćmienie, TE 200</td><td>NIKON</td><td>Mikromanipulacja komórkami somatycznymi</td></tr><tr><td>Laboratory&nbsp; Suchy piekarnik</td><td></td><td>Narzędzie do wytwarzania pipetek</td><td>Wymagany sprzęt</td></tr><tr><td>Microforge</td><td></td><td>Narzędzie do wytwarzania pipetek</td><td>Wymagany sprzęt</td></tr><tr><td>Zestaw mikromanipulatorów dla mikroskopu odwróconego</td><td></td><td>Mikromanipulacja komórkami</td><td>Wymagany sprzęt</td></tr><tr><td>Mikropipeta wyciągacz</td><td>P-97, SUTTER INSTRUMENT</td><td>Narzędzie do wytwarzania pipetek</td><td>Użyj następujących ustawień/mdash; Ciepło: 720; Przyciąganie: 30; Prędkość: 50; Czas: 220; Ciśnienie</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>Manipulacja komórkami somatycznymi</td></tr><tr><td>Nunclon&nbsp; naczynia hodowli komórkowych, średnica i czas; H 35 mm i razy; 10 mm</td><td>NUNKLON</td><td>Nunc 153066</td><td></td></tr><tr><td>PVA</td><td>SIGMA</td><td>P8136</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>PVP</td><td>SIGMA</td><td>P5288</td><td>Hodowla komórek somatycznych</td></tr><tr><td>Roztwór trypanu niebieskiego 0,4%</td><td>GIBCO</td><td>REF- 15250061</td><td>Barwnik komórkowy</td></tr></tbody></table>

prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

A Simple Microaspiration Technique for Isolating Somatic Cells from Cryopreserved Equine Semen as Nuclear Donors for Cloning

Nasienie to złożony płyn, który oprócz plemników zawiera także inne populacje komórek, w tym komórki odpornościowe, niedojrzałe męskie komórki rozrodcze, komórki nabłonkowe oraz fibroblasty. Te komórki mają stan diploidalny, co czyni je odpowiednimi kandydatami na dawcę jądra do klonowania komórkowego transferu jądra komórkowego (SCNT). Wykazano, że generowanie żywotnych zarodków i potomstwa jest wykorzystywane przy użyciu tych komórek. Skuteczne metody izolowania ich od nasienia obejmują wirowanie i techniki gradientu osmotycznego; jednak do ustanowienia pierwotnych hodowli z tych izolowanych komórek konieczne są długotrwałe okresy hodowli in vitro . Ponadto pobrane próbki zawierały dużą ilość plemników, co utrudnia powstawanie i utrzymanie hodowli in vitro . Do tej pory pierwotne hodowle zostały udane tylko ze świeżych próbek nasienia, podczas gdy próby z wykorzystaniem kriokonserwowanego nasienia konsekwentnie kończyły się niepowodzeniem. To ograniczenie znacząco ogranicza potencjał do generowania klonów z krioprezerwacji próbek nasienia. Niniejsze badanie proponuje prostą metodę opartą na mikroaspiracjach do izolowania komórek somatycznych z kriokonserwowanego nasienia końskiego. Takie podejście pozwala na szybkie pobranie wystarczającej liczby komórek do natychmiastowego zastosowania w procedurach klonowania SCNT.

Tabela 1 pokazuje, że technika mikroaspiracji skutecznie odzyskuje komórki somatyczne z krioprezerwacji nasienia końskiego, z tempem wychwytywania od 317,7 ± 9,60 do 424,7 ± 33,65 komórek/godzinę u trzech ogierów. Ogier #03 miał najwyższą wydajność, co potwierdza skuteczność metody nawet przy długotrwałym przechowywaniu próbek. Dane wskazują, że technika konsekwentnie i skutecznie izoluje komórki somatyczne od nasienia, a średnie tempo wychwytywania i odchylenia standardo...

Protokół ten przedstawia prostą technikę mikroaspiracji izolującą żywotne komórki somatyczne (SC) z krioprezerwacji nasienia koń. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, ta technika unika długotrwałych hodowli in vitro i pozwala na natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu komórek somatycznych.

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

Semen is a complex fluid that, in addition to spermatozoa, contains other cell populations, including immune cells, immature male germ cells, epithelial ...

