Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

Naszym celem jest wykazanie, że komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia mogą być przydatne do odzyskiwania osobników o wysokiej wartości genetycznej. Naszym obecnym wyzwaniem jest możliwość wyboru komórek somatycznych z nienaruszonym diploidalnym DNA, które zostaną użyte jako dawca jądra. Na początek usuń słomki z nasieniem końskich z zbiornika z ciekłym azotem.

Wystawiaj je na działanie powietrza na 10 sekund i rozmrażaj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Weź próbkę 250-mikrolitrowego rozmrożonego nasienia. Rozcieńcz go jednym mililitrem suplementowanego medium DMEM-F12.

Inkubuj mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pipetą wydziel 25 mikrolitrów z inkubowanego rozcieńczenia do rurki i rozcieńcz je w 975 mikrolitrach DPBS uzupełnionym o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr poliwinylowym alkoholem lub poliwinylowym pirolidonem. Delikatnie wymieszaj zawieszenie.

Utrzymuj rozcieńczoną mieszankę nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały proces pobierania komórek. Umieść pokrywkę z rozcieńczonym nasieniem końskiego na podłodze mikroskopu, aby przygotować się do pobierania komórek somatycznych. Wybierz mikropipetę o odpowiedniej średnicy do zbierania komórek somatycznych i podłącz ją do mechanicznego systemu aspiracji.

Ostrożnie włóż mikropipetę do mikrokropli i wyrównaj ją z podstawą pokrywki naczynia. Gdy pipeta zasysa pożywkę hodowlową, rozpocznij indywidualne wychwytywanie komórek somatycznych. Skup się na dole mikrokroplu, gdzie widoczne są różne morfologie komórek.

Umieść końcówkę mikropipety obok każdej komórki somatycznej i aspiruj pod ciśnieniem ujemnym. Zbieraj komórki okrążone i wydłużone, niezależnie od rozmiaru. Po zebraniu 10 komórek umieść je w mikrokropli o pojemności 10 mikrolitrów umieszczonej na górnej powierzchni pokrywki naczynia.

Zachowaj wszystkie zebrane komórki somatyczne w tej mikrokropli przez cały proces pobierania. Po zebraniu pożądanej liczby komórek somatycznych wykonaj prosty zabieg mycia z użyciem mikrokropli do usunięcia plemników, zanieczyszczeń i zanieczyszczeń drobnoustrojów. Używając drugiej pokrywki naczynia, wykonaj sekwencyjne, trzystopniowe mycie komórek somatycznych.

Użyj mikropipety, aby przenieść komórki somatyczne do pierwszej kropli i pozwól im się osiedlić przez trzy do pięciu minut. Przenieś komórki z pierwszej kropli do drugiej według tej samej procedury. Powtórz transfer jeszcze raz i umieść komórki somatyczne w trzeciej kropli.

Na koniec złóż izolowane komórki somatyczne w przygotowanej mikrokropli przeznaczonej do transferu jądra komórek somatycznych. Technika mikroaspiracji skutecznie odzyskała komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia koń, z tempem wychwytywania od 317,7 do 424,7 komórek na godzinę u trzech ogierów. Ogier numer 3 wykazuje najwyższy plon.

Zidentyfikowano pięć odrębnych typów komórek somatycznych na podstawie rozmiaru i morfologii. Zidentyfikowaliśmy populację komórek somatycznych, które różnią się morfologią i żywotnością w kriokonserwowanym nasieniu końców, które może być przydatne jako dawca jądrowe. Komórki można dobierać na podstawie ich morfologii, a procedura nie wymaga ustanowienia pierwotnej hodowli.

Skupimy się na poprawie żywotności tych komórek po nasieniu końskiego nasienia.