Naszym celem jest wykazanie, że komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia mogą być przydatne do odzyskiwania osobników o wysokiej wartości genetycznej. Naszym obecnym wyzwaniem jest możliwość wyboru komórek somatycznych z nienaruszonym diploidalnym DNA, które zostaną użyte jako dawca jądra. Na początek usuń słomki z nasieniem końskich z zbiornika z ciekłym azotem.Wystawiaj je na działanie powietrza na 10 sekund i rozmrażaj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Weź próbkę 250-mikrolitrowego rozmrożonego nasienia. Rozcieńcz go jednym mililitrem suplementowanego medium DMEM-F12.Inkubuj mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pipetą wydziel 25 mikrolitrów z inkubowanego rozcieńczenia do rurki i rozcieńcz je w 975 mikrolitrach DPBS uzupełnionym o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr poliwinylowym alkoholem lub poliwinylowym pirolidonem. Delikatnie wymieszaj zawieszenie.Utrzymuj rozcieńczoną mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały proces pobierania komórek. Umieść pokrywkę z rozcieńczonym nasieniem końskiego na podłodze mikroskopu, aby przygotować się do pobierania komórek somatycznych. Wybierz mikropipetę o odpowiedniej średnicy do zbierania komórek somatycznych i podłącz ją do mechanicznego systemu aspiracji.Ostrożnie włóż mikropipetę do mikrokropli i wyrównaj ją z podstawą pokrywki naczynia. Gdy pipeta zasysa pożywkę hodowlową, rozpocznij indywidualne wychwytywanie komórek somatycznych. Skup się na dole mikrokroplu, gdzie widoczne są różne morfologie komórek.Umieść końcówkę mikropipety obok każdej komórki somatycznej i aspiruj pod ciśnieniem ujemnym. Zbieraj komórki okrążone i wydłużone, niezależnie od rozmiaru. Po zebraniu 10 komórek umieść je w mikrokropli o pojemności 10 mikrolitrów umieszczonej na górnej powierzchni pokrywki naczynia.Zachowaj wszystkie zebrane komórki somatyczne w tej mikrokropli przez cały proces pobierania. Po zebraniu pożądanej liczby komórek somatycznych wykonaj prosty zabieg mycia z użyciem mikrokropli do usunięcia plemników, zanieczyszczeń i zanieczyszczeń drobnoustrojów. Używając drugiej pokrywki naczynia, wykonaj sekwencyjne, trzystopniowe mycie komórek somatycznych.Użyj mikropipety, aby przenieść komórki somatyczne do pierwszej kropli i pozwól im się osiedlić przez trzy do pięciu minut. Przenieś komórki z pierwszej kropli do drugiej według tej samej procedury. Powtórz transfer jeszcze raz i umieść komórki somatyczne w trzeciej kropli.Na koniec złóż izolowane komórki somatyczne w przygotowanej mikrokropli przeznaczonej do transferu jądra komórek somatycznych. Technika mikroaspiracji skutecznie odzyskała komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia koń, z tempem wychwytywania od 317,7 do 424,7 komórek na godzinę u trzech ogierów. Ogier numer 3 wykazuje najwyższy plon.Zidentyfikowano pięć odrębnych typów komórek somatycznych na podstawie rozmiaru i morfologii. Zidentyfikowaliśmy populację komórek somatycznych, które różnią się morfologią i żywotnością w kriokonserwowanym nasieniu końców, które może być przydatne jako dawca jądrowe. Komórki można dobierać na podstawie ich morfologii, a procedura nie wymaga ustanowienia pierwotnej hodowli.Skupimy się na poprawie żywotności tych komórek po nasieniu końskiego nasienia.

a-simple-microaspiration-technique-for-isolating-somatic-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film i protokół mają pomóc nauki transfer jądra.

Transfer jądra do komórki jajowej myszy

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Ten protokół opisuje masaż kloaczny, nieinwazyjną technikę manualną pobierania nasienia od ptaków, oraz ekstrakcję DNA z plemników ptaków za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami.

Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników

Opisujemy znacznie ulepszoną metodę klonowania myszy przy użyciu trichostatyny A, witaminy C i dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej. Pokazujemy uproszczony, powtarzalny protokół, który wspiera efektywny rozwój sklonowanych zarodków. W związku z tym ta metoda może stać się standardową procedurą klonowania myszy.

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.

Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Poznaj technikę mikroaspiracji do izolacji żywych komórek somatycznych z kriokonserwowanego nasienia konia. Ta metoda eliminuje długie hodowle in vitro i zanieczyszczenie plemnikami, umożliwiając natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu.

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania (Wideo) | JoVE Journal

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

Przeglądaj więcej filmów